Name: 多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン WNT5Aゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ多発性嚢胞腎疾患のゼブラフィッシュモデル構築法。WNT5Aノックダウンにより腎嚢胞形成を誘導し、蛍光顕微鏡で観察します。Tg(wt1b:GFP)系統を用いた遺伝学的操作と発生学的解析の手法を習得できます。

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この作品は、NIH（JHLにLH、およびDK069909とDK047757にDK093625）およびVA（JHLに優秀賞I01BX000820）によってサポートされていました。私たちは本質的な支援を提供するためのペンシルベニア州ゼブラフィッシュコアの大学の博士マイケル·パックと博士傑彼に感謝したいと思います。

注：倫理に関する声明：すべてのゼブラフィッシュの実験は、イースタンバージニアメディカルスクールの施設内動物管理使用委員会によって承認された。 1.モルホリノ準備<ol><li> （ 図1A）を製造者の指示に従って、目的の遺伝子のための設計と合成する翻訳ブロッキング（AUG-）及びスプライス抑制（スプライス）アンチセンスモルホリノ（MO）オリゴヌクレオチド。 表1に、メーカーの情報を参照してください。 注：MOは、ガラスびんで凍結乾燥されたストックとして出荷されています。 </li><li> 25μgの/μlの最終濃度にMOを再懸濁するためにガラス瓶にハイグレードの滅菌水を追加します。オリゴヌクレオチドが完全に溶解していることを確認します。いくつかの固体のままの場合は、簡単に5から10分であり、渦65℃で株式オリゴヌクレオチド溶液を含むバイアルを加熱し。 </li><li> RTでMO原液を保管してください。 4℃または-20℃で保管しないでください。; Cより低い温度がMOオリゴヌクレオチドは容器壁にバインドするために発生する可能性があるため。分光光度計を用いてストック溶液の濃度を測定する新しいMOストック溶液が作成されるたびに（ 表1を参照）。 </li><li>所望の投与量にハイグレードの滅菌水を用いて原液を希釈することによって、注射の日に、MO作業溶液を準備します。 0.05％の濃度になるように0.5％フェノールレッドを追加する。たとえば、15 NG / NLの濃度の5μlのワーキング溶液を作るために、3μLMO原液と0.5μlの0.5％フェノールレッド水1.5μlに追加します。 注：この作業濃度では、注入の各ドロップ（500 PL）はMOの7.5 ngのが含まれており、2滴は、MOの15 ngのが含まれている。 </li></ol>射出装置の調製<ol><li>購入ガラス事前に引っ張ら針（詳細は表1を参照してください）。あるいは、ガラス注射針w iを引くニードルプラーを番目。 </li><li>空気圧縮機の電源を入れ、50 PSIへの圧力設定を調整します。解剖顕微鏡の光源とピコマイクロインジェクションポンプの電源を入れ、次のように設定を調整：圧力20 PSIを保持、圧力10 PSI、ゲーティングの2.5と100マイクロ秒の範囲の期間値を取り出す。 </li><li>注射液5μlのガラスプレ引っ張ら針をロードし、先端が下向きに垂直な位置に針を置く。すべてのソリューションは、目に見える気泡がで針の先端に到達するまで待ちます。顕微鏡の隣に適切な位置に針ホルダーを配置し、ホルダーにガラス針を挿入します。 45度に噴射角度を調整します。 </li><li>高段オフ、顕微鏡下でビューに針の先端を持参し、先端の最も薄い地域に焦点を当てる。細かい点をピンセットで針の先端を折ります。 </li><li>顕微鏡下側0.15 mmの側の内径定規と毛細管を配置し、液柱を作るために、キャピラリーチューブの一端に溶液を注入する。 1ミリメートル長液柱あたりのすべての17滴に到達するためにイジェクト時間を調整し、その後すべての滴の体積は1 NL滴の（滴体積=πX半径2×長さ（液柱の）/数（）である。 NOTE：直径0.1mmの低下は約500 plの（滴体積= 4/3 xはπxの半径3）の注入量を与える。 </li></ol>モルフォリノ3.受精ゼブラフィッシュ胚の作製と注入<ol><li>標準のゼブラフィッシュの飼育と維持のために公開されたプロトコルに従って、トランスジェニックゼブラフィッシュの繁殖ペア：Tgは（GFP wt1b）を設定します。自然スポーン後の胚を収集し、およびE3水で満たされた10センチメートルペトリ皿（5mMのNaClを、0.17mMのKCl、0.33のCaCl 2、0.33 mMのMgSO 4）しに保管してください。すぐに13 MO注入を開始します。顕微鏡下で胚の形態を監視し、MO注入がワンであることを確認してください細胞期または4細胞期よりも遅くない。 <ol><li>と10cmのペトリ皿に胚を移しトラフ寒天くさび形。余分E3水を吸引し、優しく谷に胚を押してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で1細胞期胚を可視化するためにマイクロピペットを持つ胚を操作します。絨毛膜その後卵黄（=500μlの1滴）にMOの1つまたは2つの液滴を注入する卵黄を貫通する。 E3水で10cmのペトリ皿に注入した胚を移し、28.5℃でインキュベートする。 </li></ol></li><li>注射の後、死んだ胚を除去し、注入した胚の数を記録。