Name: の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ近接リガーションアッセイによるショウジョウバエ幼虫神経筋接合部でのタンパク質複合体の可視化法。この技術はシナプス組織とタンパク質相互作用の動態を解明するのに役立ちます。

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私たちは、ハエの株式を提供するためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝します。我々はまた、抗体を提供するための発達研究ハイブリドーマバンク博士リン·クーリー（エール大学）を感謝。特別な感謝は、原稿上で彼女の助けをAhHyunユに行く。この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会（クリーガー）、ウィリアムとエイダイザベルスチール基金（クリーガー）、およびカナダ衛生研究所（ハーデン）からの補助金によってサポートされていました。

1.ボディウォール準備 NOTE：（体壁の筋肉を神経支配のNMJの研究のための）第三齢幼虫の体壁の調製先にブレントに記載したように行ったら 10、またはラマチャンドラとBudnik 11,12が、いくつかの修正を加えた。 <ol><li>解剖<ol><li>標準的な手順13を使用して五から六日間、25℃でフライ株式や十字架を上げる。 </li><li>細かい鉗子を使用してバイアルまたはボトルから3齢幼虫をクロールピック。 </li><li>任意の食物粒子を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する小さなペトリ皿に幼虫を洗浄する。 </li><li>シルガードディスクに、単一の幼虫を置き、氷冷PBSの数滴でそれを浸す。氷冷したPBSを使用すると、簡単に操作すること幼虫を気絶させるのに役立ちます。解剖を通して、準備は常に乾燥からそれを防ぐために、PBS中に沈められていることを確認してください。 </li><li>ラを配置します2気管路は解剖顕微鏡（ 図2A）の下に表示されるようにその背側を上にしてRVA。鉗子を使用して、minutienピンを把持気門（ 図2B）の近くに後端で幼虫を突き止めるする。別のピンを使用すると、口のフックに近い前方の終わりにキューティクルを貫通。ゆっくりと（ 図2B）、それを突き止めるその後、縦に幼虫を伸ばす。 </li><li>顕微解剖はさみを使って、小さな開口部を作成するために、ピンの近くに後部の端をつまんで。切開はちょうどキューティクルを通過するのに十分表面的でなければならない。 </li><li> 2気管路（ 図2C）との間の背側正中線の全長に沿って切断し、切開部に鋏の底刃の先端を配置する。腹側体壁の筋肉を損傷しないように切断する際に、わずかに上向きにはさみの刃を向け。 </li><li>小さな水平切開を行い、わずかにポストの前方eriorly-置かピン（ 図2C）。別の類似の切開がやや前方に-置かピン（ 図2C）に後方を確認します。切開はちょうどキューティクルを通過する必要があります。 注：似ている必要があります合わせてステップ1.1.7と1.1.8から3切開」 <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px">完成した時」、 すなわち 、幼虫の体の背側の左右のフラップが生成されるべきである。 </li><li>慎重にピンセットで内臓をきれいに。 PBSの少数の力強い滴を追加すると、幼虫の体から臓器を変位ため、それが簡単にそれらを削除することに役立ちます。それは体壁の筋肉の損傷の原因になりますように幼虫の体を突っついは避けてください。 </li><li>オープン幼虫の体を広げると（ 図2D）のコーナーを突き止める。ピン止めするとき、均等に張力をかけ長方形を形成するように水平方向と垂直方向の両方で体壁を伸ばす（それ形状の電子図2G）、その過程で体壁の筋肉を引き裂くないように注意しながら。 </li><li>残りの内臓（ 図2E）を除去完了。 </li></ol></li><li>固定および透過<ol><li>ブアン溶液を数滴に固定体の壁を浸し。氷上で15分間インキュベートする。あるいは、代替固定液として4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用。 30分間インキュベートする。 </li><li>トリトンとのリン酸緩衝生理食塩水（PBT）で3回洗浄します。 </li><li>細かい鉗子を使用して、慎重にピンを取り外し、シリコン処理0.65ミリリットルマイクロ遠心チューブに彼らのコーナーによって身体の壁を転送する。 </li><li> PLAの準備が整うまで4℃でPBTの体壁を保管してください。最適な結果を得るために、一日または解剖の2以内に身体壁を免疫染色始める。 注：試薬上のアイコンをクリックすると、すべての体壁がアッセイ中に平等に扱われることを保証するために、異なる遺伝子型は、単一の中に入れることができるチューブ。