位置選択的微粒子銃は、改変された遺伝子銃を使用した器官型脳切片におけるターゲティング

この手順の目標は、遺伝子銃を使用して、器官型スライスの異なる領域を迅速かつ効率的にトランスフェクションまたは標識することです。これは、最初に脳または他の組織の生存可能な器官型スライスを準備することによって達成されます。2番目のステップは、生物送達のためのDNAまたは解読された金粒子を生成することです。

次に、器官型スライスを安定化遺伝子ガンマウントの下に配置し、被覆粒子aを組織またはエピソーム形質転換または標識中に発射する。最後のステップは、単離された領域に送達された異種遺伝子の影響を観察または分析することです。最終的に、このアプローチにより、ユーザーは臓器スライスの異なる領域にさまざまな異種遺伝子を正確にトランスフェクションすることができます。

この方法が既存の方法よりも優れている点は、バイオロジスティックスにより、終末分化細胞のトランスフェクションが可能になり、作用半径を小さな直径に制限できることです。この方法は、単一の遺伝子の地域的寄与の理解など、神経生物学的な重要な問題を理解するのに役立ちます。この手順は、新鮮な脳を小さなレシピエント型に入れることから始めます。

室温より少し高い温度に呼ばれているARO溶液でそれを覆います。次に、型を氷の上に置いて摂氏4度まで急速に冷却します。アロスがセットになったとき。

5〜10分後、arosに埋め込まれた脳を型から取り出します。その後、フィブロスライサープラットフォームに接着します。その後、プラットフォームを滅菌済みの氷冷PBSを含むVibraスライサーチャンバーに移します。

スライス後、スライスを6マルチウェルトレイの細胞培養インサートにそっと置き、インサートの外側に培養培地を置きます。それらを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素でインキュベートします。この手順では、最初に50マイクロリットルの0.05モル精子aineと10マイクロリットルのDNAを1ミリリットルあたり1ミリグラムで10ミリグラムの金粒子に追加することにより、直径40ナノメートルの金粒子を使用してナノ発射体を準備します。

次に、溶液混合物に塩化カルシウムを添加して、DNA分子の金ナノ粒子への結合を助けます。その後、シリンジで溶液をチューブに引き込みます。チューブをチューブ準備ステーションに置きます。

金の粒子が沈殿するのを待ちます。その後、吸引によって仰臥位をシリンジで取り除きます。チューブを回転させて、金の粒子を均等に広げます。

その後、毎分5リットルの一定の窒素流下で粒子を乾燥させます。DNA弾を作成するには、チューブカッターを使用してチューブを1センチメートルにカットします。次に、それらをすぐに遺伝子成長カートリッジに挿入するか、滅菌ラミナフローフードで使用するまで摂氏4度で乾燥させたままにし、DNAコーティングされた金を含むカートリッジをカートリッジホルダーにロードします。

次に、ホルダーを遺伝子銃に装填します。滅菌鉗子を使用して、改変遺伝子銃身を取り付けます。器官型スライスを含むフィルターインサートを滅菌プラスチック皿に入れます。

器官型スライスから培地を取り除きます。次に、マウントを使用してガス圧を50PSIに設定します。遺伝子導入のために、スライスの所望の領域から10ミリメートル上の距離に遺伝子銃を置きます。

次に、バレルの中央を慎重に狙い、コーティングされた粒子を組織に発射します。バイオティックトランスフェクション後、スライスをPBSで2回優しく洗浄します。次に、PBS中の4%氷冷PFAで20分間インキュベートしてスライスを固定します。

その後、スライスをPBSで2回洗います。再度、スライスを乱さずにメスを使用してメンブレンをインサートからそっと切断します。次に、鉗子付きの顕微鏡スライド上にメンブレンサポートを置き、器官型スライスをその上に置きます。

次に、スライスにマウントメディアを1滴追加します。カバースリップを組織に直接触れないように、そっと置きます。その後、カバースリップをマニキュアの薄い層で固定します。

この図は、6週齢のマウスの器官型スライスへの蛍光タンパク質コードDNAの生物的送達を示しています。ここで見られるように、ビキニ層と小脳の分子層の界面に顕著な樹状突起の港を持つビキニニューロンは、P-E-G-F-P-N oneによる一過性の生物的トランスフェクション後に顕著な標識を示しています。これは棘のある樹状突起の高倍率であり、これは海馬のca one領域に見られるパラメタル細胞です。

PDSレッドFPコーティング金ナノ粒子のバイオティックデリバリー後 一度習得すると、この手順の後3〜4日間で数時間でこの技術を実行することができます。共焦点顕微鏡などの他の方法を使用して、特定のニューロンが隣接する領域にどのように接続されているかなどの追加の質問に答えることができます。