ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

この手順では、エレクトロスピンPCLスキャフォールドをさまざまな方法でセットアップし、最適な細胞播種セットアップを決定します。まず、無菌足場を、細胞培養インサート、トラフ、バイオリアクター回転容器など、調査対象のさまざまなセットアップに配置します。所定の位置に設置されると、既知の数の細胞が足場に播種され、20分間邪魔されずに放置されます。

その後、すべてのサンプルを慎重にインキュベーターに移し、5%の二酸化炭素と摂氏37度を設定し、数時間前に静的または動的条件にさらします。この培養時間の後、足場に付着した細胞の数をDNAアッセイによって決定し、足場培地およびウェル画分中の細胞の量を定量化します。最終的に、これは、足場、ウェル、および周囲の培地に存在するDNAを定量化して、走査型電子顕微鏡またはSEMが使用される足場への細胞の付着を見ることによって達成されます。

この調査のアイデアを最初に思いついたのは、足場がウェルプレートの基部全体を覆っていないこと、つまり、すべての細胞が足場と接触しているわけではないため、付着できるわけではない可能性があることを知ったときでした。まず、無菌の6ウェル細胞培養インサートを開き、歯のある短いリングを幅の広いリング体から分離することにより、細胞培養インサートをラミナフロー下でセットアップします。次に、歯が上を向くようにリングを取り、4センチの足場の1つをリングの中央に掛け、両側が重なることを確認します。

リング状のボディを手に取り、歯のリングと足場の上に置きます。次に、足場が所定の位置に留まり、細胞培養の中心にあることを確認しながら、下向きに押します。挿入する。スキャフォールド付き細胞培養インサートを6ウェル低結合プレートのウェルに入れ、10ミリリットルの培地をスキャフォールドに加えます。

次に、ポリテトラフルオロエチレントラフを個々のペトリ皿に入れ、トラフに10ミリリットルの培地を追加します。鉗子を使用して、3センチメートルの足場の1つをトラフにドレープし、その長さがトラフの長い方の端と平行になるようにします。バイオリアクター容器をラミナフロー下で設置するには、バイオリアクター容器のメインポートから10ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはPBSを分注します。

10分後、PBSを取り外し、鉗子を使用して8ミリリットルの培養培地と交換します。3センチメートルの足場の1つをメインポートを介して船に挿入します。次に、メインポートからポーズをとります。

テキストプロトコルに記載されているようにヒト間葉系幹細胞のカウントを行った後、細胞ペレットを出る遠心チューブから培地を吸引し、計算された培地容量と交換します。Resusは、細胞と培地を懸濁して均一に混合します。P 200 Gilsonピペットを使用して、ピペットの先端を足場の長さに沿って、培地の液体表面の下に走らせることにより、200マイクロリットルの細胞懸濁液を各足場にゆっくりと分注します。

20分間そのままにしておくか、バイオリアクター容器に200マイクロリットルの細胞懸濁液をメインポートから分注します。残りの2ミリリットルの培地をシリンジポートで補充して、合計10ミリリットルにします。次に、バイオリアクター容器を回転式容器バイオリアクターに移し、回転するように設定します。

9 RPMで、細胞培養インサートとトラフを備えたウェルプレートをシェーカープレートに移し、摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターまたは静止培養物で30 RPMで回転するように設定します。細胞培養インサートとトラフを備えたウェルプレートを細胞培養インキュベーターの棚に移します。摂氏37度と二酸化炭素5%に設定します。

4時間後、インキュベーターからサンプルを取り出し、ラミナフローの下に置きます。次に、すべてのサンプルから培地画分を取り出し、別々にラベル付けした遠心分離チューブに入れます。Gを241倍にして5分間遠心分離した後、3ミリリットルの溶解緩衝渦を添加する前に仰臥位を取り出し、細胞培養インサート内に保持されている足場を細胞ペレットを分裂させる溶液まず、足場を用いてインサート端部に近い足場を切断して足場を解放する。