遺伝子型（例については、図2Fを参照）異なっ体壁の角を切断することによって区別することができる。 </li></ol></li></ol> 2.免疫組織化学注：三齢幼虫の体壁の免疫染色は、以前にブレントら 14とラマチャンドランとBudnik 11に記載のように行ったが、いくつかの変更11,14とした。 注：特に明記しない限り、室温で、穏やかに攪拌しながら、すべての手順を実行します。 <ol><li>阻止<ol><li> 10分間ずつPBTで三回体の壁を洗ってください。 </li><li> 1時間、1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。 </li></ol></li><li>免疫染色<ol><li>目的の2つのタンパク質に対するマウスおよびウサギ一次抗体と体壁をインキュベートし、室温で2時間、または4℃で一晩のために（1％BSAで希釈）。 250ウサギaの場合：この場合は、1：10のマウス抗は、Dlgおよび1を使用NTI-HTSM 15,16。マウスまたはウサギで行われていないマーカーに対する抗体も含まれることができる- 例えば 、1を使用：200ヤギ抗HRPニューロン膜を描写する。 </li><li> PBTで10分間ずつ3回洗浄する。 </li><li>室温で2時間、または4℃で一晩のために（1％BSAで希釈）のマーカーを検出するためのフルオロフォア結合二次抗体と共にインキュベートする。ヤギ抗HRP抗体を検出するために、200 FITC結合抗ヤギ： 例えば 1を使用する- PLA信号は後で赤色蛍光体で可視化されるように、別のフルオロフォアは、マーカーを検出するために使用されなければならない。による感光性試薬の使用、以降この点から、暗所で管を保持する。 注：PLAは、共焦点顕微鏡下で赤チャンネル上で可視化信号と、マウスおよびウサギで育った一次抗体との間で実行されるために使用されているキットができます。所望であれば、他のキットは、アッセイがプリマで行うことができるように利用可能であるRY他の種で作製された抗体、および他のチャネル上で可視化シグナル。 </li></ol></li></ol> 3.近接ライゲーションアッセイ注：特に明記しない限り、室温で、穏やかに攪拌しながら、すべての手順を実行します。 <ol><li> PLAプローブ<ol><li> 10分間ずつPBTで三回体の壁を洗ってください。 </li><li> 37℃で2時間：（1％BSAで5希釈の各1）PLAプローブとインキュベートする。この場合、5-10体壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにPLAプローブ抗マウスMINUS40μlの、PLAプローブ抗ウサギPLUS40μlの1％BSAの120μlのを使用する。 PLAプローブ1:25希釈までまだ（この実験のために、すなわち 、）十分な信号対雑音比をもたらすことができる。 </li></ol></li><li>ライゲーション<ol><li> 5分間ずつ二回洗浄バッファーAで体の壁を洗ってください。 </li><li> 1時間aのライゲーション溶液（連結緩衝液中でリガーゼの1：40希釈）でインキュベートT 37℃。この場合は、5〜10体の壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにリガーゼの5μL、5ライゲーション緩衝液40μlの高純度水を155μlのを使用しています。 </li></ol></li><li>増幅<ol><li> 2分間ずつ二回洗浄バッファーAで体の壁を洗ってください。 </li><li> 37℃で2時間、増幅溶液（増幅緩衝液中のポリメラーゼの1:80希釈）と共にインキュベートする。この場合は、5〜10体の壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにポリメラーゼ2.5μlの、5増幅緩衝液40μlの高純度水の157.5μLを使用しています。 </li></ol></li><li>イメージングのための準備<ol><li> 10分間ずつ二回洗浄緩衝液Bで体の壁を洗ってください。 </li><li> 1分間に一度0.01X洗浄緩衝液Bで洗浄する。 </li><li>取り付けの前に少なくとも30分間取付溶液数滴で平衡化、または4℃で一晩保存する。 </li><li>微細なピンセットを使用して、慎重にプラットフォームスライドワットに体壁を転送するi番目の彼らのキューティクルを下に向けて。行と封入の低下や2内の同じ向きで体壁を配置します。その後明確なマニキュア液でスライドをシール、気泡を発生させないように注意しながら準備を介して22ミリメートル×40 mmのカバースリップを置きます。 </li><li>共焦点イメージングのための準備ができるまで-20℃の暗所でスライドを保管してください。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