ディッシュごとに24〜48時間でE3の水を交換してください。 </li></ol> 4.表現型レスキュー実験<ol><li>異なる主要塩基対構造（通常は3-7塩基対のミスマッチ）を有し、救助、したがって、MOに耐性のある別の種由来の相同分子種を選択する。例えば、この実験では、我々は選択したマウスマウスWnt5aの mRNA配列は、ゼブラフィッシュ配列とは異なるからです。 </li><li>翻訳サイトで開始するフォワードプライマーとmRNAコード領域の末端に近いにおけるリバースプライマーとのプライマーセットを設計します。フォワードプライマー配列の5 &#39;末端にT7プロモーター配列を付加する。この実験では、以下のプライマー配列を使用する。フォワード：5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTAタグGGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA A-3 &#39;と逆：5&#39;- TCA CTT GCA GAC GTA CTG gtc- 3&#39;。 </li><li>上記で設計されたプライマーセット（各プライマー0.5μM）、以下のPCRプログラムを使用してマウスのWnt5a cDNA配列を含有する0.1μgのテンプレートDNAを50μlのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う：95℃で5分間の1サイクル。 95℃（30秒）、58.5℃（30秒）、72℃（1分）の35サイクル。 7分間の72℃での最終伸長ステップを。 </li><li>トンを終えた後彼は、サイクル、バンドは右のサイズであることを確認するために1％アガロースゲルでPCR産物2μlのを実行します。製造業者の説明書に従ってPCR精製キットでPCR産物を精製する。分光光度計を用いてDNA濃度を確認してください。 -20℃で精製したPCR産物を保存したり、次の工程に直接キャップ化RNA転写に使用します。 </li><li>製造業者の説明書に従ってキャップ化RNA合成キットでキャップされたmRNAをin vitroで合成する。 20μlのRNaseを含まない水にmRNAを希釈し、濃度を測定。 -80℃でRNAと店舗を分注し。 </li><li>注射の日には、RNaseを含まない滅菌水でmRNAのワーキング溶液を準備する。 40 PGは、RNAの非特異的または毒性作用が発生しないで、最高のRNA量が一般的であることに注意してください。氷の上で作業溶液を保管してください。 MOその後救助mRNAと胚を注入、または両方一緒に共同注入する。例えば、mRNAのpreparの濃度場合各注入のステップ4.5でEDは0.08μgの/μlの最終濃度を作るためにRNaseを含まない水の4.33μlにするmRNA（0.4μgの）の0.67μlを添加、0.6μgの/μLで、その後1滴（500 PL）は40 PGが含まれていますmRNAの。ステップ3で説明したようにMOを準備します。 </li></ol>蛍光イメージングのために注入した胚の5準備<ol><li> 28.5℃のCO / Nインキュベーション後、蛍光顕微鏡を用いて前腎構造の観察に影響を与えるメラニン化を防止するE3水に0.003％のN-フェニルチオ尿素（PTU）を追加する。それは初期胚発生に影響するので、原腸形成の前にPTUを追加しないでください。 </li><li> 48 HPFでは、手動で微ピンセットで胚をdechorionate。光解剖顕微鏡下で48と72 HPFの胚の画像を取る。 注：これらの写真は、麻酔なしで撮影することができます。 </li><li>約10分後、蛍光顕微鏡で撮像するにそれらを置くことによって胚を麻酔する前160μgの/ mlで含む10センチメートルシャーレトリカイン緩衝。 5〜10分間待ってから、軽く、彼らが移動しないため、麻酔が動作していることを確認するためにゼブラフィッシュをタッチします。 </li><li>胚は麻酔をした後、3％メチルセルロースにそれらをマウントします（ 表1を参照してください）解剖顕微鏡下で腹臥位でそれらを向ける。 </li><li>蛍光顕微鏡下で前腎の構造を観察した（ 表1を参照してください）と、異なる倍率（10倍と20倍）で写真を撮る。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多発性嚢胞腎（PKD）は、ヒトにおける末期腎疾患の主要な原因の一つであり、進行性の嚢胞形成、腎肥大、および異常な尿細管発生14によって特徴付けられる。常染色体優性PKD（ADPKD）ポリシスチン1（PC1）、またはPKD2、符号化ポリシスチン2（PC2）、多嚢胞性腎臓で結果をコードする、PKD1どちらのどの突然変異の遺伝的疾患である。多くの他の遺伝子、一次繊毛に見出さ特にコードするタンパク質は、腎嚢胞の発症に関与すると考えられ、これまでのところ、これらの遺伝子をスクリーニングするための理想的なツールは存在しない。我々はゼブラフィッシュにおける遺伝子ノックダウン後に腎嚢胞形成を観察するために迅速かつ簡単な方法を説明します。この方法は、おそらく他の候補PKD遺伝子をスクリーニングすることができる。 この技術の強みの一つは、その単純です。 Tgは（wt1b：GFP）でゼブラフィッシュ、GFPの発現は、特定なっている、糸球体、尿細管とダクト内にあるLY適切なモデルは、全体の前腎腎臓の構造を研究する。 Tgは（wt1b：GFP）ゼブラ...

