の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部
January 20th, 2015
このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。
次の実験の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫NMJにおける内因性タンパク質タンパク質相互作用の細胞内局在を検出することです。これは、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体に結合するPLAプローブと呼ばれる一対のオリゴヌクレオチド標識二次抗体を使用して免疫蛍光染色を行うことによって達成されます。次に、PLAプローブ間のギャップは、2つのコネクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって埋められます。
2つのタンパク質が互いに近接し、in situライゲーション上に閉鎖環状DNA分子が形成された場合にのみ、閉環状DNA分子内の配列を増幅するためにin situローリングサークル増幅が行われ、その後、相補的な蛍光標識付きオリゴヌクレオチドで検出されます。したがって、各増幅産物から生成された蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡を使用して観察すると、明確な明るいスポットとして容易に見ることができます。したがって、この手法がE、2、ハイブリッド、沈殿、脅威などの他の既存の方法と比較した場合の主な利点は、PLAが、互いに近接して局在し、複合体を形成する可能性が高い内因性タンパク質の細胞内局在を組織内で検出できることです。
この方法は、特に幼虫とmjで発生するタンパク質間相互作用ネットワークへの洞察を提供します。また、他のホロシステムにも適用できます。胚と想像円板の上皮組織を提案します。
その手順を実演するのは、私たちの研究室の2人の技術者であるhel yuとHa kingです。ショウジョウバエの培養物を摂氏25度で5〜6日間インキュベートした後、細い鉗子を使用して、バイアルまたはボトルから這う3番目の幼虫を選び、幼虫を洗います。それらをPBSを含む小さなシャーレに移します。
次に、洗った幼虫の1つをSシガーディスクに入れ、氷のように冷たいPBSの数滴に浸してスタントします。幼虫の背側を上にして配置し、2つの気管トラックが解剖顕微鏡で見えるようにします。次に、鉗子を使用してムニューチンピンをつかみ、幼虫をらせんの後端の近くのらせんの近くに固定し、別のピンが口のフックの前端のキューティクルを貫通し、幼虫を縦にゆっくりと伸ばしてからピンで留めます。
次に、マイクロダイセクションを使用して、はさみでピンの近くの後端をつまんで小さな開口部を作り、切開はキューティクルを通過するのに十分な表面性である必要があります。次に、ハサミの下刃の先端を切開部に配置し、下にある筋肉を傷つけないようにハサミの刃を少し上に向けながら、2つの気管路の間の背側正中線の全長に沿って切断します。次に、キューティクルだけで、後方に配置されたピンの少し前方に小さな水平切開を行います。
次に、前方に配置されたピンの少し後方に別の同様の切開を行います。幼虫の体にPBSを数滴強力に追加した後、鉗子を使用して内臓を慎重に清掃します。幼虫の体をつつくと体に損傷を与えるため、避けてください。
壁の筋肉は幼虫の体を開き、角を固定するために、体の壁を水平と垂直の両方に伸ばして、均等に張力のかかった長方形を形成します。組織を固定する過程で体壁の筋肉を引き裂かないように注意してください。ピン留めされた体壁を数滴のボアン溶液に浸し、固定後15分間氷上でインキュベートします。
PBTを使用して、ティッシュを3回すすぎます。次に、試薬を節約し、アッセイ中にすべての体壁が等しく扱われるようにします。各遺伝子型の角を別々に切り取り、区別します。
そして、細かい鉗子でピンを取り外した後、それらをすべて同じシリコン処理された0.65ミリリットルのマイクロ遠心分離管に入れます。組織を透過させるために、PBTを使用して体壁を3回、それぞれ10分間洗浄します。最終洗浄液を取り出した後、1%BSAを添加してサンプルをブロックし、1時間インキュベートします。
免疫染色の隣に、体壁に目的の2つのタンパク質に対するマウスとウサギの一次抗体を添加し、2時間インキュベートします。この場合、1〜10個のマウス抗DLGと1〜250個のウサギ抗HTSを1%BSAで使用します。マーカーに対する抗体は、インキュベーション後にも追加できます。
PBTを使用して、体壁を3回、それぞれ10分間洗います。次に、1%BSA中の任意のマーカーに対するフルオロ4標識二次抗体を添加し、翌朝、暗所で摂氏4度で一晩インキュベートします。PBTを使用して、体壁を3回、それぞれ10分間洗います。
アッセイを少なくとも200マイクロリットルで1〜5希釈で開始します。体壁に1%BSAのPLAプローブ、抗マウスマイナスおよびPLAプローブ抗ウサギプラスの両方の総量は、洗浄緩衝液Aを使用して体壁を5分間それぞれ2回洗浄した後、摂氏37度で2時間インキュベートします。 インキュベーション後、摂氏37度で1時間インキュベートします。洗浄バッファーAを使用して、体壁を2回ずつ2分間洗浄してから、増幅溶液に1〜80希釈のポリメラーゼを加えます。
摂氏37度で2時間インキュベートし、イメージング用のサンプルを調製します。洗浄バッファーBを使用して、体壁を2回、それぞれ10分間洗浄します。次に、100倍希釈した洗浄バッファーBを使用して、1分間の最終洗浄を行います。
細い鉗子を使用して、数滴の取り付け溶液で少なくとも30分間、体壁を平衡化します。体壁をキューティクルの間隔を下げてプラットフォームスライドに慎重に移します。それらを同じ向きに一列に並べて配置し、1滴または2滴の取り付けソリューション内に配置します。
22mm×40mmのカバースリップを調剤の上に置き、気泡が発生しないように注意します。次に、透明なマニキュアを使用してスライドをシールします。共焦点イメージングの準備ができるまで、スライドをマイナス20°Cで保管します。
ここに示されているように、野生型幼虫njsでは、DLGは主にタイプ1のグルタミン酸作動性ブートンのシナプス後膜に見られ、レベルはタイプ1よりもタイプ1のBで顕著であり、HTSは筋肉全体に見られますが、シナプス後膜に集中し、レベルは両方のタイプ1のブートンで等しくなります。 DLGとHTSは、シナプス後領域で大きく重なり合い、DLGとHTSが複合体に存在するかどうかを判断します。N-M-J-P-L-Aでは、ここに見られるように、抗DLG抗体と抗HTS抗体を用いて行いました。2つのタンパク質間のPLAシグナルは、野生型NMJで特異的に観察され、シグナルは主にHRPによってマークされたシナプス前膜に円周方向に局在します。
したがって、DLGとHTSは近接しており、シナプス後領域で複合体を形成している可能性があります。その結果は、欠損しているHTS変異体を含むネガティブコントロールとして特異的です。HTS免疫反応性は観察可能なPLAシグナルを示さない bnsの高倍率ビューは、DLGとHTS免疫反応性がシナプス後膜で大きく重なっていることを示しています。
対照的に、2つのタンパク質間のPLAは、DLGおよびHTSタンパク質全体のサブセットのみが複合体にあることを示す離散PUNCTAをもたらす。この技術は、標準的な免疫組織化学的手順よりも長くはかかりません。このビデオを見れば、幼虫のNMJで発生する内因性タンパク質相互作用の細胞内局在を検出するためにPLAがどのように使用されているかを十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、Proximity Ligation Assayがショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部でタンパク質間相互作用を検出するためにどのように使用できるかを実証します。この技術により、Discs largeやHu-li tai shaoなどのタンパク質複合体を細胞後接合部で可視化することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- タンパク質間相互作用
