Name: ケモカインシグナリングにより誘導される細胞と分子分極の迅速かつ堅牢な分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ ケモカイン刺激後のT細胞形態変化とタンパク質局在の定量解析法。イメージングフローサイトメトリーにより高速かつ統計的に堅牢な解析を実現し、リンパ球の細胞生物学研究に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は大いにピエールBourdoncle、トーマスギルバートとコーチンイメージング施設のルイーズRimbaultを認める。この作品は、INSERM、CNRSとリーグ国立コントル·ルがん（エキップのlabellisée）によってサポートされていました。

Tリンパ球の調製<ol><li> 10,11を説明したように一次マウスまたはヒトT細胞を準備します。 </li><li> 3×10 6細胞/ mlの- 2の密度で、10％ヒト血清ABを含む完全RPMI培地中のヒトT細胞を養う。 注：代わりに、ヒト血清のウシ胎児血清（FCS）を使用すると、培養中のヒトT細胞の大部分の自発分極を誘発することができる。 4培養におけるこれらの細胞を維持 - 5日、さらに、この期間中にいつでもそれらを処理。 </li><li>類似の細胞密度で、10％FCSを補充した完全RPMI培地中でマウスT細胞を維持する。 10ng / mlのIL7の存在下で、37℃でO / N培養した後、次の日すぐに使用するか。 </li><li>完全RPMI中CEMヒトT細胞株を育成10％FCSを補充した。 </li></ol> 2.ケモカイン刺激<ol><li> 10 mMのHEPEを補足した暖かいHBSS培地で実験条件あたり5×10 5細胞を洗浄S。いくつかの実験のために、2μgのpmaxGFP及び8μgのをpcDNA3.1 +（空ベクター対照）、デッドPKCζキナーゼ、またはN末端​​Par6プラスミドで前日初代ヒトT細胞を共トランスフェクトする。 </li><li>温かいHBSS-Hepes緩衝培地中で細胞ペレットを再懸濁し（実験条件0.3mlのxの番号を使用する）。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を配布します。 注：したがって、単一の実験条件に対応する1管は0.3ミリリットルHBSS-HEPES培地中で5×10 5個の細胞が含まれています。いくつかの実験では、500 nMのラトランクリンAまたは媒体（DMSO）を追加し、ケモカイン刺激の前に30分間細胞をインキュベート。 </li><li>各チューブに10から500 / mlのCCL19またはCXCL12ケモカインを追加します。 注： - ヒトT細胞のための200 / mlのケモカイン我々は通常、10を使用しています。 CEM細胞は、CCL19に結合するCCR7受容体を発現しない。そのため、CEM細胞だけCXCL12刺激に反応することができるようになります。 500 n - でまた、より高いケモカ​​イン濃度（300を使用グラム/ ml）をマウスのT細胞を分極する。 </li><li>チューブを数回反転し、それぞれ、一次T細胞またはCEM 8または10分間37℃の水浴中でそれらを培養する。 </li><li>各チューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）及びPBS中10mMのHepesを含む温かい溶液0.3mlを加えて分極処理を停止する。チューブを反転し、5分間37℃でそれらをインキュベートする。 </li></ol> 3.染色は<ol><li>チューブフローサイトメトリーマイクロチューブから細胞を転送します。 </li><li> 1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.5mMのEDTA、PBS中の10mMのHepesを含むRT溶液で完全にチューブを埋める。 </li><li> 4分間460×gでチューブを遠心。 </li><li>上清を捨て、PBS中の5％FCSを含有するRT溶液100μlで細胞を懸濁します。 </li><li>離れて光から、渦それらを、各チューブに、FITC抗HLA-ABCの5μl加えて、室温で30分間、それらをインキュベートする。 </li><li> PBSで5％FCS、Aを含むで細胞を1回洗浄する一度PBSでのみND。 </li><li> RTで：1％のBSA、0.5mMのEDTA、PBS中10mMのHEPESを含む溶液で細胞を洗浄し、10分間インキュベートし、500μlの1％PFAを加える。 </li><li>上清を捨て、0.2％BSA、0.1％サポニン、0.5mMのEDTAおよび10mMのHepes（透過化緩衝液）を含むPBS溶液で完全にチューブを埋める。 </li><li>この培地中で細胞を2回洗浄する。 </li><li>培地を除去し、細胞ペレットを解離するためにそれらをボルテックスするチューブを裏返し。 </li><li> 、各チューブに抗P-ERMの抗体の100倍希釈渦にそれらを、室温で30分間インキュベート：0.25 / mlのTRITCファロイジンおよび/または1を追加します。 </li><li>透過化バッファーで細胞を洗浄。