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）胚は広く腎臓発生および多発性嚢胞腎疾患を研究するためのモデルとして使用されている。遺伝的相互作用を研究することの実現可能性、タンパク質のノックダウン、迅速胚の多数のアッセイの機会、および器官の表現型を表示するのを容易にするためのアンチセンスモルフォリノ（MO）を使用する能力：動物モデルとしてゼブラフィッシュを使用することには多くの利点がある幼虫1を生きて。前腎 ​​は脊椎動物で開発した最初の腎臓で、幼虫のゼブラフィッシュ2で機能的である。ゼブラフィッシュ前腎の構造は哺乳類の後腎、哺乳動物で開発するための3番目と最後の腎臓に比べて比較的簡単である。ネフロンが困難単一ネフロンの構造を観察すること、500,000-1,000,000ネフロン3,4及び約13000ネフロン5をそれぞれ有するマウス腎臓の間にそれぞれ含むヒト腎臓を、腎臓の作業単位でのinは、ヒトまたはマウスの腎臓。ゼブラフィッシュは2ネフロンがあり、各ゼブラフィッシュネフロンは、マウスとヒト6と類似した特殊な腎細胞型の糸球体と尿細管で見つかったすべての主要なコンポーネントが含まれています。それはクローズドシステム7を有しているので、このようなアフリカツメガエルなどの他の脊椎動物のモデルと比較すると、ゼブラフィッシュネフロンはより密接に哺乳類のネフロンに似ている。 近年では、ゼブラフィッシュのゲノムは、遺伝的なツール、広範な変異リソース、およびゼブラフィッシュモデルにおけるトランスジェニックレポーターラインのコレクションの幅広い導入を可能にする、配列決定されている。 12-72時間後に受精（ゼブラ）との間のゼブラフィッシュの前腎形態は透明な胚で容易に可視化することができる。ウィルムス腫瘍タンパク質WT1は、腎臓の開発のために不可欠な要素である。 wt1bプロモーターのTg（wt1b：GFP）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインはGFPのexpreを示すssionは、具体的には17 HPF 8から始まる、ゼブラフィッシュ胚で前腎領域に位置する。 Nephronophthisis（NPHP）、常染色体劣性嚢胞腎疾患は、NPHP遺伝子9の突然変異によって引き起こされる。モルホリノによるノックダウンNPHP4はTgは（wt1b：GFP）で嚢胞形成を引き起こした。魚10したがって、このトランスジェニック魚は腎臓開発中に腎臓の構造と嚢胞形成を観察するのに適したモデルです。重要なのは、腎臓発生の調節因子の影響は、時間と労力効率的な方法でこの株を使用して研究することができる。 遺伝子変調後の腎嚢胞形成を可視化するモデルとして魚：私たちの論文は、Tgは（GFP wt1b）の使用が記載されている。我々はゼブラフィッシュにおけるWNT5A遺伝子をノックダウンするスタート-とスプライス部位アンチセンスMOを使用。 Wnt5aのは、様々な器官および細胞出生後の発達に重要な役割を果たしているWntファミリーの非標準的な分泌糖タンパク質である機能11。 Wnt5aのは、尿細管伸長時の指向細胞分裂において役割を果たしていることが見出されている平面内細胞極性（PCP）経路を含む非カノニカルWnt経路を介して機能する。 Wnt5aのはさらに、それによってVangl2安定性12を推進し 、VANGL平面細胞極性タンパク質2（Vangl2）と複合体を形成することにより、Wnt5aのシグナルを伝達するチロシンキナーゼ（RYK）のような受容体と複合体を形成することによってWntシグナル/ PCP経路を調節する。 PCP経路における欠陥は、ランダムな細胞分裂を生じ、腎嚢胞形成を引き起こす可能性があります。 WNT5Aノックダウン以下の腎嚢胞形成を観察するためにゼブラフィッシュの行：私たちは、Tgは（GFP wt1b）を使用した。 Tgは（wt1b：GFP）ゼブラフィッシュモデルは、ライブイメージングと腎臓の構造のタイムリーな観察 ​​を可能にする。 WNT5Aノックダウンした後、腎嚢胞形成は24 HPFから始まる発見された。 72 HPFで、嚢胞は糸球体と近位尿細管で見つけることができた。この方法は、sに使用することができる腎嚢胞形成を引き起こす可能性のある他の遺伝子をcreen。