このレポートは、PLAは、ショウジョウバエの幼虫NMJに適用する方法を示しています。アッセイは、NMJで存在する内因性のタンパク質 - タンパク質相互作用を検出するため幼虫体壁筋調製物に対して行われる。この技術では、は、Dlgおよびフーバーは、互いに近接しているため、特にシナプス後領域27において、複合体中に存在することが示されている。この結果を支持して、以前の研究では、次のデータとの関連付けの証拠を提供した：1）は、Dlgとフーバーの免疫反応性の分布が幼虫のNMJのシナプス後領域において重複し、2）は、Dlgとフーバーは共同に基づいて複合体を形成する免疫沈降大人になってからフライ溶解物を含む実験、および3）は、Dlgとフーバーは、上皮細胞とシナプス接合部8の両方で相互作用。シナプス後領域におけるPLA信号も一層クレーデを提供し、は、Dlgおよびパック、以前に他の研究において同定相互作用の間で観察されたNMJ 15,20,21でこのアッセイを使用してのNCEの。興味深いことに、朴とWgの間のPLAは、その免疫反応性の分布がNMJで重なっていても、観察可能...

（Dlgという）大ショウジョウバエディスクは、原形質膜の特定の部位での大きなタンパク質複合体の集合を編成助ける足場タンパク質の膜結合グアニル酸キナーゼファミリーの保存されたメンバーである。腫瘍抑制タンパク質は、Dlgという上皮apicobasal極性1,2,3の重要な決定因子として機能するように最初に同定された。 DLGはまた幼虫の発育4中のグルタミン酸作動性運動ニューロンの神経筋接合部（NMJ）での主要な足場モジュールとして提供しています。 DLGは幼虫NMJでの多様な役割を果たし、その多面発現は、複数のタンパク質5,6と会合する能力に依存しています。このようなタンパク質の1つは、胡-LIの太極拳シャオ（HTS）、主にアクチンスペクトリン細胞骨格7の調節における役割に関してに記載されている哺乳類adducinsにホモログである。これは、以前には、Dlgおよびフーバー、インビトロに基づいて、互いに複合体を形成することができることが示されている</em&gt;の全体の大人のフライ溶解物8を含む共免疫沈降実験。これらの結果の一つの欠点は、しかし、それらはここで、この複合体の形態を示すものではないということである。免疫組織化学を使用することにより、Dlgというおよびフーバーの分布は、幼虫のNMJのシナプス後膜にオーバーラップすることが観察されますが、この領域8で複合体中にありますか？最近示されており、ここでさらに詳述されるように、近接ライゲーションアッセイ（PLA）は、幼虫のNMJ 27で特異的には、Dlgとフーバーの間にその場での関連で検索するために使用されます。 PLAは、主にその場 9 でのタンパク質-タンパク質相互作用を検出することができ、細胞および組織培養に使用される比較的新しい技術である。このアッセイでは、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体は、種特異的二次抗体の対を用いて検出される、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたPLAプローブと呼ばれる（ 図1A、B）。 2タンパク質の場合sは、添付のPLAのプローブ間の距離は、2つの追加のコネクターオリゴヌクレオチド（ 図1C）のハイブリダイゼーションを介してブリッジすることができる（数十ナノメートル以内すなわち ）は、互いに近接している。この立体配座において、コネクタオリゴヌクレオチドの自由端が互いに接触するのに十分近く、閉じた環状DNA分子は、in situ ライゲーション （ 図1D）に基づいて形成することができる。環状DNA分子は、PLAプローブ（ 図1E）にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドのいずれかによって準備され、その場でのローリングサークル増幅のための鋳型として働く。得られた増幅、コンカテマーDNA産物内の配列は、次いで、蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブ（ 図1F）で可視化することができる。増幅されたDNAは、PLAプローブの1つは、タンパク質 - タンパク質相互作用withiの細胞内局在に付着したままであるので組織ナ容易に確認することができる。 いくつかの方法は、一般に、共免疫沈降、プルダウンアッセイおよび酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのインビトロ技術において 、そのようなフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）と二分子蛍光相補性（のようなインビボ技術を含むタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために使用されるBIFC）。 インビトロ技術の落とし穴は、相互作用が内生的に発生している場所で 、前述のインビボ技術は、それらの内因性の対応のネイティブ動作を反映していない可能性が融合タンパク質の人工的な発現を伴うながら、彼らは、特定していないということです。 PLAの1つの主な利点は、それがFRに匹敵する信号を生成するために必要な近さの程度と、組織内で互いに近接していると可能性が高い複合体を形成する内因性タンパク質の相互作用因子の細胞内局在を決定することができるということであるETとBIFC。 PLA起因抗体認識およびDNA増幅のカップリングに高い特異性と感度との相互作用を検出することができる。したがって、このアッセイは、相互作用の正確な位置を明らかに涙の形で個別の、明るい信号を生成することができる。また、ほとんどの可視抗原を検出することができる。最後に、PLAは、実行する比較的簡単な技術ではない、それが完了するために、標準的な免疫組織化学的手順よりも、もはやかかる。従って、PLAは、多くの場合、長い準備時間と広範なトラブルに悩まされている他のタンパク質 - タンパク質相互作用アッセイを介して技術的な利点を提供する。 このプロトコルは、PLAは、 その場での内因性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために、ショウジョウバエ幼虫NMJに適用することができる方法を示す。ここでは、PLAは、は、Dlgおよびフーバーが実際のNMJのシナプス後領域に複合体中に存在することが示されている幼虫の体壁筋調製物に対して行われる。 PLAは、以前に幼虫のNMJを研究するために使用されていなかった、とショウジョウバエの組織でこのアッセイを使用している論文のほんの一握りは、現状であります。これは、 ショウジョウバエコミュニティにPLAのさらなる暴露は、他のより一般的に使用されるタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを補完する追加のツールとしての利用増加につながることが期待されている。