必要に応じて、蛍光二次抗体とインキュベートします。 </li><li> 200μlのPBSに細胞を再懸濁し、マイクロチューブに転送。 注：細胞を取得するための準備ができている。また、チューブあたり200μlの最大総量を維持しながら、最終的に1％に濃縮されたPFAを追加細胞は、さらなる処理のために同じ日に使用されるべきではない場合染色を保存するために集中。 </li></ol> 4.イメージの取得と分析<ol><li>装置のスイッチを入れ（ 特定の試薬​​/機器の表を参照）、それはメーカーの指示に従って、それ自体を校正しましょう。 NOTE：INSPIREソフトウェアは対物レンズ40倍（0.75 NA）で使用した。 IDEAS 3.0ソフトウェアは、報告されたすべての定量化のために使用された。 </li><li>将来の実験のためのテンプレートに保存することができます取得一連のウィンドウを準備します。 RMS勾配値を定量化ヒストグラムを描画します。 RMS勾配ヒストグラム上で選択し「フォーカスでは「集団から、エリアのヒストグラムの「単一セル」の人口をdelimitate。マイクロ遠心チューブが機械内に挿入された後、個々の細胞上にゲートをレーザーパワーを調整し、5000 Tリンパ球を取得する。 </li><li>アイデアでソフトウェアは、取得ファイルを開き、個々のセルに対して得られた明視野画像（チャンネル1）のための勾配RMS値の値が表示されたヒストグラムを作成します。 57より上のRMSの勾配値を示す細胞を考慮RMS勾配ヒストグラムにゲートを描きます。 注：RMS勾配分析において考慮焦点面内にある唯一のTリンパ球を取ることができる。我々は、57よりも優れたRMS勾配値を示す個々の細胞を焦点面にあり、正確に考慮することができることを実験的に決定している。 </li><li>解析/マスクは、メニューでは、2画素の侵食された明視野画像M01、上の形態学のマスクから（M01,2）を侵食すると呼ばれる、新しいマスクを作成します。その後、分析に/むしばむ（M01,2）マスク上の計算されたエリアの新機能を、作成し、メニューを用意しています。前のゲートに選択された細胞から、この新しく作成されたマスクを使用してセルの面積を示すヒストグラムを開きます。 注：によって利用可能な形態学マスクデフォルトでは、セルの実際のサイズよりもはるかに大きいです。これにより、2ピクセルにそれを侵食することがより正確である。 </li><li>キャリブレーションビーズや破片（小エリア）とダブレット（大面積）を除く、個々のT細胞上にゲートを描きます。各取得時にこのゲートを調整します。 注：セルサイズの変動は、ゲートの位置に影響を与える。マウスT細胞はCEM細胞より小さい自体、ヒトT細胞よりも小さいように、各細胞型の領域は、その大きさに比例する。 </li><li>前のステップでゲートしたシングル、焦点の合った細胞を考慮すると、ファロイジンでのRAWマックス·ピクセルの関数として、HLA-ABC染色に直接上限·ピクセルからなるドットプロット（チャネル2、X軸）を開く染色（チャンネル4、Y軸）。無染色または飽和蛍光イベントを除外するためにゲートを作成します。 HLA-ABC（チャネル2）とファロイジン（チャンネル4）染色のために直接上限画素を示すオー​​プンつのヒストグラム。 </li><li>解析/マスクメニュー、レコード生成で2画素の浸食HLA-ABC染色細胞（チャネル2）の形態のマスクから（M02,2）をむしばむと呼ばれるEA新しいマスク、、。その後、分析に/むしばむ（M02,2）で計算真円度パラメータからなる​​新しい機能を作成し、メニューを用意しています。 注：このパラメータは、円からの細胞形状の偏差を測定します。したがって、完全に丸いT細胞は、低円形度を示すことになる細長い極性細胞に対し高い真円度値を有する。 </li><li>その後、以前にゲート細胞から円形の特徴の値を報告します別のヒストグラムを作成します。個々のセルのための円形度の値に応じて合焦細胞集団、直接個々の分布をプロットするために、このヒストグラムを使用する。 </li><li>非刺激細胞のためにヒストグラムの形状を見ると、極性細胞のためにゲートを描き、非刺激細胞のほとんどの真円度の限界値まで最低の真円度の値で始まるプロットされている。ゲーテッド人口（％はゲートで囲われた）の間で偏細胞の割合の統計表示を見てください。 注：我々は、13以下の円形度指数値のため、このゲートを設定している。 </li><li>細胞内のアクチン染色の偏光を見るために、HLA-ABC染色（チャネル2）およびファロイジン染色を比較し、明るい詳細類似R3の値のヒストグラムをプロット（チャンネル4）。 注：この大きな特徴の値は、二以上の染色である重畳。 </li><li>前と同じゲート戦略を使用して、偏アクチン染色を有する細胞のパーセンテージを示す分離された染色のための非刺激細胞上にゲートをプロットする。 </li><li>完了すると、MHCクラスIおよびファロイジン染色、偏光された細胞の割合の分布に偏析を示す細胞のパーセンテージは平均±SD、全てのセルの真円度と類似度指標の平均値をcorrespに示されていると共にonding統計パネル。 </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