<table><tbody><tr><td>0.5% フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td>P0290</td><td>注射用カラーインジケーター</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td><td>(カスタマイズ)</td><td>関心のある遺伝子に合わせてカスタマイズ設計</td></tr><tr><td>プリプルドニードル</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td> 大量の<td>ニードルが必要な場合は、ニードルプラーを購入し、ラボでニードルを準備することもできます</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>レスキュー実験のためのキャップ付きmRNAを作るためのin vitro転写用</td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>メラニン化防止用</td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>シグマ</td><td>A5040</td><td>エチル3-アミノ安息香酸とも呼ばれ、ゼブラフィッシュ麻酔用</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Σ</td><td>M-0387</td><td>ゼブラフィッシュの位置&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>キャップRNA合成のためのPCR産物の精製用。</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR</td></tr><tr><td>タグ用 DNA ポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度計</td><td>用 Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>モルフォリノおよびRNA濃度測定用</td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>Werther International, Inc.</td><td>パンサーコンパクト106</td><td>インジェクション用空気源</td></tr><tr><td>ピコマイクロインジェクションポンプ</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ社</td><td>PV830 プネマティック・ピコポンプ</td><td>その他のタイプのマイクロインジェクションシステムを使用することができます。</td></tr><tr><td>マイクロマニュプラター</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>右利き用(左利き用MMJL)</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>マイクロマニピュレーション用針を保持するため</td></tr><tr><td>デュモンピンセット</td><td>ファイン手術用ツール</td><td>11253-20</td><td>針先を折るための</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカM205C&nbsp;</td><td></td><td>ゼブラフィッシュの胚の観察とイメージング</td></tr><tr><td>用 Fluorscence顕微鏡</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>ゼブラフィッシュ前腎毛</td></tr><tr><td>細血管(内径0.15mm)</td>のイメージング用<td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>注入液滴の体積を測定するため</td></tr></tbody></table>

