Name: キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぼう、ストップトフロー蛍光と標識ヌクレオチドを用いてキネシンのATPターンオーバーサイクルにおけるヌクレオチド結合と解離の速度論を測定する方法。この手法は他のヌクレオチド結合タンパク質の研究にも応用可能です。

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この作品は、バイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）、王立協会とノッティンガム大学でサポートされています。

MANT標識ヌクレオチドの結合時に蛍光強度変化の1。決定。 <ol><li>適切な反応緩衝液中1μMのキネシン（最終濃度）に1μMのMANT標識ヌクレオチドを​​追加します。通常、微小管の成長と安定に利益をもたらすバッファが（議論を参照）が使用されます。一般的に使用される緩衝液は80mMのピペラジン-ビス-2 -エタンスルホン酸（PIPES）、pH6.9を含有し、1mMのMgCl 2および1mMのエチレングリコールビス2アミノエーテル四酢酸（EGTA）。 注：すべてのプロトコルに記載されたキネシンの濃度は、ヌクレオチド結合部位（ すなわち、モータードメイン）の濃度を意味する。別のキネシンは、単量体、二量体または四量体として存在するので、分子当たり二つ以上のヌクレオチド結合部位を含むことができる。 </li><li>インキュベーション期間（1-3分）後、標準的な蛍光光度計を使用して、マント標識ヌクレオチド、キネシン複合体について発光スペクトルを測定する。 365nmの励起波長を使用し、1nmの増分で400〜500nmの発光を測定する。 </li><li>ステップ1.1で使用したのと同じ反応緩衝液中1mMのMANT標識ヌクレオチドの溶液を作る。 </li><li>前述のように、マントヌクレオチドのみのサンプルについて、発光スペクトルを測定し（ステップ1.2参照）。 </li><li>この値で割ることを通じて（キネシンことなく、 すなわち ）溶液にマントヌクレオチドのスペクトルのピークの蛍光強度の波長の信号にスペクトルを正規化する。 </li><li> （ 例えば、 図2B）は mantATP結合および/ ​​または溶液中mantADP結合キネシンとMANTヌクレオチドの間の蛍光強度の違いを観察するために正規化されたスペクトルをプロットします。 </li></ol> mantATPための会合および解離速度定数の2。測定<ol><li>任意の適切なマグネシウムで最大20μMのキネシン（説明を参照してください）2 +フリー緩衝剤（ 例えば、80ミリメートルPIPES pH6.9、1mMのEGTA、0.1％のTween20）の溶液に、1を追加mMの（最終濃度）エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および1mM（最終濃度）ジチオスレイトール（DTT）。注：バッファへのTween20の添加が推奨され、それが減少するように/バッファー交換に使用したカラムにキネシンタンパク質の損失を防止する（ステップ2.3および3.3） </li><li> 15分間、25℃で溶液をインキュベートする。 </li><li>製造業者の指示に従って重力流G-25セファデックスゲルろ過カラムを用いキネシンとは別の自由ヌクレオチドおよびEDTA（材料のリストを参照）。 <ol><li> （ステップ2.1参照）、適切なマグネシウム2 +のない緩衝の少なくとも3カラム容量でカラムを平衡化する。カラムにキネシンを含む溶液をロードします。塩化マグネシウムの最終濃度はキネシン液の採取後1 mMであるように、空のチューブに100mMの塩化マグネシウム溶液の適切な量を添加することによって収集チューブを準備する。塩化マグネシウムの即時の追加はstabiliに役立ちますヌクレオチドフリーキネシンをSE。 </li><li>適切なマグネシウム2 +フリー緩衝液を用いて、キネシンを溶出。そう、それが迅速に作業することが重要であるとき、ヌクレオチドの自由キネシンは不安定である。氷の上のヌクレオチドの無キネシンを保存し、1〜2時間以内に使用しています。 </li></ol></li><li>中またはヌクレオチドフリーキネシンの製造に先立って、ヌクレオチドフリーキネシンの最終的な解決策として、同じ反応緩衝液中mantATP濃度シリーズを用意。 