脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植
2014年12月17日
脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。
この手順の全体的な目標は、マウスの脊髄損傷の挫傷モデルを詳細に説明し、続いて神経幹細胞を移植することです。これは、最初に死後、神経前駆細胞、またはPM NPCをバイタルトレーサーPKH 26で標識することによって達成されます。次に、マウスに背側切開を行い、脊髄を露出させます。
次に、無限水平線またはIHインパクターデバイスを使用して、脊髄に病変を作成します。最後に、PCRとPCで標識されたPKH26をマウスの尾静脈に注入します。最終的に、生着したPKH20 6:00 PMと病変部位のPCの運命が追跡されます。
損傷モデルは、脊髄損傷の男性を再現しています。一次的な機械的損傷に続いて、細胞および薬理学的治療が研究される進行性の二次変性が続きます。記載されているアプリケーションは、信仰についてのさらなる洞察を得るための方法論的基礎を提供する可能性があります。
変性や炎症性イベントが起こっている間に脊髄に移植された幹細胞の誘導。病変を実演するのは、研究室の博士課程の学生であるトニー・ラジャ・ロンゴ博士です。尾部注射はDr.Acheによって行われますが、それは研究室のポスドクフェローであり、テキストプロトコルに記載されている基準を満たす神経幹細胞から始まります。
Resusは、150マイクロリットルあたり6個の細胞に対して10の1倍の濃度で細胞を懸濁します。マウス1匹につき10個から6個の細胞の1.2倍以上を調製し、ピペットをロードするのに十分な細胞を確保します。神経幹細胞培地を用いて、10ミリリットルの円錐形バイアルで細胞を3回洗浄し、Gの500倍で室温で5分間回転させ、細胞をペレット化する。
各洗浄後、最終スピンカウントの前に、細胞はスピン後に上清を吸引し、約25マイクロリットルの液体を残して細胞の誤嚥を防ぎます。次に、1ミリリットルの希釈剤Cを細胞口蓋に添加して2X懸濁液を調製し、穏やかなピペッティングを使用してすぐに再懸濁します。染色する前に、チューブ内の1ミリリットルの希釈剤Cに4マイクロリットルのPKH26エタノールD溶液を加えて、希釈剤Cに2倍色素溶液を調製し、よく混合します。
迅速に分散させるには、1ミリリットルの2 x細胞懸濁液を1ミリリットルの2XD溶液に加え、すぐにピペッティングでサンプルを混合します。細胞ダイ懸濁液を1〜5分間インキュベートした後、HBSSに等量の1%BSA溶液を加えて染色を停止し、1分間インキュベートします。次に、細胞をGの500倍で10分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。
10ミリリットルの完全培地を使用して細胞ペレットを再懸濁し、細胞の回復率、細胞生存率、および蛍光強度を評価します。細胞を遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットに10ミリリットルのHBSSを加えます。HBSSで2回洗浄し、細胞を滅菌生理液に再懸濁します。
テキストプロトコルに従って手術領域とマウスを準備した後、メスで手術中の低体温を避けるために動物の背側を上にしてスライドウォーマーに置き、鉗子を使用してT 7からT 12までの関心領域に垂直切開を行います。第5胸突起と第6胸突起の間の空間にある皮膚と表面脂肪パッドを実体顕微鏡で保持します。血管の下のプロセスをT6として数え、次にT7に移動します。
次に、マウスの腹側の下に小さなベアリングを配置して脊椎の湾曲を増やし、グロフ鉗子を使用して脊椎をブロックして固定します。次に、メスを使用して、椎弓の背側表面がメスの先端に接触するまで、椎骨レベルで椎骨筋のパラを両側のT7からT10に切断します。次に、メスを使用して、椎弓の背側表面がメスの先端に接触するまで、椎骨レベルでT 7からT 10への接合部を刻み、T8とT9の小さな突起の間のスペースで停止します。
次に、マイクロハサミを使用して、T8とT9、T9とT10の間の組織を切断します。次に、ロンゲールを使用してTナインプロセスを削除します。マイクロハサミを使用して接合部を露出させ、筋肉層を慎重にこすり落とします。
骨が露出するまで続けます。鉗子を使用して椎弓板から筋肉を取り除き、椎骨の間に小さなスペースを開きます。次に、マイクロハサミを骨の下にそっと挿入します。