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン wnt5aゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

多発性嚢胞腎(PKD)は、末期腎疾患の最も一般的な原因の一つであり、治療法のない壊滅的な疾患です。PKDにおける嚢胞形成の分子メカニズムはやや不明ですが、多くの遺伝子が関与していると考えられています。Wnt5aは、幅広い発生過程を制御する非標準的な糖タンパク質です。Wnt5aは、腎尿細管細胞の伸長中に配向性細胞分裂を調節する平面細胞極性(PCP)経路を介して機能します。PCP経路の欠陥は、腎嚢胞形成を引き起こすことがわかっています。本論文では、wnt5a遺伝子をwnt5aアンチセンスモルフォリノ(MO)オリゴヌクレオチドでノックダウンすることにより、ゼブラフィッシュ嚢胞腎モデルを開発する方法について述べています。Tg(wt1b:GFP)トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、wnt5aノックダウン後の腎臓構造と腎嚢胞を可視化した。2つの異なるアンチセンスMO(AUG-およびスプライスサイト)が使用され、どちらもwnt5aノックダウン後にカーリーテールダウン表現型と嚢胞形成をもたらしました。一次塩基対構造の違いによりMOに耐性を持つマウスWnt5a mRNAの注入により、異常な表現型が救出され、表現型がモルフォリノの「オフターゲット」効果によるものではないことが実証されました。この研究は、ゼブラフィッシュモデルを使用して腎臓のwnt5a機能を研究することの有効性を支持しています。

Wnt5aのノックダウンは、1細胞期のゼブラフィッシュの胚にMO（8月-MO）またはエクソン/イントロン境界スプライスMO（スプライス-MO）をブロック翻訳を導入することによって達成された。 8月-MOは、開始コドンを標的とし、したがって、母体および接合体WNT5Aメッセージの両方を阻害する。スプライス-MOは、第三のスプライスドナー部位を標的とWNT5A（ 図1A）の唯一の接合体の転写を阻害する。 AUG-及びスプライスモルファントは中テールダウン体軸と心膜水腫（ 図1B）を含む、複数の欠陥が互いにphenocopied。マウスWnt5aのmRNAは、部分的に表現型がオフターゲット効果によるものではないことを実証し、モルファント表現型（ 図4B）を救う。 Tgは（wt1b：GFP）、GFPはwt1bの内因性発現を再現するようwt1bプロモーターによって駆動されるGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、前腎構造の概要を説明するために使用された。 <e...

私たちは、多発性嚢胞腎の可能なゼブラフィッシュモデルを生成する方法を記述します。Tg(wt1b:GFP)魚を用いて腎臓の構造を可視化した。wnt5aのノックダウンはモルフォリノ注射によるものであった。このGFPトランスジェニックゼブラフィッシュでは、wnt5aノックダウン後の前腎嚢胞形成が観察されました。

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン WNT5Aゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