イメージングフローサイトメトリーの最近の技術を使用して、ケモカイン刺激によって誘発される細胞および分子事象を分析するための迅速かつ有益なゲーティング戦略が提示されている。ケモカイン刺激及び分極プロセス中の異なるタンパク質の細胞内分布によって誘導される細胞形態の変化：単一の実験から、人は情報の2つの主要なタイプを得ることができる。興味深いことに、証拠はまた、統計的なロバスト性及び全細胞集団のごく一部の関連する分析を可能にする多数の細胞を分析する可能性が提供される。報告されたように、この技術は、免疫学的シナプス12の文脈における分子の再配布イベントを分析するために使用することができる。また、同様のセットアップがすでにSDF1で刺激されたT細胞のために使用されてきたが、2つのマーカー間の共局在の程度のない分析は、13を提供されていない。 しかしこの技術は、したがって、多くの細胞型に適し得る、接着細胞を直接分析することができず、懸濁液中の細胞は、従来の取得を固定する必要がある。機械のこれらの固有の制限に加えて、それは、それらを刺激する場合、37℃...

ケモカインは、特殊な場所1に細胞を引き付ける小さな可溶性タンパク質である。したがって、それらは、組織中の細胞の正確な位置決め、発達および生理学において重要な機能に関与する。それは効果的な免疫応答を協調して作用する多くの異なる細胞型の作用に依存して、免疫系は、この規則の例外ではない。外来抗原が検出され、中和され得る前に、所定の状態でつの免疫細胞型の特定の位置を制御することによって、ケモカインは、予め求められている。 特に、Tリンパ球において、ケモカインは、T細胞の運動2,3を支持し係合すると、多くの細胞内シグナルを誘発する、特異的な表面受容体（カルシウム上昇、ERKリン酸化のRho GTPアーゼ活性化、インテグリン親和性および細胞骨格の変化の増加）に結合する。細胞レベルでは、人は、ケモカイン刺激により誘発される形態学的変化を観察することができる。細胞形状の変化はT細胞に特に劇的である：血流中に移動するとき、休止T細胞は、ビーズ状の丸い形態を持っている。前方に前縁しかしながら、炎症部位において又はリンパ系器官の近傍でのケモカインの存在の検出は、現在のバイポーラ形からなる典型的な「ハンドミラー」形態を採用するT細胞の形状を変更しようとしているそしてバック4で立ち下がりエッジ、または腹肢、。また、細胞内成分は、マイグレーションを維持するために、偏T細胞のこれらの二つの対向領域に分離することができる。例えば、ケモカイン刺激5と重合アクチン時アクチンフィラメントの重合増加が偏T細胞2の前面に蓄積する。一方、皮質F-アクチン細胞骨格を血漿膜にリンクエズリン - ラジキシン、モエシン（ERM）ファミリーのリン酸化タンパク質のようないくつかのタンパク質は、偏光の腹肢に再局在化するT細胞を6。興味深いことに、本発明者らおよび他のこの分極処理は、T細胞の遊走に必要とされることを示した。確かに、偏光と干渉する任意の治療は、細胞の運動性を阻害します。例えば非定型プロテインキナーゼC（PKC）ファミリー、PKCζおよびPKCιブロックT細胞分極および樹状細胞7のそれらの遊走スキャン処理のメンバーの活性の阻害。 T細胞の分極ものRho GTPアーゼによって調節される。我々は、最近記載Fam65bタンパク質によるRhoAの活性の調節は、T細胞の形態の変化及びトランスウェルアッセイ6中を移動する能力を妨害することを示している。分極は、細胞の運動性の前提条件のステップであるとして、それはケモカイン応答の主要な読み出しとして定量化することができるようにすることが重要である。細胞形状の変化は、以前に手動8を測定した。しかし、定量化のこの種は、非常に時間のかかるであり、その通常は数そう細胞の数が考慮される。 ここでは、新たな方法を迅速にケモカイン刺激にさらされるTリンパ球の形状変化の度合いを定量化するために提示される。イメージングフローサイトメトリー技術（ 具体的な試薬/機器の表を参照）、フローサイトメーターの利点を組み合わせた、使用され、ケモカイン刺激の異なる条件で効率的に偏光した細胞の量を定量する顕微鏡9。一つは、この技術でロバスト測定できる形態変化の定量化に加えて、ケモカインシグナリングの際にいくつかのタンパク質の細胞内局在の変化を評価することも可能である。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清 AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>補体を不活性化するために予熱します。</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>補体を不活性化するために予熱します。</td></tr><tr><td>ヒトT細胞核因子キット</td><td>ロンザ</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr>マウス<tr><td>IL7</td>ペ<td>プロテック</td><td>217-17HBSS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ギブコ</td><td>14025-05037</td><td>°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>マウス CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>アリコートは、ケモカインを細胞に加える前に氷上で解凍します。</td></tr><tr><td>ヒトCCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>アリコートは、ケモカインを細胞に加える前に氷上で解凍されます。</td></tr><tr><td>ヒトCXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>アリコートは、ケモカインを細胞に加える前に氷上で解凍されます。このケモカインは、マウスのT細胞にも使用できます。</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>これは、水中の8%PFA溶液です。2x PBSで容量を混合し、PBS中の4% PFA溶液を得ます。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>アムニス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ケモカインシグナリングにより誘導される細胞と分子分極の迅速かつ堅牢な分析