背景
- Proximity Ligation Assay（PLA）はタンパク質間相互作用を検出する方法です。
- これは、ネイティブな細胞環境下で内因性タンパク質を研究することを可能にします。
- 以前の方法には免疫共沉降が含まれ、空間的局在化を提供しない可能性があります。
- タンパク質複合体の理解は細胞機能を解明する上で重要です。
研究の目的
- タンパク質間相互作用の細胞内局在を検出すること。
- 神経筋接合部でのタンパク質複合体の形成を可視化すること。
- シナプスの組織と機能の理解を深めること。
使用した方法
- オリゴヌクレオチド結合二次抗体を使用した免疫蛍光。
- コネクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるPLAプローブのブリッジング。
- 閉じた環状DNA分子を形成するin situリゲーション。
- コンフォカル顕微鏡を用いた信号検出のためのローリングサークル増幅。
主な結果
- ショウジョウバエNMJでのタンパク質複合体の成功的な検出。
- タンパク質間相互作用に対応する明るい点の可視化。
- タンパク質の空間的局在を明らかにするPLAの能力の証明。
- 他の方法との比較により、組織の文脈におけるPLAの利点が強調されています。
結論
- PLAはin situでタンパク質間相互作用を研究するための効果的な方法です。
- これは、シナプスにおけるタンパク質複合体のダイナミクスに関する洞察を提供します。
- この技術は、タンパク質の局在に関する様々な生物学的問題に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Proximity Ligation Assay (PLA) enables direct visualization of endogenous protein-protein complexes within intact tissue, providing spatially resolved interaction data critical for early discovery and target validation. This capability addresses a key challenge in mechanistic de-risking by distinguishing true in situ interactions from artifacts of lysate-based assays, supporting predictive confidence in synaptic biology and complex tissue systems. PLA's integration into discovery pipelines enhances the reliability of target engagement and pathway mapping, informing portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein interaction networks in native tissue environments.
- Supports functional target validation by confirming spatially restricted complexes.
- Improves predictive confidence for synaptic and membrane-associated targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by resolving subcellular localization of interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening of modulators.
- Delivers quantitative, spatially resolved readouts for assay standardization.
- Enables reproducible detection of protein complexes for compound evaluation.
- Supports platform reuse across diverse tissue and developmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by mapping interactions in intact neuromuscular junctions.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of synaptic targets.
- Enables risk-adjusted advancement by confirming target engagement in situ.
- Supports translational biomarker development when interaction status is disease-linked.
Pipeline & Workflow Integration
PLA fits within the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, bridging the gap between molecular interaction studies and functional tissue analysis.
- Discovery Biology: Confirms protein complex formation and localization, supporting pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates spatially resolved, statistically analyzable data on protein proximity and interaction frequency.
- Translational Research: Enables direct assessment of target engagement in disease-relevant tissue contexts.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple tissue types and developmental stages, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection of protein complexes with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and confocal imaging.
- Needs access to validated antibodies and oligonucleotide-conjugated secondary reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible quantitative analysis.
- Adaptable to various tissue types but may require protocol optimization per system.
- Dependent on antibody specificity and tissue accessibility for reliable results.