次の実験の全体的な目標は、多発性嚢胞腎の可能なゼブラフィッシュモデルを生成することです。これは、トランスジェニックWT one BGFPゼブラフィッシュ胚のWind five Aに対してmorphを1細胞期に注入することによって達成されます。次に、マウスのWint five A Mr.Nnaを、Wint five a morphoを用いてマイクロインジェクションによるレスキュー実験を行います。次に、注入された胚は、腎臓の構造と嚢胞形成を監視するために、受精後48時間および72時間で麻酔され、埋め込まれます。ウィンドファイブAノックダウン後、結果は、ウィンドファイブAノックダウンが、腹臥位腎構造の蛍光顕微鏡法に基づいて、トランスジェニックWTワンBG FPゼブラフィッシュに腹臥位腎嚢胞形成を引き起こすことを示しています。この技術の意味は、腎臓特有のフッ素タンパク質トランスジェニックの使用で覆われた魚のembolの透明性により、AL生物の腎臓構造を直接見ることができるため、腎臓病のモデルの構築に向けて広がっています。この方法は、ゼブラフィッシュの腎臓嚢胞形成を引き起こすノックダウンを5回勝つための洞察を提供することができます。また、腎嚢胞形成を引き起こすと疑われる他の多くの遺伝子の検査にも適用できます。このプロトコルはシンプルで、時間もかかりません。製造元の指示に従ってモルフォを設計および合成した後、ガラス瓶に高品質の滅菌水を加えて、マイクロリットルあたり25マイクログラムの最終濃度まで完全に再懸濁します。分光光度計を使用して濃度を測定し、注入日に室温でストック溶液を保管し、高品位滅菌水を使用してモルフォスを所望の濃度に希釈し、0.5%フェノールレッドで最終濃度0.05%に次にエアコンプレッサーをオンにし、圧力設定を50siに調整します。次に、解剖顕微鏡の光源とピコマイクロインジェクションポンプの電源を入れ、次のように設定を調整します。5マイクロリットルの注射液を使用して、事前に引っ張られたガラス針をロードし、目に見える気泡がない場合は先端を下に向けて針を垂直位置に置き、針をホルダーに挿入します。射出角度を45度に調整します。針先を顕微鏡で視界に入れ、ステージから高い位置まで移動し、針先の最も細い領域に焦点を合わせます。次に、細いポイントピンセットを使用して針を折ります。ヒント、内径0.15ミリメートルの毛細管を顕微鏡下に置きます。溶液を一方の端に注入します。ピコマイクロインジェクションポンプの吐出時間を、17滴が長さ1mmの液体柱を形成するまで調整します。これにより、一滴あたりの体積は1ナノリットルに等しくなります。トランスジェニックWT one BG FPゼブラフィッシュの繁殖ペアを、標準的なゼブラフィッシュの飼育とメンテナンスに関する公開済みのプロトコルに従ってセットアップします。自然産卵後、胚を採取し、E3の水でペトリ皿に移します。1細胞期と4細胞期の間の胚を使用して、くさび形のオーガートラフを備えた10センチメートルのシャーレに移します。培地を吸引した後、胚をトラフにそっと押し込みます 解剖顕微鏡の下で、胚の向きを合わせて細胞を視覚化します。次に、注射針でコーリアンを貫通し、次に卵黄を貫通して、卵黄にモルフォを1〜2滴注入します。注入した胚をE 3水を入れた10cmのシャーレに移植し、28.5°Cでインキュベートします。表現型レスキュー実験を行うために、注入可能な生存胚の数を記録します。モルフォに耐性のある異なる一次塩基対構造を持つ別の種の遺伝子からオルトログを選択します。この例では、マウスは5つ行きましたAが選択されました。フォワードプライマーは並進開始部位から開始し、リバースプライマーはMR NAコード領域の終わりに近いプライマーセットを設計します。フォワードプライマー配列の5プライムエンドに、プライマーとマウス風を含む1マイクログラムのテンプレートDNAを含むTセブンプロモーター配列を添加します。5つのA-C-D-N-Aシーケンス。50 マイクロリットルの PCR 反応液をセットアップし、ここに示すプログラムを使用して実行します。PCR産物のサイズを確認し、精製し、濃度を確認した後、キャップ付きRNA合成キットを使用して、in vitroでキャップされたmRNAを合成します。製造元の指示に従って、20マイクロリットルのRNAフリー水を使用してMR NAを希釈し、濃度アリコートを決定し、注射の日にRNAを摂氏マイナス80度で保存します。胚への非特異的または毒性の影響を避けるために、40ピコグラム以下の用量を送達するMR NAの作業溶液を準備します。MNA溶液を氷上に保持してモルフォーゼを注入し、次にmRNAを胚に注入するか、溶液を共注入します。翌日、死んだ胚を取り出し、胚がガスを受けたことを確認します。次に、0.003%endフェニルTHREAまたはPTUをE3水に追加して、受精後48時間でメロンを防ぎます。微細なピンセットを使用して胚を手動でコーティングしてから、解剖顕微鏡を使用してすぐに画像を撮影し、受精後72時間で蛍光顕微鏡でイメージングする約10分前に、緩衝トリカのマイクロリットルあたり160マイクログラムを含む10センチメートルのペトリ皿に胚を配置して胚を麻酔します。3%メチルセルロースを使用して胚をマウントし、解剖顕微鏡で腹臥位に向けます。次に、10倍と20倍の倍率の画像を使用します。蛍光顕微鏡風下での胚の5Aノックダウンは、翻訳ブロッキングモルフォ(UGモルフォまたはエクソンイントロボーダースプライスモルフォとも呼ばれる)をゼブラフィッシュ胚に導入することによって達成された。1細胞期では、A UG morphoは開始コドンを標的とするため、母体と接合子の両方のwinfivea発現を阻害します。スプライスモーフは、第3のスプライスドナー部位を標的とし、winファイブAの接合転写産物のみを阻害します ここで示したように、A UGとスプライスモルヒネのフェノは、カーリーテール、ダウンボディ軸、心膜浮腫などの複数の欠陥で互いにコピーしました。この図は、マウスが5 a mRNAがモーフ表現型を部分的に救出したことを示しており、ここに示されているオフターゲット効果によるものではないことを示しています。トランスジェニックWT one BGFP魚は、WT one Bプロモーターによって駆動されるGFPを発現し、profic構造を概説します。魚は、受精後48時間で風5回目のノックダウン後に糸球体嚢胞の形成を示しました。フェノールレッドのみを注入した対照魚は、受精後72時間で横方向に伸びる尿細管を持つU字型の融合糸球体を形成する正常な傾向のあるフリックの発達を示しました。糸球体構造は血管ループでさらに発達し、A UGとスプライスモルフ注入胚の両方が糸球体と近位管に嚢胞を発症しました この図に見られるように、受精後72時間の横行組織切片のHNE染色、モラント胚は嚢胞形成、糸球体構造の破壊、および腎管の拡張を明らかにしました。このビデオを見た後、風老化のノックダウンによる嚢胞腎の可能な老年期モデルを開発し、インフルエンザレポートのフェイスラインでシステム形成を観察する方法を十分に理解しているはずです。遺伝子変異がゼブラフィッシュの腎嚢胞形成をもたらすことが実証されれば、腎嚢胞形成の詳細なメカニズムを調査するためのさらなる実験を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、生理的に、関連する高感度で特異的な開発のための体系的なアプローチを提示...