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

細胞は、偏光と呼ばれるプロセスで、かつ多くのタンパク質の細胞内局在を変化させることによって、彼らの丸い形状を失うことによる刺激ケモカインに応答します。古典的な画像化技術は、これらの現象を研究するために使用されてきた。しかしながら、それらは時間のかかる形態の定量化および細胞の数の染色の共局在続く多くの細胞の手動取得を必要とした。ここでは、迅速かつ強力な方法は、サイトメーターのものと顕微鏡の利点を組み合わせたイメージングフローサイトメトリー技術を用いて細胞数千からなるサンプルにこれらの現象を研究するために記載されている。 MHCクラスI分子および繊維状アクチンのためのCCL19及び染色で刺激したTリンパ球を使用して、ゲーティング戦略を同時に形状変化の程度及びCCL19シグナル伝達によって影響されるマーカーの共局在化の程度を測定するために提示されている。また、このゲーティング戦略はobservに私たちを許可E CXCL12刺激後の偏T細胞中で（フロントで）繊維状アクチンと（後方の）リン酸化されたエズリン - ラディキシンモエシン（リン酸化ERM）タンパク質の分離。 Par6 /非定型PKCシグナル伝達経路の変異体の薬理学的阻害剤と式でアクチン重合の阻害：この手法は、2つの異なる要素の偏光に遮断効果を観察することが有用であった。したがって、証拠は、この技術は、形態学的変化およびタンパク質の再分配の両方を分析するのに有用であることが示されている。

ここで選択された最初の例では、CCL19で刺激したヒト一次Tリンパ球の使用に関する。しかし、同じ戦略は、初代マウスT細胞、T細胞株またはケモカイン刺激に応答する任意の他の細胞型で使用することができる。ここで紹介するゲーティング戦略は集中イベント、単一のセルを選択一連のウィンドウが含まれています。 （ 図1）またはCCL19刺激された（ 図2）Tリンパ球を休止するためのMHCクラスI HLA-ABC及び繊維状アクチン：最後に、蛍光強度の範囲は、二つのマーカー上の例のように、ここで続いている。 まず、円形度は、未処理（ 図1）またはCCL19刺激された（ 図2）Tリンパ球で測定される。休止細胞は、高い真円度値と主要な単一のピークを有しているという事実は、ほとんどの細胞は円形に近いことを示している。しかし、CCL19刺激が出現oをを誘発することが明らかである低円形度指数を有する細胞のFA第二亜集団。この亜集団は、偏光の形態を採用している細胞を包含する。 ...

ケモカインシグナル伝達は、細胞形態の顕著な変化と細胞内タンパク質の重要な再分布を誘発します。ここでは、これらのイベントを研究するための迅速で詳細なプロトコルが提供されます。