0.1〜50μM（ステップ2.5および説明を参照）に至るまでの典型的なシリーズとキネシンの利用可能な濃度に応じて必要なmantATPの濃度の範囲を決定します。 </li><li>ヌクレオチドフリーキネシンの濃度シリーズを準備します。 mantATPの各濃度（2.4ステップ）、ヌクレオチドフリーキネシンの濃度はMANT標識ヌクレオチドは、キネシンのヌクレオチド結合部位を介して5から10倍モル過剰であるように準備する必要があります。 </li><li>ストップトFLOに励起波長を設定します365nmでのwの光度とロングパスフィルタを使用して&gt; 400 nmで放射された光を集める。 </li><li>ストップフロー蛍光光度（ 図3Aおよび3B 挿入図 ） を使用して、1（v / v）の比：mantATPの最低濃度から始めて、1ヌクレオチドの無キネシンの適切な濃度のmantATPを混ぜる。注：反応物は混合時に50％に希釈する。混乱を避けるために（ すなわち、3.0 / 1.5μM）前と後の両方の混合ヌクレオチド濃度をメモしておいてください。 </li><li>指数関数プラスマント基（ すなわちの退色を考慮するために一定の負の傾斜のラインにmantATPの各濃度で測定された蛍光強度の変化を取り付け、蛍光を0 .EXP（K OBS .T）+（メートル=。トン+ 0は振幅であるc）は、k個の実測値は、速度定数であり、tは、） 図3Bおよび議論を参照の時間である。これらのフィットから決定するmantATPの各濃度の速度定数（k OBS）。各k個の OBSが会合および解離速度定数（ 図1、K 1およびk -1）の畳み込みである。 </li><li> （ 例えば 、図3C）mantATP濃度に対してk個の OBSをプロットすることによって会合及び解離速度定数をデコンボリューション。勾配とy軸切片を得るために、一次関数（ すなわち、k個の OBS = k 1は [mantATP] + K -1）にこれらのデータを合わせる。勾配は単位M -1 s -1のとmantATPアソシエーション（ 図1で、k 1）についての速度定数を表す。切片は、s -1（考察を参照）の単位を有する解離速度定数（ 図1 で、k -1）を表す。注：この方法はまた、ADPの結合および解離を決定するために適用することができる塩基としてmantADPを使用して速度定数（ 図1で、k -4およびk 4）。 </li></ol> mantADPための解離速度定数（3）測定<ol><li>適切な反応緩衝液中の2μMキネシンの溶液に（ 例えば、80 mMのPIPES pH6.9、1mMのMgCl 2を 、1mMのEGTAは、0.1％のTween20）、50μMのmantADP（最終濃度）を追加します。 </li><li> 30分間25°Cのでインキュベートする。 </li><li> G-25セファデックスカラムを用いて選択された反応緩衝液中にキネシンを交換バッファによって過剰mantADPや他のフリーのヌクレオチドを​​取り外し、製造者の指示に従って（材料のリストを参照してください）​​。キネシンモータードメインは現在、mantADPをロードする必要があります。 </li><li> 365 nmのストップフロー蛍光計で励起波長を設定し、ロングパスフィルタを使用して&gt; 400 nmで放射された光を集める。 </li><li> 50倍以上のモラでmantADP.kinesin複合体（〜1μM）をミックスストップフロー蛍光光度（ 図4Aおよび4B 挿入図 ） を使用して、1（v / v）の比：1の非標識ATPのr個の過剰。 </li><li>マントグループの光退色を考慮するために、単一の指数関数に加えて一定の負の傾斜のラインに時間をかけて観察された蛍光強度の減少（ すなわち、蛍光= 0 .EXP（K OBS .T）+（m.t +フィットc）に示すように、0は振幅であり、k個のOBSは速度定数、tは時間である、 図4Bおよびディスカッション）を参照してください。このフィットから決定のk obsは、sの単位で、ADPの解離の速度定数（ 図1、K 4）-1（説明を参照）。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