両側の椎弓板を切断し、鉗子を使用して取り除き、コードを露出させます。ロンジュールを使用して、残っている空いている骨片やギザギザの骨片を取り除きます。次に、Tナイン背突起の上半分を取り外します。
IHインパクターデバイスのプロトコルに従った後、本文のガイドラインに従って、4つのOH吸収性縫合糸を使用して、最初に除去された椎弓の部位で露出した脊髄を覆うことにより、切開を閉じます。下にある筋肉を挟まないように注意してください。2つまたは3つのレフレックスクリップを使用して皮膚を閉じます。
腰に2ミリリットルの生理食塩水を皮下注射し、マウスを温熱パッドの温めたケージに入れて回復させます。細胞の尾静脈注射を行う。試験管内の細胞を再懸濁し、75マイクロリットルを0.3ミリリットルのシリンジにロードし、細胞懸濁液に気泡が存在しないことを確認します。
細胞の沈降を防ぐため、シリンジを水平に保ちます。マウスをヒートランプの下に置いて、尾静脈を拡張します。次に、マウスを拘束装置にそっと引っ張って、細い青い線として表示される外側の尾静脈を視覚化します。
アルコール綿棒を使用して尾をきれいにし、静脈が視覚化されたら、左手の中指と親指の間の尾静脈をつかみます。このビデオで示されているTナイン挫傷は、後肢機能の一時的な喪失を引き起こしました 10 から 5 番目の細胞まで 3 回または PBS を尾静脈に注入し、損傷後 30 分、6 時間、18 時間後に行われました。ここに示すように、2〜3週間以内に、PBSは負傷者を治療し、マウスは改善し、後肢機能はマウスの基底鱗の3ポイントに達しました。またはPM.NPCsで治療されたBMSマウスは、より高い回復を示し、ここで見られるようにBMSの4.5ポイントに達し、PKH26で標識されたほとんどの生着pmNPCは、病変クラスターの形成端に蓄積しました。
投与後すぐに、移植された細胞は病変の縁に沿って移動し、より拡散してニューロンに分化しました。病変および移植の30日後、pm NPCの細胞体はサイズが大きくなり、ほとんどの細胞において、樹状突起様プロセスは明らかであり、特異的抗体によって完全に免疫染色される このプロ手順を取得する一方で、より高い力が作る より深刻な損傷のために動物の死亡率を増加させる可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、私たちは、より再現性のある回復プロセスが続く病変パラダイムのパラダイムを使用することを提案します。
このビデオを見た後、無限水平インパクターを使用してマウスの外傷性脊髄損傷の再現可能な実験モデルを取得する方法を十分に理解しているはずです。
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概要
本研究では、マウスにおける脊髄損傷の打撃モデルの詳細と、それに続く神経幹細胞の移植について説明します。手順には、神経前駆細胞の標識および脊髄病変の作成が含まれます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 再生医療
- 細胞生物学
背景
- 脊髄損傷は重大な健康問題を引き起こします。
- 神経幹細胞は修復および再生の可能性を秘めています。
- 治療法を開発するためには、損傷モデルを理解することが不可欠です。
- 研究では一般的に挫傷モデルが用いられています。
研究の目的
- マウスにおける脊髄損傷誘発法について記述すること。
- 移植した神経幹細胞の効果を調査すること。
- 移植後のラベル化された前駆細胞の運命を追跡すること。
使用した手法
- PKH 26を用いた死後神経前駆細胞の標識。
- 脊髄を露出させるための背側切開。
- Infinite Horizon Impactorを用いた脊髄損傷の作製。
- 標識した前駆細胞のマウス尾静脈への注入。
主な結果
- マウスにおける挫傷モデルの作製成功。
- 病変部位における移植前駆細胞の追跡。
- 損傷後の移植細胞の挙動に関する知見。
- 将来的な脊髄損傷治療への潜在的な示唆。
結論
- 挫傷モデルは、脊髄損傷の研究に有効である。
- 移植された神経幹細胞は、再生に向けた有望な結果を示している。
- 治療戦略を最適化するために、さらなる研究が必要である。
よくある質問
業界における実用的意義