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

次の手順の目標は、特定の刺激に応答して多数の細胞における細胞形態の変化と、目的の特定のタンパク質の細胞内局在を迅速かつ自動的に定量化することです。これは、最初に目的の化学療法の種類でT細胞を刺激することによって達成されます。第2ステップでは、細胞を蛍光標識し、イメージングフローサイトメトリーで分析します。最終ステップでは、形態学的に分極したリンパ球の数と蛍光マーカーの分離量を、選択したマスクに応じて、各染色のピクセルの位置と強度に基づいて評価できます。最終的に、このイメージングフローサイトメトリー技術を使用して、ケモカイン刺激後のリンパ球の形態学的変化、および分極細胞内の特定の目的タンパク質の位置を迅速かつ確実に定量化できます。この手法は、顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、多数の細胞を繰り返し処理し、自動的に解析できるため、形態学的変化やタンパク質分布を統計的に強力に解析できる点です。ケモカイン刺激Tリンパ球では、T細胞のBoche親切な刺激は、10ミリモルHEPsを補充した温かいHBSSで実験条件ごとに5つの細胞を5回中心に洗浄することから始まり、室温 G.At 340倍で5分間遠心分離し、すくみ出しを取り除き、チューブあたり0.3ミリリットルの温かいHBSSピースでペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液を個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。各チューブに1ミリリットルあたり10〜500ナノグラムのケモカインを加え、チューブを数回裏返して混合します。細胞を摂氏37度の水浴でインキュベートします。8〜10分後、0.3ミリリットルの温かい2%パラアルデヒドに10ミリモルを補給して分極を停止します。彼はエンドウ豆。次に、チューブをさらに反転させて混合し、摂氏37度でさらに5分間インキュベートして、免疫蛍光分析のために細胞を染色します。次に、刺激されたT細胞を対応するフローサイトメトリーチューブに移します。チューブに染色用バッファーを完全に充填します。次に、細胞をスピンダウンし、ペレットをPBS中の5%ウシ胎児血清100マイクロリットルに再懸濁します。次に、各チューブに5マイクロリットルのZI N-T-H-L-A-A-B-Cを追加します。それらをボルテックスし、インキュベーションの終了時に暗所で室温で30分間細胞をインキュベートします。細胞を2回洗浄し、次いで500マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒド中でインキュベートする。10分後、細胞をさらに染色緩衝液で洗浄し、チューブを浸透緩衝液で完全に満たします。細胞を透過バッファーで2回洗浄した後、チューブを離れて仰臥位を除去し、次にそれらをボルテックスして細胞ペレットを解離させます。次に、サンプルをゼロ点25マイクログラム/ミリリットル、ロースの場合はトリクシで染色し、それらをボルテックスし、暗所で室温で30分間インキュベートします。次に、インキュベーション期間の終わりに、浸透緩衝液で細胞を洗浄します。再び、resus。ペレットを200マイクロリットルのPBSに懸濁し、次に細胞を個々のマイクロ遠心チューブに移して、ケモカイン刺激後の分極T細胞の割合を決定します。まず、イメージングフローサイトメーターのスイッチを入れ、製造元の指示に従って自動的にキャリブレーションを行います。RMS 勾配で選択された焦点の合った母集団から RMS 勾配値を定量化するヒストグラムを描画します。