ここでは、キネシンのヌクレオチド状態間の遷移の動態の観察と分析のためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて迅速な混合方法ストップフローを利用している。このタイプの方法は、結合およびキネシン9-11,13-16のさまざまな解離ヌクレオチドを研究するために広く使用されてきた。記載されている方法は、リン酸の放出を観察します（ 図1、ステップ3）許可されていません。しかし、ストップフロー蛍光は蛍光強度の変化17に結合するために、リン酸の産生をリンセンシングタンパク質を使用することによって、この移行を観察するために使用することができる。タンパク質に結合した場合、一般的に蛍光強度の増加を呈する小フルオロフォアmethylanthraniloyl（マント）で標識された使用ヌクレオチドを​​、提示される方法。 R上の2 &#39;または3&#39;位のいずれかにコンジュゲートまた、マントのフルオロフォア、ibose、多くの場合、ヌクレオチド9-12の結合、解離または加水分解にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。マント標識ヌクレオチドは、商業的供給源（材料のリストを参照されたい）から容易に入手可能であり、単一異性体8まで精製の ​​際には迅速に再平衡として2 &#39;、3&#39;結合体の混合物として提供される。マント標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド結合および解離の動態を観察することが可能な優れたレポーター分子を作る。 蛍光標識ヌクレオチドの使用が記載されたアッセイのうち読み取りが蛍光強度の実時間変化であることを意味している。これは、試薬の迅速な混合及びその後の反応に伴う蛍光の変化をリアルタイムで観察できるストップフロー蛍光に対するこれらのアッセイに最適です。検出の方法として、混合技術と蛍光としてストップトフローの組み合わせが比較的サンプルエフあるシステムを作り出すficient。たとえば、 図3Cに示すデータを取得することは、0.8が必要- 、精製されたキネシン13の1.0 mgのMCAK、及び図4Bに示すデータを取得するために、精製〜キネシン13 0.3mgの、MCAKを必要とする。フルオロフォアとしてマントの使用の1つの欠点は、それが光退色する傾向があることである。これは、ストップフローにおいて、キネシンの非存在下で、反応緩衝液でマント標識ヌクレオチドの溶液を混合することによってキネシン反応速度から分離して観察することができる。マント基は漂白なるにつれて蛍光強度の遅い減少が観察される。マントグループの光退色を記載されたプロトコルで使用されるタイムスケールの範囲にわたってよく線形関数によって記述される。したがって、光退色のためのデータを修正する簡単な方法は、線形関数（ すなわち 、メートル+ c）のではなく、単一のパラメータによって記述より一般的な平らなベースラインにより記述ベースラインと指数関数にフィットすることである。 mantATPバインディング mantATPの会合および解離速度定数微小管の非存在下におけるキネシンヌクレオチド結合部位に結合したままで（第2節）、ADPを測定する場合、削除する必要があります。これはmantATPの会合および解離（ 図1、ステップ1）は、ADPの解離か ​​ら分離して観察することができます。これを達成するためにキネシンは、ヌクレオチド結合部位（ステップ2.1）上のEDTAの少なくとも50倍過剰とインキュベートする。 EDTAはMgが2 +、ヌクレオチド11の放出をもたらすヌクレオチド結合ポケットから解離させるのMg 2 +イオンを封鎖する。実施することは、2.1のステップしたがって、 - 2.3、それが2 +のMgを含まない緩衝液を使用することが重要です。ヌクレオチドフリーキネシンタンパク質は、遊離ヌクレオチドからおよびEDTAの両方からそれを分離するために交換されるバッファである。この分離、使い捨ての重力流れGEを達成するためにlの濾過カラム（材料のリストを参照）に十分なものであり、シンプルで使い迅速である。ヌクレオチド無料キネシンとmantATPの相互作用は、結合および解離速度定数（ステップ2.8）のデコンボリューションを可能にするためにmantATP濃度（ステップ2.4​​）の範囲で行われる。このタイプの実験の背後にある理論は、1つのウェルがmantATPの最低濃度で始まるこれらの実験を行う際の基準18に記載されている。これは、異なる濃度の間の洗浄ステップの必要性を削除します。これは、おそらくmantATP濃度が増加するにつれて、ストップフロー蛍光光度計の感度を調整する必要がある。 mantATP濃度は常に疑似一次条件下を維持するためにキネシンヌクレオチド結合部位の濃度よりも少なくとも5倍過剰に存在する必要があります。 mantATPの濃度が増加するにつれてしかし、信号の変化が減少キネシンに結合するヌクレオチドの割合として圧倒さになり得る。 