<table><tbody><tr><td>鉗子(細かい#5)</td><td>アルメディック</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>シルガードディスク</td><td>ワールド精密機器</td><td>SYLG184</td><td>エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で混合します。30分に設定します。型に注ぎます(例:12ウェル細胞培養プレートを使用)。少なくとも24時間硬化させてください。解剖するときは、60 x 15 mmのシャーレの蓋に接着します。</td></tr><tr><td>微細ピン (0.0125&nbsp;先端径)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロダイセクションハサミ (超微細)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>プラットフォームスライド</td><td></td><td></td><td>2 つの 22 x 22 mm2 カバースリップを透明なマニキュアで顕微鏡スライドに接着し、<サンプルマウント用に20mmのギャップがあります。</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>ストックはGFPバランサー上で再バランスされ、GFPシグナルの不在に基づいてホモ接合変異体を選択できるようになりました。</td></tr><tr><td>1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水):3&nbsp;mM NaH2PO4, 7&nbsp;mM Na2HPO4, 130&nbsp;mM NaCl、pH 7.0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1)、Na2HPO4 (Caledon - 8120-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (パラホルムアルデヒド): 1x PBS</td><td></td><td></td> <td>中の 4% PFAPFA(アナケミアサイエンス - 66194-300)。解決策の作り方については、doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006を参照してください。</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT(トリトンを含むリン酸緩衝生理食塩水):0.01%トリトン</td><td></td><td></td><td>トリトンX-100(シグマアルドリッチ-T8787)</td></tr><tr><td>1%BSA(ウシ血清アルブミン):1x PBT</td><td></td><td></td><td>のBSA(Bioshop Canada - ALB001)に1%BSA。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>マウス抗DLG(ディスク大)</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク</td><td>4F31</td><td>%BSAで1:10希釈で使用します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗HtsM(Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>は、Lynn Cooley博士(イェール大学)によって提供されました。1% BSAで1:250の希釈度で使用してください。</td></tr><tr><td>rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td><td></td><td></td><td>Nicholas Harden博士(サイモンフレーザー大学)より提供。1% BSAで1:500の希釈度で使用してください。</td></tr><tr><td>マウス抗Wg(翅なし)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4D4</td><td>1%BSAで1:5希釈で使用します。</td></tr><tr><td>ヤギの抗HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)</td><td>ジャクソン&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>1%BSAで1:200の希釈度で使用してください。</td></tr><tr><td>FITC共役ロバ対ヤギ</td><td>ジャクソン&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>1%BSAで1:200の希釈で使用します。</td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA プローブ 抗マウス MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ PLA プローブ 抗ウサギ PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ 検出試薬 Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Wash Buffer A: 0.01&nbsp;Mトリス、0.15&nbsp;M NaCl、0.05% Tween 20、pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)、Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Wash Buffer B: 0.2&nbsp;Mトリス、0.1&nbsp;M NaCl、pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0.01x 洗浄バッファー B: 2&nbsp;mM トリス、1&nbsp;mM NaCl、pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large）は、膜結合グアニル酸キナーゼファミリーの保存メンバーであり、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部(NMJ)で主要な足場タンパク質として機能します。これまでの研究で、幼虫NMJにおけるDlgのシナプス後分布は、哺乳類のアドデューシンの相同体であるHu-li tai shao(Hts)のシナプス後分布と重なることが示されている。さらに、DlgとHtsは、成虫の全成虫のハエ溶解物を含む共免疫沈降実験に基づいて、互いに複合体を形成することが観察されています。しかし、これらの実験の性質上、この複合体が幼虫の発育中にNMJに特異的に存在するかどうかは不明でした。
Proximity Ligation Assay (PLA)は、最近開発された技術で、主に細胞や組織の培養に使用され、タンパク質間相互作用をその場で検出することができます。このアッセイでは、標準的な免疫組織化学的手順を用いて、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体とサンプルをインキュベートします。次に、一次抗体は、PLAプローブと呼ばれる特別に設計されたオリゴヌクレオチド標識二次抗体のペアで検出され、2つのプローブが互いに近接して結合した場合にのみシグナルを生成するために使用できます。したがって、複合体中にあるタンパク質を視覚化することができます。ここでは、PLAを使用してショウジョウバエの幼虫NMJでin situタンパク質間相互作用を検出する方法を示します。この手法は、幼虫の体壁筋製剤で行われ、DlgとHtsの間の複合体がNMJのシナプス後領域に実際に存在することを示します。