ヒストグラムは、マイクロ遠心チューブが機械に挿入されたら、個々の細胞のレーザーパワー歩行を調整し、5, 000 Tリンパ球を取得すると、領域のヒストグラムで単一細胞集団を描写します。アイデア分析ソフトウェアで。取得したファイルを開き、個々のセルごとに取得した明視野画像の勾配RMS値を示すヒストグラムを作成し、セルにゲートを描画して、57を超えるRMS勾配値を示します。解析メニューで、明視野画像 M zero one eroded of two ピクセルのモルフォロジー マスクから erode M1 two という新しいマスクを作成します。次に、分析機能メニューで、前のゲートで作成されたセルから侵食M1 2マスクで計算された領域の新しい機能を作成します。セルの領域を示すヒストグラムを開く この新しく作成したマスクを使用して、小さな領域のキャリブレーションビーズと破片、および大きな領域のダブレットを除外して、個々のT細胞にゲートを描画します。次に、H-L-A-A-B-C染色上の生の最大ピクセルの関数として、分析マスクメニュー背面の生の最大ピクセルの関数として、H-L-A-A-B-C染色細胞の形態マスクから2つの細胞を侵食する新しいマスクに後部で、H-L-A-A-A-B-C染色細胞の2つの侵食からなるボットを開きます。次に、解析機能メニューで、侵食M two twoで計算された真円度パラメータで構成される新しい機能を作成します。その後、別のヒストグラムを作成して、以前にゲートされたセルから真円度の特徴の値を報告します。次に、非刺激細胞のヒストグラムの形状を見ると、分極細胞のROアゲートは、最も低い真円度値から始めて、ほとんどの非刺激細胞がプロットされる真円度限界値まで、細胞内のアクチン染色の分極を評価するためにプロットされます。さらに、明るいディテールの類似性のためのヒストグラム、H-L-A-A-B-Cと染色中のフォイドを比較するためのR 3値。次に、今示したのと同じゲーティング戦略を使用し、さらに非刺激細胞のGAを使用して、非共局在の偏析染色を行います。統計パネルには、ここで分極したアクチン染色を持つT細胞の割合が表示されます。非分極細胞または分極細胞のゲートに落ちるCCL19刺激Tリンパ球の例が示されている。両方の亜集団間の形態の違いがはっきりと観察できます。先ほど実証したゲーティング戦略は、CCL 19の存在がない場合に分極ゲートに落ちる細胞の割合をプロットするためにも使用できます。予想通り、ケモカイン刺激が分極T細胞の割合を増加させることは明らかです。両方の条件下で得られた全細胞集団の平均真円度指数もプロットできます。実際、CCL 19の刺激は、この指数の低下を誘発します。しかし、細胞の半分だけが分極しているため、CCL 19の刺激で観察される平均真円度指数の変化は小さいです。この実験では、T細胞をGFPでコットトランスセクトし、極性複合体パー6の優性ネガティブ変異体をコードするプラスミドとともに移植しました。PKCゼータ。トランスフェクションされなかった細胞のヒストグラムは、全細胞集団のごく一部がトランスフェクションされたことを示す、関連するGFP陽性T細胞に対する特異的なゲーティングを可能にした。次に、これらのトランスフェクト細胞の形態学的分極の程度を、GFP陽性細胞の真円度指数とT細胞の追加歩行のみを測定することによって定量化しました。低い真円度を示す値は、各条件下で分極した細胞の割合を推定するために作成されました。これらのデータを総合すると、パー6 PK CZのシグナル伝達経路への機能の破壊が、CCL 19ケモカインとc Xcl 12ケモカインの両方によって誘導されるT細胞分極を阻害することを示しています。以前の調査結果と一致しています。この手順を試みている間、リンパ球の強力で信頼性の高い形態学的分極を確保するために、溶液キン刺激ステップとその後の固定全体を通して常に摂氏37度で作業することが非常に重要です。