Therefo再、キネシンの濃度もmantATPの濃度は、ヌクレオチド結合部位（ステップ2.6）上の10倍モル過剰よりも大きくなることはありませんようにmantATPのそれぞれの新しい濃度​​で増加している。 mantADP解離 mantADPための会合および解離速度定数はmantATP（セクション2）について記載した同じ方法によって決定することができるが。キネシンからのADPの解離を直接mantADP（ステップ3.1〜3.3）を有するヌクレオチド結合部位をプリロードすることによって観察することができるmantADP.kinesin複合体は、非標識ATP（ステップ3.5）を超えると混合される。過剰の非標識ATPはキネシンにmantADPの再結合を防止し、それによって解離反応（ 図1、K 4）mantADPの関連付けから分離して観察することができます。このアッセイにおいて、非標識ATPの濃度は、NUCの少なくとも50倍モル過剰でなければならない結合部位をleotide。このアッセイの背後にある理論は十分にこの直接法は、ステップ2.8に記載されたy軸に外挿より一定の解離速度のため、より正確な値を与える基準18に記載されている。 微小管を含める 記載された方法はまた、微小管の存在下でヌクレオチド結合及び解離の動態を決定するために用いることができる。 図3Bと4Bの下、注射器：微小管は、先行ストップフローでの混合に注射器を含むヌクレオチドに導入される （ 挿入図 ）。この構成では、キネシンは微小管を満たすと同時にヌクレオチドを​​満たす。安定化された微小管は、チューブリン重合体の寿命は、安定化化学物質、のいずれかの使用によって拡張される場合、使用されているような &#39;グアノシン-5などのタキソール、または非加水分解性GTP類似体、など - [（α、β） -methyleno]三リン酸（GMPCPPは、材料のリストを参照してください）​​。これは、液体窒素9,19で何ヶ月も保存することができる微小管を作るためにGMPCPPでチューブリン重合の2つのサイクルを使用することが可能である。あらかじめ準備された微小管の使用は、これらのアッセイを実行する際に実際的な困難を軽減します。アッセイにおける微小管を含めるためには、微小管の安定性に適した反応緩衝液を使用することが重要である。選択のバッファーは80 mMのPIPES pHを6.9、1 mMのMgCl 2および1mMのEGTA（BRB80として知られている）20,21を含む最も一般的に使用されるバッファーでベースPIPES、です。 記載の方法は、キネシンの使用に限定されないが、任意のヌクレオチド結合タンパク質に適合し、適用することができる。例えば、同様の方法は、分子モーター12,22のミオシンファミリーのメンバーのATPターンオーバーサイクルに適用されており、マント標識グアノシンヌクレオチドの使用は、さらに拡張しこのタイプの方法は、タンパク質23,24を加水GTPする。

キネシンは、高度に保存されたモータードメイン1によって特徴付けられるタンパク質のスーパーファミリーである。キネシンモータードメインは、ヌクレオチド依存的に微小管と相互作用する。キネシンファミリーのメンバーは、微小管の動態2,3を制御する非転位微小管の端結合キネシンと微小管に沿っ向かう形で貨物を運ぶトランスロケーションキネシン、、、から関数の範囲を表示します。 キネシンは微小管細胞骨格4-6との相互作用を調節するためにアデノシン-5'-三リン酸（ATP）の売上高を使用しています。 ATP、ADP、ADP.Piあるいは全くヌクレオチドが結合することができます（ 図1）：微小管のためのキネシンモータードメインため、その親和性のコンホメーションは、その塩基の状態に依存します。キネシンの分子メカニズムを理解するために、ATPの代謝回転と微小管の相互作用との関係の理解が必要である。ザ·reforeは、キネシンの分野における主要な目標は、微小管の存在下および非存在下で異なるヌクレオチド状態と、それらの両方の間の遷移の動態の機能的特性を特徴付けることである。 <img alt="図1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg"> キネシンのための最も簡単なATPターンオーバーサイクル1図は、4つの可能な状態で構成されています。ヌクレオチドフリー（Φ）、ATP結合、ADP.P iは結合型とADP結合 4遷移のそれぞれは、前進することを特徴とすると。逆方向速度定数（k xおよびkはそれぞれ-x）。 ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解するためには、microtubが存在しない場合に速度制限され、ATPターンオーバーサイクルのどの段階を決定する必要がありますその後ulesとサイクルは、微小管の存在によって変化する方法を決定します。最も単純なATPターンオーバーサイクルは4つの個別の化学物質のステップで構成されています（1）ATPが空の部位に結合する（Φは空のサイト、 すなわち、ヌクレオチドのないキネシンを表す）; （2）ATP開裂; （3）リン酸解離、（4）ADP解離（ 図1）。律速段階は完了し、ATPターンオーバーサイクルの速度定数を設定します。そのため、個別の遷移の各測定され、完全なサイクルの速度定数と比較する必要があり律速となるステップを決定する。全体的なATPターンオーバーサイクル速度定数を測定する方法がここに記載されていないが、ここでは参考7に見ることができる、個々の化学工程のための速度定数を決定することができる方法を記載している。塩基加水分解タンパク質のターンオーバーのサイクルで個別の遷移を研究するために利用可能な方法がいくつかあります。ここで紹介する方法はadvantagを取るフルオロフォアmethylanthraniloylで標識されたヌクレオチドの性質のeは、通常、タンパク質8に結合すると蛍光強度の変化を表示するマントと呼ばれる。その小さなサイズは、リボース（ 図2A）に結合されたとき、それは一般にヌクレオチド結合または加水9-12の動態にほとんど又は全く影響を及ぼさない、ことを意味するためマントグループが使用されている。ここでは、キネシンのATPターンオーバーサイクルでヌクレオチド結合および解離の観察を可能にするストップフロー蛍光と併せてマント標識ヌクレオチドの使用を記述するプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>2'/3'-(N-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'三リン酸&nbsp;</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>#NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2'/3'-(N-メチルアントラニロイル)アデノシン-5'-ジリン酸&nbsp;</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>#NU-201</td>マン<td>トADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>ロシュ</td><td>#10519979001</td><td>ATPの二ナトリウム塩は100の濃度に作られています&nbsp;mM in 100&nbsp;mM MgCl2。濃度は、260&nbspの吸収によって確認する必要があります。nm(e=15,400&nbsp;M-1cm-1)。溶液は-20&nbsp;oC.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP120-500</td><td>0.5&nbsp;水中のMストック溶液、pH 8.0。危険:吸入すると有害な粉末。</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>メルフォード</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp;水に溶かしたMストック溶液を新鮮にしたもので、その日のうちに使用することができます。危険:粉末は、吸入したり、皮膚に接触したりすると有害です。</td></tr><tr><td>NAP-5</td>カラム <td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex樹脂重力流ゲルろ過カラム</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>GTPの非加水分解性アナログ</td></tr><tr><td>停止流量蛍光計&nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td> 観測<td>キュベット内で試薬を急速に混合できる配管を一部取り付けた蛍光計です。これにより、~0.1&nbsp;-&nbsp; の時間スケールでの反応の速度論が可能になります。100°C監視対象の sec。</td></tr></tbody></table>

キネシンのatpターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

微小管関連モータータンパク質キネシンスーパーファミリーは、両方のは、ATPを加水分解し、微小管を結合し、特徴的なモータードメインを共有しています。キネシンは、ATP売上高のと微小管の相互作用の両方のスーパーファミリー間での違いを表示します。これらの違いは、そのような貨物輸送、微小管滑り、微小管脱重合と微小管の安定化などのさまざまな機能に対して特定のキネシンを調整。キネシンの作用機序を理解するためには、ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解することが重要です。 ATPターンオーバーサイクルを分析するために、1つのアプローチは、サイクル内の個別のステップを可視化する蛍光標識ヌクレオチドを​​利用することである。 ATPターンオーバーサイクルにおける各ヌクレオチドの移行の動力学を決定することは、完全なサイクルの律速段階またはステップを識別することができる。キネシンのためには、律速段階を知ることが重要であるキネシンは、微小管と相互作用する場合、微小管が存在しないことは、このステップは、一般的に数千倍に加速されるように。微小管の非存在下でのサイクルは完全にキネシンのATPターンオーバーサイクルを理解するために、微小管の存在下でのそれと比較する。個別のヌクレオチド転移の動力学は、一般的に手動で、特に微小管の存在下で、反応物質を混合することによって観察するにはあまりにも高速である。そのような速度は数ミリ秒ほど少しの時間スケールで観察することを可能にするストップフロー蛍光光度計など、急速な混合装置は、そのような遷移を監視するために使用することができる。ここでは、ストップトフローによる試薬の迅速な混合は、キネシンのATPターンオーバー周期を分析するために蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて使用​​されるプロトコルを説明する。

マント群の蛍光強度の増加は、典型的には、キネシンにマント標識ヌクレオチドの結合の際に観察される。しかし、このような信号変化の大​​きさは、問題の特定のキネシンに依存する。したがって、動的アッセイに進む前に、蛍光強度変化の存在および大きさの両方を確認するために平衡測定を行うことが有用である。 mantATPとmantADPための代表的な蛍光スペクトルは、溶液中およびキネシン-13との複合体の両方において、MCAKは、 図2Bに示されている。これらのデータは、MCAKに結合するとmantATPとmantADP両方で表示される蛍光強度の増加を強調表示します。キネシンにマントヌクレオチドの結合時の蛍光強度の変化は、ATPとADP（セクション2および3）の両方の結合および解離を報告するために使用される。 MCAKの場合には、蛍光強度の差はmantATP.kinesinとmantADP.kinesinの間で観察され 図3Aは、ヌクレオチドを含まないキネシンとmantATPを混合した際に発生する反応を示している。キネシン13にmantATPの結合の際に発生する蛍光強度の増加を示す代表的なデータを、MCAKは、 図3Bに示されている。 図3Bに示されるタイプのデータがmantATP濃度の範囲で収集される。 mantATP濃度に対して決定される速度定数（k個の 実測値 ）のプロットは、 図3Cに示されている。線形関数にこれらのデータをフィッティング（ すなわち、k個の OBS = K 1 [mantATP] + K -1）は OBSを （2.8ステップ）kに貢献する速度定数のデコンボリューションすることができます。したがって、会合およびmantATPの解離速度定数（ 図1で、k 1とkの両方の決定を可能にする-1それぞれ）。 図4Aは、非標識ATPを過剰のmantADP.kinesinを混合した際に発生する反応を示している。 図4Bのデータは、キネシン-13、MCAKから解離によりmantADPのために観察された蛍光強度の減少を示している。指数関数（ステップ3.6）にこのデータをフィッティングすることによりmantADPの解離のための一定の割合が直接決定される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg"> フルオロフォアmethylanthraniloyl（マント）で標識した図2ヌクレオチドは、ATPターンオーバーサイクルにおける個別のステップを単離するために使用される。