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。...

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

ゼブラフィッシュは、高等脊椎動物との遺伝的類似性から、発生生物学およびヒト疾患研究のための強力なモデルシステムです。このプロトコルは、初期胚形成に不可欠な遺伝子の劣性突然変異を特定するためのフォワードスクリーニング戦略に利用できる一倍体ゼブラフィッシュ胚を作成する方法論を説明しています。...

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生過程とモデルヒト疾患を研究するための優れた実験的な生物である。ここでは、読み出しをホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）とゼブラフィッシュ胚で手動ハイスループット化学画面を実行する方法についてのプロトコルを記述します。...

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ1を記述する。...

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。...

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。...

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。...

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

このプロトコルは、腎毒性物質としてシスプラチンを使用して、成体ゼブラフィッシュに急性腎損傷(AKI)を誘導する手順を記述する。この技術の再現性を評価するステップと、腎組織、フローサイトメトリー、TUNELの炎症と細胞死を分析する2つの技術を詳述した。...

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

学ぶ多発性嚢胞腎疾患のゼブラフィッシュモデル構築法。WNT5Aノックダウンにより腎嚢胞形成を誘導し、蛍光顕微鏡で観察します。Tg(wt1b:GFP)系統を用いた遺伝学的操作と発生学的解析の手法を習得できます。

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン WNT5Aゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

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