次に、鉗子を使用して足場を取り外し、3ミリリットルの溶解緩衝液が入った遠心分離チューブに入れます。次に、各足場レセプタクルに3ミリリットルの溶解バッファーを追加し、表面をこすり落とします。溶解バッファーを取り出し、別にラベル付けした遠心チューブに入れます。

各遠心チューブを約1分間ボルテックスして、十分な攪拌を確保し、細胞膜の溶解を促進します。黒色の96ウェルプレートに、各サンプル画分足場培地に100マイクロリットルの溶解緩衝液を加え、その後、暗所で溶解緩衝液を含むすべてのウェルに100マイクロリットルの細胞DNA溶液を加えて混合します。DNAを含まない溶解バッファーと細胞DNA溶液を含むウェルを穏やかに含ませて、ウェルプレートのネガティブコントロールとポジティブコントロールを提供します。

蛍光プレートリーダーを使用して、485ナノメートルの励起と520ナノメートルの発光でウェルの吸光度を測定します。データを、SEM固定を実行するための製造元の指示に従ってDNA標準から生成された標準曲線と比較します。4時間のインキュベーション後、すべての足場をレセプタクルから取り外し、新しい6ウェルプレートとラミナフローの別々のウェル内に配置します。

次に、足場をそれぞれにPBSで2回洗います。よくPBSで1.5%グルタルアルデヒドの2ミリリットルを追加して、足場での完全なカバレッジを確保します。セル固定のために、プレートを摂氏4度で最低30分間放置します。

固定液を取り出し、足場をPBSで2回洗浄します。次に、足場を新しいウェルプレートに移し、蒸留水中のエタノール濃度を上げて脱水します(50%のエタノールから始めて、次に70%、次に各濃度で90%)。足場を溶液に完全に浸し、3分間放置してから溶液を捨てて繰り返します。

100%エタノールで足場を溶液に完全に浸し、5分間放置して脱水したら、溶液を捨てて足場を化学的に乾燥させます。ヒュームキャビネット内でHMDSを使用する。足場をHMDSに浸し、5分間放置してから、一度繰り返した後、HMDSを取り外します。

HMDSを取り外し、足場を乾かします。次に、市販のSEMスタブに足場を取り付けて、SEMコート内で見やすくし、サンプルを金のスポッターコートで2分間表示して、薄く均一なカバレッジを確保します。最後に、サンプルをSEM内に配置し、5キロの電子ボールト電子ビームを使用して細胞に座った足

結果は、調査した各実験セットアップについて、播種後4時間後の細胞の位置を強調しています。この図は、この期間中にすべての播種セットアップが調査された間に足場表面に付着した細胞の割合を示しています。細胞接着の割合は比較的低いですが、細胞培養インサート内に保持され、30 RPMで振とうされたスキャフォールドの細胞接着性が最大になります。

最も接着性が低かったのは、細胞培養インサート内に保持され、静止条件下で保持されたスキャフォールドでした。培地画分内には多数の細胞が存在し、特に細胞培養に顕著でした。トラフ内に保持された低結合プレートに50%の低結合プレート内に保持されたインサートと51%の回転容器トラフ内に保持された足場は、ホルダー自体内に存在する細胞の数が増加したことを示しました。

トラフシェーカー用に48%、トラフ静的スキャン用に50%。電子顕微鏡法により、細胞播種された足場を視覚的に評価することができました。代表的な画像は、播種設定に関係なく、繊維状表面上の細胞の存在が限られていることを強調していました。

しかし、細胞培養インサート内に保持され、30 RP Mで振とうされた足場には、より多くの細胞と細胞凝集体が存在し、このビデオを見た後、既知の数の細胞を播種することは、特に野生プレートの基部全体を覆わない足場の場合、実際に足場に付着する細胞の数と必ずしも同じではないことをよく理解しているはずです。このようなスキャフォールドでは、スキャフォールドへの初期細胞付着を最大化するために、まず異なるセルシーディングセットアップを最適化することが推奨されます。