リボース上の位置2 'または3'のいずれかにコンジュゲートマントフルオロフォアの位置を示すmantATPの（A）の構造図（B）の溶液（MAXP）におけるmantATPとmantADPための正規化蛍光スペクトルとmantATPキネシンMCAK（MATP + MCAKとMADP + MCAK）との複合体中のd mantADP。 mantATPスペクトルは、溶液中でmantATPための最大の蛍光とmantADPスペクトルに正規化され、溶液中mantADPのために、最大で蛍光に正規化されている。 MCAKと混合マントヌクレオチドのスペクトルは、1分後の混合で収集される。などのプロトコルに記述されている試薬および蛍光光度設定の濃度が1.1および1.2のステップ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg"> mantATPの会合速度定数の図3の測定。 （A）図は、ストップフローによって適所ポストミキシング起こる反応を描いた：mantATP（MATP）は、ヌクレオチドのないようにキネシンをバインドします。タンパク質への結合の際にマント基が増加する蛍光強度（B）の蛍光シグナルの変化（黒）MCAK（5 MのνとmantATP（25 M）を混合する際に観察さcleotideフリー）。このデータは、単一指数関数プラスマントフルオロフォアの光退色を占める一定の負の傾き、（説明を参照）の行に（赤点線）適合している挿入図：前ストップフロー蛍光光度に混合するシリンジの内容。ヌクレオチドフリーMCAKとmantATPの反応のために決定され、（C）の速度定数（k個のOBS）は mantATPの濃度に対してプロットした。このプロットは、M -1 sの単位で会合速度定数（ 図1、k は1）である勾配を-1とy切片は解離速度定数である（ 図1 で、k -1）とを有する直鎖領域を有する。秒の単位で-1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 。mantADPがプリロードキネシンは、非標識ATPの過剰に希 ​​釈されています。mantADPの解離速度定数の図4。測定は、（A）は回路図ストップフローによって適所ポストミキシング起こる反応を描いた。解離しmantADPことによりmantADPアソシエーション（説明を参照）の逆反応を防止し、未標識ATPによって置き換えられている。キネシンMCAKからmantADPの解離の際に観察マント基がタンパク質から解離により減少する。（B）蛍光の減少の蛍光強度。蛍光シグナル（ブラック）（説明を参照してください）​​マント·グループの退色を考慮するために単一指数プラス定数負の傾きの直線に適合（破線赤）です。決定された速度定数はmantADP（図1、kの解離についての速度定数である4） 挿入図 ：ストップフロー蛍光光度に混合する前にシリンジの内容<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

微小管の相互作用のサイクルに結合されたATPターンオーバーのサイクル：キネシンは微小管を有するヌクレオチド依存性相互作用によって特徴付けられる。ここでは、蛍光標識されたヌクレオチドおよびストップフロー蛍光を用いキネシンのATPターンオーバーサイクルにおける個別のヌクレオチド遷移の動態を分析するためのプロトコルを記述している。

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

この手順の全体的な目標は、キネシンの A TP ターンオーバーサイクル中のヌクレオチド結合と解離の動力学を測定することです。これは、まず、ヌクレオチドを含まない、または蛍光標識されたヌクレオチドを充填したキネシンタンパク質を調製することによって達成されます。次に、調製したキネシンを停止流量蛍光計を用いてヌクレオチドと混合し、蛍光標識ヌクレオチドの結合または解離に伴う蛍光の変化を観察します。次に、蛍光の変化を指数関数に当てはめて、速度定数を取得します。最後に、測定されたレート定数は委譲され、レート定数はA TPターンオーバーサイクルの特定の遷移に起因します。最終的には、蛍光標識されたヌクレオチドと停止したフロー蛍光の組み合わせを使用して、ヌクレオチドの結合と解離の速度論を測定します。CIN この手順を実演するのは、ポスドクのJennifer Patelと、私の研究室の大学院生であるHannah Belchです。