キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

この手順の全体的な目標は、キネシンの A TP ターンオーバーサイクル中のヌクレオチド結合と解離の動力学を測定することです。これは、まず、ヌクレオチドを含まない、または蛍光標識されたヌクレオチドを充填したキネシンタンパク質を調製することによって達成されます。次に、調製したキネシンを停止流量蛍光計を用いてヌクレオチドと混合し、蛍光標識ヌクレオチドの結合または解離に伴う蛍光の変化を観察します。

次に、蛍光の変化を指数関数に当てはめて、速度定数を取得します。最後に、測定されたレート定数は委譲され、レート定数はA TPターンオーバーサイクルの特定の遷移に起因します。最終的には、蛍光標識されたヌクレオチドと停止したフロー蛍光の組み合わせを使用して、ヌクレオチドの結合と解離の速度論を測定します。

CIN この手順を実演するのは、ポスドクのJennifer Patelと、私の研究室の大学院生であるHannah Belchです。テキストプロトコルに概説されているように、ヒト標識ヌクレオチドをマグネシウムフリーバッファー中の最大20マイクロモルのキネシン溶液に結合したときのキネシンの蛍光強度を決定した後、1ミリモルのEDTAおよび1ミリモルのDTTでマグネシウムフリーバッファー中の最大20マイクロモルのキネシン溶液をインキュベートし、溶液を摂氏25度で15分間インキュベートし、グラビティフローG 25 SXゲルろ過カラムをセットアップし、マグネシウムフリーの少なくとも3カラム容量で平衡化します。バッファ。次に、エッシン溶液をカラムにロードして、キネシンから遊離ヌクレオチドとEDTAを分離します。

空のチューブに100ミリモルの塩化マグネシウム溶液を容量で追加し、塩化マグネシウムの最終濃度が1ミリモルになるように、収集チューブを修理します。キネシン溶液を採取した後、適切なマグネシウムフリーバッファーを使用して、キネシンを迅速に溶出します。採取チューブ内に塩化マグネシウムが含まれていると、カラムからイアンがキネシンを氷上に保存し、1〜2時間以内に使用した直後にキネシンを安定化するのに役立ちます。

その間に、TP濃度シリーズを男性に準備します。キネシンの利用可能な濃度に応じて濃度の範囲を選択してください。TPのマントの各濃度について、標識されたヌクレオチドがキネシンヌクレオチド結合部位よりも5〜10倍モル過剰になるように、適切な濃度のキネシンを調製します。

停止流量蛍光計の励起波長を365ナノメートル、発光波長を400ナノメートル以上にロングパスフィルターで設定します。次に、最低濃度のマンタTPから始めて、停止フロー蛍光計を使用して、マンタTPとヌクレオチドフリーキネシンを1対1の容量対体積比で混合します。次の式を使用して、蛍光強度測定値の変化を近似し、マントA TPの濃度を指数関数に教え、さらにマント基の光退色を説明するための一定の負の傾きの線を当てはめます。

これらの適合から、マントの各濃度で速度定数を決定します。次に、TPは、マントの濃度に対してコップスをデンタルフロスすることにより、会合速度と解離速度を委譲します。TP 次に、これらのデータを線形関数に当てはめて、勾配と y 軸の切片を取得します。

勾配は、人間の速度定数を表し、TPはモル/秒あたりの単位とのTP関連を表します。切片は、1秒あたりの単位との解離率定数を表します。解離速度定数を測定するには、DPを2マイクロモルキネシンの溶液に50の適切なバッファーで発酵させます。

マイクロモルとは、摂氏25度で30分間のDPインキュベーターを意味しました。G 25 Sedexカラムを使用してキネシンからフレマントA DPを除去し、マントA DPを充填し、このビデオで前述したようにストップフローフレーターを設定した後、停止したフローを使用して、マントA DPキニン複合体を50倍以上のモル過剰の非標識A TPと混合し、1対1の体積対体積比で適合させます。時間の経過とともに観察される蛍光強度の単一の指数関数への減少と、グループの光退色を可能にするための一定の負の傾きの線。

この近似から決定される kops は、マント A DP を 1 秒あたりの単位で解離する速度定数です。マントレーウッドヌクレオチドの結合または解離によるシグナル変化の大きさは、特定のキネシンに依存します。したがって、最初に平衡測定を実行して、蛍光強度変化の存在と大きさの両方を確認することが有用です。

蛍光スペクトルはTPを発酵させ、キネシンM CACの溶液中および複合体中のDPを意味したのがここに示されている。この図は、TPとヌクレオチド遊離キネシンをヒトに混合したときに起こる反応を示しています。ここでは、マンA TPをM CACに結合したときに発生する蛍光強度の増加を示しており、マンに対する速度定数に適合しています。

ここで見られるように、線形関数へのTP濃度は、kopsに寄与するレート定数のデコンボリューションを可能にし、A TPを発酵させる会合および解離率スタンスを提供する。この図は、ここに示すように、M CECから分離したときに観察された発酵A DPの蛍光強度の低下を示しています。キネシンからのマントA DPの解離の速度定数は、このデータを指数関数に当てはめることによって決定されます。これらのプロトコルを習得すれば、それぞれ3時間以内に完了することができます。

この方法はキネシンに関する洞察を提供しますが、ミオシンやGタンパク質などの他のヌクレオチド結合タンパク質にも適用できます。このビデオを見れば、蛍光標識されたヌクレオチドとストップフローメーターを使用して、キネシンのヌクレオチド結合と解離の動力学を測定する方法について十分に理解できるはずです。