導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

次の実験の全体的な目標は、レンチウイルスベースの再プログラムされた因子を含まないヒト誘発多能性幹細胞を誘導し、これらの細胞を推定臨床グレードの条件に変換することです。これは、まず、成人の皮膚ヒト線維芽細胞を、単一のexサイズレンチウイルス幹細胞カセットまたは幹細胞カーでHI PSCに再プログラミングすることによって達成されます。次に、再プログラムされたHI PSCをアデノクリーpurrウイルスに曝露して、宿主ゲノムからステムカーを完全に切除および除去します。

その後、フィーダーフリーのHI PSCからゲノムDNAを抽出し、続いてAGUEL分析を行い、適切なステムカー切除を確認します。最後に、ファクター3のH IPCは、完全に定義されたゼノフリー条件への低速変換法により、推定GMPグレードの条件に変換されます。最終的に、ヒト成人の真皮線維芽細胞のウイルスベースのリプログラミングとH IPCの臨床グレードの条件への完全な変換は、成人ヒト細胞を再プログラミングし、それらを臨床的に関連性のある状態に変換するためのこの方法論の広範な適用性を強調しています。

この技術の意味するところは、ヒト人工多能性幹細胞の臨床応用にも及び、完全に因子を含まず、臨床グレードの条件に変換されるため、ヒトの治療薬と互換性があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、リプログラミング切除および臨床グレードの変換ステップを学ぶのが難しいため、因子3および臨床グレードのヒト誘導多能性幹細胞の解凍を開始するために従わなければならない主要な複雑で特定の手順のために学ぶことが困難です。成体の皮膚ヒト線維芽細胞またはHAFを摂氏37度の水浴中で2分間

バイアルの上部を水に沈めないように注意してください。1ミリリットルの細胞スラリーを15ミリリットルのクロニクルバイアルに入れて細胞を再懸濁し、DMSOを滴下して希釈します。あらかじめ温めたハフ中型遠心分離機4ミリリットルをゆっくりと加え、バイオレットをGの200倍にして室温で10分間待ちます。

次に、sup、nacent、reusを吸引します。0.2%ゼラチンに6ウェルプレートプレコの1つのウェルにミリリットルあたり100、000細胞に中型の細胞を懸濁します。細胞懸濁液を2ミリリットル加え、次に2ミリリットルの懸濁液を2ミリリットル加えます。

まあ、感染の多様性を測定するために、またはMOIの岩石をプレートを左右に前後に動かして細胞を均等に分布させた後、加湿チャンバー内で摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。24時間後、細胞を数えた後、8つの形質導入ユニットまたは同等のレンチウイルス濃縮物のSを2倍に解凍し、ハフメディウムを使用して10の1倍に希釈しますトランスフェクション試薬の1ミリリットルあたり8マイクログラムを補充した半媒体を使用して、ミリリットルあたり8 TSに。感染率の10倍で細胞を形質導入します。

形質導入ウェルを均一に混合し、レンチウイルス形質導入の約24時間後に一晩インキュベートします。ハフ培地を取り外し、標準的なヒト多能性幹細胞またはPSC培地と交換します。6日目に2日目から6日目に毎日培地を2枚に0.2%ゼラチンコーティングされた10センチ皿1.5〜1.75回10枚に6匹のマウス胚性線維芽細胞を補体成分因子1またはCF1マウス由来のマウスに7日目に半培地で交換する。

再プログラムされた線維芽細胞の6ウェルプレートのうちの1ウェルに室温トリップを追加します。彼女は細胞をそっと持ち上げ、新鮮なヒトPSC培地プレートでGを100倍回転させ、すべての細胞を1対16の比率で2つの10センチメートルCFIメスプレートに回転させます。骨材を時計回りのらせん状に分配し、約48時間インキュベートしてから培地を交換します。

3〜4週間後、21ゲージの針を使用して、典型的なESCのような形態を持つ特定のコロニーの8〜10個の個々の断片を選び、増殖後にCFI MFSの個々のウェルにサブクローンします。添付のテキストプロトコルに記載されているように、幹細胞統合部位を確認した後、胚体形成およびマーカー発現解析により、細胞が多能性であることを確認します。最初に古い人間のPSC媒体を標準のPSC媒体の3ミリリットルに組み合わせて吸引することにより、ステム車を物品税