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、走化性を調査するための詳細な生細胞イメージングの方法を説明します。我々は、遊走細胞のシグナル伝達事象の時空間ダイナミクスを監視するために蛍光顕微鏡の方法を提示する。シグナル伝達イベントの測定は、私たちはさらにGPCRシグナリングネットワークは真核細胞の化学誘引物質とコントロールの方向マイグレーションの勾配のセンシングを実現する方法を理解することが可能。...

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

このビデオでは、オールオンチップ法を使用した好中球走化性アッセイを実演しています。この方法では、免疫磁気陰性選択とそれに続くマイクロ流体チップ上の走化性アッセイにより、全血から好中球を直接分離できます。...

全血を用いた迅速な好中球走化性分析のためのマイクロ流体チップベースの方法

脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。...

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

細胞内レベルでは、シグナル伝達イベントは発生的および環境的な手がかりによって動的に調節されます。ここでは、タバコの一過性発現システムを使用して、動的なタンパク質間相互作用を監視し、植物細胞におけるシグナル伝達の空間的構成を明らかにするプロトコルについて説明します。...

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。...

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。...

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々...

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

人間の大食細胞のプロテオーム署名を取得し、これをマクロファージ偏波に低酸素環境の影響の定量に適用するためのプロトコルを提案します。...

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

我々は、細胞および多細胞オルガノイドを用いて3D 培養および実験のためのデバイスを構築する方法について述べる。この装置は定義された化学誘引物質の勾配の3D...

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

生体内でのマクロファージ募集に対するケモカインの効果を試験するために、その位置ハイブリダイゼーション中のマウント全体を使用してケモカインの異所性発現を検出し、免疫染色を用いてマクロファージの標識を行った。ライブイメージングは、マクロファージ移行のリアルタイム観察に使用されました。...

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

学ぶ ケモカイン刺激後のT細胞形態変化とタンパク質局在の定量解析法。イメージングフローサイトメトリーにより高速かつ統計的に堅牢な解析を実現し、リンパ球の細胞生物学研究に活用できます。

ケモカインシグナリングにより誘導される細胞と分子分極の迅速かつ堅牢な分析

さらに動画を探す