万HeLa細胞でエピジェネティックプロファイルを生成するためのChIP-seqの実験の自動化

この手順の全体的な目標は、わずか10, 000個の細胞でクロマチン免疫沈降実験を実行できる自動化されたプラットフォームを研究者に提供することです。これは、まずクロマチン免疫沈降用の高品質の剪断クロマチンを調製することによって達成されます。第2ステップでは、自動クロマチン免疫沈降実験を作成し、免疫沈降DNAを用いて自動ライブラリを実行します。

免疫沈降したDNAは、定量PCRと次世代シーケンシングによって解析されます。最終的に、自動化技術の成功は、元の10, 000細胞サンプルで生成されたクロマチン免疫沈降シーケンスプロファイルと、100, 000細胞および参照用の既存のデータセットで行われた実験との比較を通じて検証することができます。この方法は、エピジェネティックな分野における重要な疑問に答え、さまざまな組織における特定のバイオマーカーの機能についての理解を深めるのに役立ちます。

発達段階と病状。この手法は、健康と疾患のエピジェネティックなバイオマーカーを特定するのに役立つため、複数の疾患の診断に影響を及ぼします。自動化技術は、特定の細胞タイプ、亜集団、生検のエピジェネティック解析において、研究者にとって重要なツールです。

標準的な自動クロマチン免疫沈降実験では、まず、100万〜200万個の細胞から100マイクロリットルの剪断クロマチンに120マイクロリットルのクロマチン免疫沈降バッファーHを添加し、インプットサンプル用に2〜20マイクロリットルのクロマチンを確保します。次に、IP star compactで自動実験を設定するには、プロトコルを選択し、クロマチン免疫沈降アイコンをクリックします。クロマチン免疫沈降直接法を選択し、次の画面でクロマチン免疫沈降200マイクロリットルプロトコルを選択し、サンプル番号を指定します。

抗体コーティングのクロマチン免疫沈降実験パラメータを4時間に設定します。免疫沈降ステップは15時間、各洗浄ステップは5分です。その後、レイアウト情報画面の指示に従って試薬をセットし、適切な試薬と高度にバリデーションされたChIP-seqグレードの抗体を添加してください。

次に、各反応に20マイクロリットルのタンパク質、Aコーティングされた磁気ビーズを加え、オーバーナイトチッププロトコルと逆架橋が終了した後のクロマチンサンプルを添加します。磁気ビーズベースのDNA精製キットでDNAを精製します。高感度の市販の蛍光測定法アッセイを使用して、免疫沈降DNAを定量します。

次に、少なくとも1つのポジティブコントロールおよび1つのネガティブコントロールゲノム領域にプライマーを使用する。免疫沈降DNAの品質を、分析材料の適切なパラメータに従って定量PCRで分析します。結果は、プロトコルに基づく次世代シーケンシングの入力の回復率として表されます。

次に、ライブラリ調製アイコンをクリックし、好みのライブラリ調製技術を選択し、レイアウト情報画面の指示に従って試薬をセットアップします。例えば、この実験では、遺伝子発現に関連する6つの異なるヒストン修飾のシーケンシングプロファイルが生成されました。これらのヒストンマーカー間で観察される高いピーク相関は、自動化システムが正確で信頼性の高いデータを生成する能力を示しています。

さらに、これらのグラフは、特定のゲノム領域におけるさまざまなヒストン修飾のピークの分布を示しています。最後に、細胞数が少ないサンプルの自動クロマチン免疫沈降実験では、先ほど示したように、自動化システム上で自動クロマチン免疫沈降200マイクロリットルのプロトコルを設定します。次に、ChIP-seq、グレードの抗体および試薬をシステムにロードし、タンパク質のわずか10マイクロリットルを使用して10, 000から100, 000細胞の間のクロマチン量に働きかけるように最適化し、各反応のためのコーティングされた磁気ビーズ。

チップ後、ライブラリ調製を実行し、micro plexライブラリ調製プロトコルを選択し、レイアウト情報画面に表示される指示に従って試薬をセットアップします。10, 000細胞開始サンプルからのクロマチン免疫沈降のこの代表的な定量的PCRでは、ポジティブコントロール領域における抗ヒストン抗体による有意な濃縮およびネガティブコントロール領域における無視できるシグナルが観察された。ここでは、手動のクロマチン免疫沈降実験と比較して、再現性があり、高い比較が可能な10種類の免疫沈降反応を示しており、手動免疫沈降と比較して、実験の変動性に目に見える増加がなく、低細胞量で動作する自動システムの能力を示しています。

これらのデータは、10, 000および100, 000の配列ライブラリのバイオインフォマティクス分析を示しています。彼はクロマチン免疫沈降後のS3細胞であり、低細胞数のクロマチン免疫沈降サンプルから優れた結果を示しています。このデータセットは、出発物質の10, 000細胞を用いた実験に対応しており、100, 000細胞データセットとBroad Institute参照データセットの両方によって確認される信頼性の高い濃縮ピークを伴う低バックグラウンドノイズを含んでいます。

エンコードプロジェクトでは、10, 000セルのデータは、終了コードプロジェクトで使用される有意なスコアによってランク付けされたピークの最良の40%の98%のオーバーラップ率で、ブロード研究所のデータとほぼ同一のピークを示していることに注意することが重要です。IP star自動化システムは、オペレーターの介入を最小限に抑え、クロマチン免疫沈降のハンズオン時間をわずか1〜2時間に短縮します。さらに、自動化されたプロセスは、手動のクロマチン免疫沈降の多数のエラーが発生しやすいステップを置き換え、非常に一貫性のある結果を提供します。

この手順を試行する際には、優れたクロマチン免疫沈降と、特異性が高く感度の高い抗体の適切な選択が実験の成功の鍵であることを覚えておくことが重要です。この技術は、生物学のあらゆる分野の研究者が治療の精度、再現性、一貫性を向上させる道を開きました。エピジェネティクス研究。