45マイクロリットルの濃縮アデノクリープールまたはウイルスとトランスフェクション剤のミリリットルあたり8マイクログラム。次に、細胞に加え、インキュベーション後24時間インキュベートし、ウイルスのすりおかし酸を吸引し、ヒトPSC培地を誘導して細胞を2回洗浄します。次に、純粋なマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムのHPSC培地を添加し、5日後に毎日交換し、残りのコロニーをサブクローンして、ビデオの前半で説明したようにそれらを拡大します。

次に、プレEloqua基底膜マトリックスの1バイアルを氷上で解凍し、冷たい基礎培地を最終濃度1〜30に希釈します。ウェルあたり1ミリリットルを使用して、6ウェルプレートのウェル数をコーティングし、プレートを室温で1時間放置します。次に、18ゲージの針を使用して、以前にmesでコーティングされた井戸から少なくとも20〜30のコロニーをクロスハッチします。

プレートからの細胞の浮き上がりと細胞の移動を減らすように注意してください。1時間のインキュベーション後、コーティングされたウェルから200マイクロリットルのピペットでマトリックスを吸引します。古いプレートからコロニーの一部をそっとこすり落とし、新しく組み合わせた培地3ミリリットル(マトリックスコーティングされたプレートに1つ)に慎重に置きます。

48時間インキュベートした後、ポストが切除され、フィーダーフリーで変換されたHI PSCが80%coの流暢さに達したら、毎日培地を交換します。市販のDNA抽出キットを使用して、ステムカーレンチウイルスの外因性組み込みに特異的なここに示すプライマーを使用してゲノムDNAを抽出します。PCRでDNAを分析し、適切な切除を行い、切除後のHI PSCをGMPグレードの条件に移行します。

HPSC複合培地1と臨床グレードのGMP準拠培地または複合培地2を、80〜20のプレウォームから摂氏37度の比率で混合します。細胞から古い結合培地1を吸引し、新しい温かい培地溶液の3ミリリットルと交換します。4日目に適切なコロニーサイズと密度を維持するためにテキストプロトコルに従って継代する3日間毎日培地を交換し、培地を温かい組み合わせ培地1と2の50 50混合物と交換し、3日間インキュベートします。

7日目に培地を毎日交換し、温めた組み合わせ培地1と2をそれぞれ20〜80の比率に切り替え、3日間毎日交換します。10日目は、ウォーム、100%組み合わせたミディアムツーに切り替え、毎日交換します。これで、細胞は完全に定義されたゼノフリー培地に入れられます。

次に、規定のゼノフリー基質を使用して6ウェルプレートの1ウェルをコーティングした後、コンフルエンスセルのウェル内のゼノフリー培地を1つのx岩石を含む新鮮な培地と交換します。1時間インキュベートした後、18ゲージの針を使用して、新たに調製した細胞に細胞を機械的に注入します。よく細胞を2日間邪魔されずにインキュベートさせて、テキストプロトコルに従って細胞を特徴付ける前に最大限の接着を可能にします。

この図は、ステムカーアプローチでステムカーアプローチで再プログラミングした後の3つの異なる切除前H-I-P-S-Cラインの代表的な写真を示しています。ここに示されているのは、切除後の逆転写PCRゲルで、ステムカーレンチウイルスから完全に解放された1つの特定のサブクローンを示しています。この図では、ゼノ含有マトリックス上のプレコン変換された IPC と合成マトリックス上のポスト ゼノフリー GMP グレード H IPC が、SOX 2、OCT 4、nanog などの標準多能性関連因子の定量を示しています。ここでは、QPCR の使用について説明します。

最後に、ここで見られるように、コンコン変換前およびコンバート後のHI PSCをGMPグレードの条件に交換し、フローサイトメトリーを通じて、非ヒト抗原を示すシアル酸およびグリコールニューロン酸を試験しました。このビデオを見た後、ステムコリプログラミングウイルスを使用してヒトの成人皮膚線維芽細胞を再プログラムし、ウイルスをゲノムから切り出し、これらのHI PSCをヒトの治療薬と完全に適合する臨床グレードの条件に完全に変換する方法を十分に理解しているはずです。第3世代の抗ウイルスベクターであるSTACAを使用することは、非常に危険であり、予防策であることを忘れないでください。

この手順を実行する際には、このような適切なPPEとVSLの2つ以上の組織培養室を使用する必要があります。