この挫傷モデルは、脊髄損傷に対する神経幹細胞治療の再現性のある前臨床評価を可能にし、再生医療パイプラインにおけるターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。標準化された損傷パラダイムと静脈内幹細胞投与を組み合わせることで、生着、分化、および機能回復の定量的な評価が容易になり、初期探索段階におけるゴー/ノーゴーの意思決定に寄与します。本モデルの再現性とトランスレーショナルな整合性は、神経変性疾患プログラムにおけるポートフォリオの選別に対する予測的信頼性を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 臨床的に関連のある損傷条件下において、幹細胞が媒介する修復に関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 標準化された病変パラメータを通じて、神経前駆細胞の機能的ターゲット検証のための再現可能なプラットフォームを提供する。
- 予測的価値： 損傷部位における標識細胞の運命および分化を経時的に追跡することで、メカニズムのリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 化合物や細胞治療のスクリーニングに向けた、定量可能な組織学的および機能的なアウトプット（BMSスコア、蛍光強度など）を生成します。
- 再現性： Infinite Horizon Impactorにより病変の重症度が一定に保たれ、後続の有効性評価におけるばらつきが低減されます。
- スケーラビリティ： 尾静脈注射による全身投与試験が可能であり、投与量ごとの生体内分布や生着効率の評価が行えます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性：一次的な機械的損傷に続く進行性の二次変性をモデル化しており、ヒトの脊髄損傷の病理生理学を反映している。
- トランスレーショナルな連続性：移植されたPM NPCsが病変端に遊走し、ニューロンへと分化する過程を追跡できるため、バイオマーカーに基づいた有効性評価が可能である。
- リスク調整済みの進展：PBS投与群と幹細胞治療群の間で機能回復（BMSスコア）を比較でき、前臨床段階でのgo/no-go判断基準に情報を供する。
パイプラインおよびワークフローへの統合
本手法は、標的バリデーションからリード化合物の同定、さらには前臨床有効性試験に至る創薬の連続的なプロセスに統合されるものであり、特に神経変性疾患を適応症とする細胞療法の開発に有用です。
- 発見生物学：二次損傷カスケードにおける幹細胞の作用機序に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：PKH 26標識およびイメージングにより、細胞療法の生着と病変修飾の標準化された評価を可能にします。
- 分析：BMSスコア、細胞生存率指標、分化マーカーなど、群間比較のための定量的従属変数を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：初期の生着挙動を長期的な再生結果に結びつけ、バイオマーカーの整合性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：複数の細胞株や投与量レジメンの反復的な検証に向けて、再利用可能な手術および移植ワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ラベル付けされた前駆細胞を直接追跡することで、幹細胞療法の作用機序（MOA）におけるメカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 損傷誘導と細胞投与を標準化し、ラボ間の再現性とアッセイの堅牢性を向上させます。
- 戦略的価値： 再生医療候補物質における早期の失敗検出を可能にし、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響： 機能回復の閾値および生着パターンに基づいた、リスク調整後の優先順位付けに情報を供します。
実施上の検討事項
- 脊髄の顕微鏡下手術による露出およびInfinite Horizon Impactorの校正に関する専門知識が必要です。
- 無菌的な細胞操作、蛍光顕微鏡観察、および行動スコアリングのためのインフラストラクチャに依存します。
- 手術、細胞調製、および薬理学チーム間の機能横断的な標準化が必要です。
- 適応上の検討事項として、動物種に応じた損傷パラメータおよび細胞投与量のスケーリングが含まれます。
- 実用上の制限として、出典に記載されている通り、二次変性のキネティクスおよび細胞生存率の変動が挙げられます。