野生型の第3齢幼虫のNMJでは、Dlgというは、主にタイプが終末であるよりは、Dlg免疫反応性レベルはIb型終末においてより顕著であることで、I型グルタミン酸作動性神経繊維末端のシナプス後膜で発見された（ 図3A）4。 HTSが筋肉全体で存在するが、両方のI型繊維末端に等しい登場フーバー免疫反応性レベルのシナプス後の領域に集中し、また、（ 図3A '）シナプス前発見された8,17。は、Dlgとフーバーの分布が大きくシナプス後領域（ 図3A ''）8で重複することに注意してください。 は、DlgとフーバーはNMJでの複合体中に存在するかどうかを判断するには、PLAは2つのタンパク質間の幼虫の体壁筋標本で実施した。このアッセイでは、N末端およびウサギ抗HTSM抗体で第2のPDZドメインを検出するマウス抗Dlgという抗体これはC末端のMARCKS相同ドメイン15,16を用いた検出。野生型では、は、Dl...

このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

次の実験の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫NMJにおける内因性タンパク質タンパク質相互作用の細胞内局在を検出することです。これは、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体に結合するPLAプローブと呼ばれる一対のオリゴヌクレオチド標識二次抗体を使用して免疫蛍光染色を行うことによって達成されます。次に、PLAプローブ間のギャップは、2つのコネクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって埋められます。2つのタンパク質が互いに近接し、in situライゲーション上に閉鎖環状DNA分子が形成された場合にのみ、閉環状DNA分子内の配列を増幅するためにin situローリングサークル増幅が行われ、その後、相補的な蛍光標識付きオリゴヌクレオチドで検出されます。したがって、各増幅産物から生成された蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡を使用して観察すると、明確な明るいスポットとして容易に見ることができます。したがって、この手法がE、2、ハイブリッド、沈殿、脅威などの他の既存の方法と比較した場合の主な利点は、PLAが、互いに近接して局在し、複合体を形成する可能性が高い内因性タンパク質の細胞内局在を組織内で検出できることです。この方法は、特に幼虫とmjで発生するタンパク質間相互作用ネットワークへの洞察を提供します。また、他のホロシステムにも適用できます。胚と想像円板の上皮組織を提案します。その手順を実演するのは、私たちの研究室の2人の技術者であるhel yuとHa kingです。ショウジョウバエの培養物を摂氏25度で5〜6日間インキュベートした後、細い鉗子を使用して、バイアルまたはボトルから這う3番目の幼虫を選び、幼虫を洗います。それらをPBSを含む小さなシャーレに移します。次に、洗った幼虫の1つをSシガーディスクに入れ、氷のように冷たいPBSの数滴に浸してスタントします。幼虫の背側を上にして配置し、2つの気管トラックが解剖顕微鏡で見えるようにします。次に、鉗子を使用してムニューチンピンをつかみ、幼虫をらせんの後端の近くのらせんの近くに固定し、別のピンが口のフックの前端のキューティクルを貫通し、幼虫を縦にゆっくりと伸ばしてからピンで留めます。次に、マイクロダイセクションを使用して、はさみでピンの近くの後端をつまんで小さな開口部を作り、切開はキューティクルを通過するのに十分な表面性である必要があります。次に、ハサミの下刃の先端を切開部に配置し、下にある筋肉を傷つけないようにハサミの刃を少し上に向けながら、2つの気管路の間の背側正中線の全長に沿って切断します。次に、キューティクルだけで、後方に配置されたピンの少し前方に小さな水平切開を行います。次に、前方に配置されたピンの少し後方に別の同様の切開を行います。幼虫の体にPBSを数滴強力に追加した後、鉗子を使用して内臓を慎重に清掃します。幼虫の体をつつくと体に損傷を与えるため、避けてください。