テキストプロトコルに概説されているように、ヒト標識ヌクレオチドをマグネシウムフリーバッファー中の最大20マイクロモルのキネシン溶液に結合したときのキネシンの蛍光強度を決定した後、1ミリモルのEDTAおよび1ミリモルのDTTでマグネシウムフリーバッファー中の最大20マイクロモルのキネシン溶液をインキュベートし、溶液を摂氏25度で15分間インキュベートし、グラビティフローG 25 SXゲルろ過カラムをセットアップし、マグネシウムフリーの少なくとも3カラム容量で平衡化します。バッファ。次に、エッシン溶液をカラムにロードして、キネシンから遊離ヌクレオチドとEDTAを分離します。空のチューブに100ミリモルの塩化マグネシウム溶液を容量で追加し、塩化マグネシウムの最終濃度が1ミリモルになるように、収集チューブを修理します。キネシン溶液を採取した後、適切なマグネシウムフリーバッファーを使用して、キネシンを迅速に溶出します。採取チューブ内に塩化マグネシウムが含まれていると、カラムからイアンがキネシンを氷上に保存し、1〜2時間以内に使用した直後にキネシンを安定化するのに役立ちます。その間に、TP濃度シリーズを男性に準備します。キネシンの利用可能な濃度に応じて濃度の範囲を選択してください。TPのマントの各濃度について、標識されたヌクレオチドがキネシンヌクレオチド結合部位よりも5〜10倍モル過剰になるように、適切な濃度のキネシンを調製します。停止流量蛍光計の励起波長を365ナノメートル、発光波長を400ナノメートル以上にロングパスフィルターで設定します。次に、最低濃度のマンタTPから始めて、停止フロー蛍光計を使用して、マンタTPとヌクレオチドフリーキネシンを1対1の容量対体積比で混合します。次の式を使用して、蛍光強度測定値の変化を近似し、マントA TPの濃度を指数関数に教え、さらにマント基の光退色を説明するための一定の負の傾きの線を当てはめます。これらの適合から、マントの各濃度で速度定数を決定します。次に、TPは、マントの濃度に対してコップスをデンタルフロスすることにより、会合速度と解離速度を委譲します。TP 次に、これらのデータを線形関数に当てはめて、勾配と y 軸の切片を取得します。勾配は、人間の速度定数を表し、TPはモル/秒あたりの単位とのTP関連を表します。切片は、1秒あたりの単位との解離率定数を表します。解離速度定数を測定するには、DPを2マイクロモルキネシンの溶液に50の適切なバッファーで発酵させます。マイクロモルとは、摂氏25度で30分間のDPインキュベーターを意味しました。G 25 Sedexカラムを使用してキネシンからフレマントA DPを除去し、マントA DPを充填し、このビデオで前述したようにストップフローフレーターを設定した後、停止したフローを使用して、マントA DPキニン複合体を50倍以上のモル過剰の非標識A TPと混合し、1対1の体積対体積比で適合させます。時間の経過とともに観察される蛍光強度の単一の指数関数への減少と、グループの光退色を可能にするための一定の負の傾きの線。この近似から決定される kops は、マント A DP を 1 秒あたりの単位で解離する速度定数です。マントレーウッドヌクレオチドの結合または解離によるシグナル変化の大きさは、特定のキネシンに依存します。したがって、最初に平衡測定を実行して、蛍光強度変化の存在と大きさの両方を確認することが有用です。蛍光スペクトルはTPを発酵させ、キネシンM CACの溶液中および複合体中のDPを意味したのがここに示されている。この図は、TPとヌクレオチド遊離キネシンをヒトに混合したときに起こる反応を示しています。ここでは、マンA TPをM CACに結合したときに発生する蛍光強度の増加を示しており、マンに対する速度定数に適合しています。ここで見られるように、線形関数へのTP濃度は、kopsに寄与するレート定数のデコンボリューションを可能にし、A TPを発酵させる会合および解離率スタンスを提供する。この図は、ここに示すように、M CECから分離したときに観察された発酵A DPの蛍光強度の低下を示しています。キネシンからのマントA DPの解離の速度定数は、このデータを指数関数に当てはめることによって決定されます。これらのプロトコルを習得すれば、それぞれ3時間以内に完了することができます。この方法はキネシンに関する洞察を提供しますが、ミオシンやGタンパク質などの他のヌクレオチド結合タンパク質にも適用できます。このビデオを見れば、蛍光標識されたヌクレオチドとストップフローメーターを使用して、キネシンのヌクレオチド結合と解離の動力学を測定する方法について十分に理解できるはずです。

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