壁の筋肉は幼虫の体を開き、角を固定するために、体の壁を水平と垂直の両方に伸ばして、均等に張力のかかった長方形を形成します。組織を固定する過程で体壁の筋肉を引き裂かないように注意してください。ピン留めされた体壁を数滴のボアン溶液に浸し、固定後15分間氷上でインキュベートします。PBTを使用して、ティッシュを3回すすぎます。次に、試薬を節約し、アッセイ中にすべての体壁が等しく扱われるようにします。各遺伝子型の角を別々に切り取り、区別します。そして、細かい鉗子でピンを取り外した後、それらをすべて同じシリコン処理された0.65ミリリットルのマイクロ遠心分離管に入れます。組織を透過させるために、PBTを使用して体壁を3回、それぞれ10分間洗浄します。最終洗浄液を取り出した後、1%BSAを添加してサンプルをブロックし、1時間インキュベートします。免疫染色の隣に、体壁に目的の2つのタンパク質に対するマウスとウサギの一次抗体を添加し、2時間インキュベートします。この場合、1〜10個のマウス抗DLGと1〜250個のウサギ抗HTSを1%BSAで使用します。マーカーに対する抗体は、インキュベーション後にも追加できます。PBTを使用して、体壁を3回、それぞれ10分間洗います。次に、1%BSA中の任意のマーカーに対するフルオロ4標識二次抗体を添加し、翌朝、暗所で摂氏4度で一晩インキュベートします。PBTを使用して、体壁を3回、それぞれ10分間洗います。アッセイを少なくとも200マイクロリットルで1〜5希釈で開始します。体壁に1%BSAのPLAプローブ、抗マウスマイナスおよびPLAプローブ抗ウサギプラスの両方の総量は、洗浄緩衝液Aを使用して体壁を5分間それぞれ2回洗浄した後、摂氏37度で2時間インキュベートします。 インキュベーション後、摂氏37度で1時間インキュベートします。洗浄バッファーAを使用して、体壁を2回ずつ2分間洗浄してから、増幅溶液に1〜80希釈のポリメラーゼを加えます。摂氏37度で2時間インキュベートし、イメージング用のサンプルを調製します。洗浄バッファーBを使用して、体壁を2回、それぞれ10分間洗浄します。次に、100倍希釈した洗浄バッファーBを使用して、1分間の最終洗浄を行います。細い鉗子を使用して、数滴の取り付け溶液で少なくとも30分間、体壁を平衡化します。体壁をキューティクルの間隔を下げてプラットフォームスライドに慎重に移します。それらを同じ向きに一列に並べて配置し、1滴または2滴の取り付けソリューション内に配置します。22mm×40mmのカバースリップを調剤の上に置き、気泡が発生しないように注意します。次に、透明なマニキュアを使用してスライドをシールします。共焦点イメージングの準備ができるまで、スライドをマイナス20°Cで保管します。ここに示されているように、野生型幼虫njsでは、DLGは主にタイプ1のグルタミン酸作動性ブートンのシナプス後膜に見られ、レベルはタイプ1よりもタイプ1のBで顕著であり、HTSは筋肉全体に見られますが、シナプス後膜に集中し、レベルは両方のタイプ1のブートンで等しくなります。 DLGとHTSは、シナプス後領域で大きく重なり合い、DLGとHTSが複合体に存在するかどうかを判断します。N-M-J-P-L-Aでは、ここに見られるように、抗DLG抗体と抗HTS抗体を用いて行いました。2つのタンパク質間のPLAシグナルは、野生型NMJで特異的に観察され、シグナルは主にHRPによってマークされたシナプス前膜に円周方向に局在します。したがって、DLGとHTSは近接しており、シナプス後領域で複合体を形成している可能性があります。その結果は、欠損しているHTS変異体を含むネガティブコントロールとして特異的です。HTS免疫反応性は観察可能なPLAシグナルを示さない bnsの高倍率ビューは、DLGとHTS免疫反応性がシナプス後膜で大きく重なっていることを示しています。対照的に、2つのタンパク質間のPLAは、DLGおよびHTSタンパク質全体のサブセットのみが複合体にあることを示す離散PUNCTAをもたらす。この技術は、標準的な免疫組織化学的手順よりも長くはかかりません。このビデオを見れば、幼虫のNMJで発生する内因性タンパク質相互作用の細胞内局在を検出するためにPLAがどのように使用されているかを十分に理解できるはずです。

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。...

使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

このビデオでは、線虫細胞におけるin...

In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

このビデオでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)でのタンパク質間相互作用の可視化を示しています。体壁を単離した後、相互作用するタンパク質を一次抗体とPLA標識二次抗体でプローブします。相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターオリゴヌクレオチドによるプローブのライゲーションが促進され、環状DNAが形成され、ローリングサークル増幅によって増幅されます。蛍光プローブは増幅されたDNAに結合し、NMJでのタンパク質間相互作用の可視化を可能にします。...

近接ライゲーションアッセイを用いたショウジョウバエ幼虫のタンパク質間相互作用の検出

ここでは、固定された細胞内小胞体とミトコンドリアの間に内因性の相互作用を視覚化し、高感度で定量化するための手順について説明します。プロトコルは、ミトコンドリア関連膜界面での75 /電位依存性アニオンチャネル/シクロフィリンD複合体イノシトール1,4,5-三リン酸受容体/グルコース調節タンパク質を標的と現場での近接連結アッセイに最適化されています。...

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization...

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。...

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

学ぶ近接リガーションアッセイによるショウジョウバエ幼虫神経筋接合部でのタンパク質複合体の可視化法。この技術はシナプス組織とタンパク質相互作用の動態を解明するのに役立ちます。

の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

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