Name: 導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶ成人皮膚線維芽細胞を用いた無導入因子hiPSCの作製法。レンチウイルスベースのリプログラミングとアデノCreウイルスによるカセット切除、GMPグレードへの変換プロセスを解説。再生医療への応用可能性を示す。

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iPSCの導出と特性評価実験の実施に協力してくださったPatrick C. Lee氏、Cyril Ramathal氏、Saravanan Karumbayaram （SK）に感謝いたします。Aaron Cooper は iPSC 解析実験を行いました。ヴィットリオ・セバスティアーノとレニー・A・レイジョ・ペラは、最初の再プログラミングの取り組みを指揮してくれました。SK、William E. Lowry、Jerome A. Zack、Donald B. Kohnは、臨床グレードのiPS細胞の変換と特性評価を可能にするUCLA GMP施設の設立を指揮しました。Gustavo Mostoslavskyは、STEMCCAポリシストロン再プログラミングベクトルを提供してくれました。この研究は、Fibrocell Science社との共同研究と、安全な個別化細胞治療薬を創出するためのCIDMOD(Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives)イニシアチブに基づいています。この研究は、UCLAのEli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research、The Phelps Family Foundation、Fibrocell Science, Inc.、およびUCLA CTSI Scholar's AwardからJABへの資金提供を受けて行われました。

注：この方法は、内素晴らしいら 10の報告された研究に使用した。 STEMCCA 1.リプログラミング成人ヒト皮膚線維芽細胞<ol><li>解凍成人の皮膚、ヒト線維芽細胞（HUFs）、2分間37℃の水浴中で継代4以下、水とバイアルの上部水没しないように注意しながら。 </li><li> 15mlのコニカルバイアルにヒト線維芽細胞を1mlのスラリーを置き、ゆっくりとジメチルスルホキシド（DMSO）のうち希釈するために、滴下様式で、37℃に予め温めておいた標準HUF培地4mlのを配置し再懸濁細胞。 </li><li>遠心分離を室温で10分間、200×gでバイアル。上清を吸引し、及び/ mlの100,000細胞の懸濁液を作成するために、メディアの適切な容積中で細胞を再懸濁した後、6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットルを追加、0.2％ゼラチンで20分間プレコーティングされた。 注：行当たりのセルの数と同じ数とよく妹と条件がFOを播種する必要があります感染の細胞計数/多重度（MOI）の計算をrを。 </li><li>左右すると前後に細胞を均一に分配するプレート側を揺する。加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で一晩インキュベートする。 </li><li>形質導入の日に、最初のHUFめっき後ウェル（単数または複数）の姉妹から約24時間後に細胞数（s）を得る。 </li><li> 2×10 8 TU、または同等の、レンチウイルス濃縮物（STEMCCA）を行う解凍し、HUF培地で1×10 8 TU / mlに希釈する。 </li><li> 8 / mlのトランスフェクション剤を補充HUF培地中で、10 MOI比で細胞に形質導入​​する。均等に形質導入されたウェルを混合し、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で一晩インキュベートする。 </li><li>レンチウイルス形質導入後の約24時間後には、標準のヒト多能性幹細胞（PSC）を培地にHUFメディアを切り替える。 </li><li>日2〜6日、人間のPSC培地で毎日のメディアを変更。 </li><li> 6日目に、プレートの2 0.2％ゼラチンでコーティングされた10cmのプレートHUF媒体12においてCF1マウス由来の1.5×10 6〜1.75のMEF。 </li><li> 7日目に、注意して、均等にすべてのセルをめっきすることによって、1時16分比率で6ウェルプレート及び通路の1つのウェルから7日目に再プログラミング線維芽細胞をリフトオフする100以上のXG、利用室温トリプシンを遠心分離機にしないMEFの前日に播種した新鮮なヒトPSC培地を有する2つの10cmプレート、。 37°Cで時計回りに螺旋運動と場所で細胞凝集物を分散、5％CO 2で一晩インキュベータに加湿。 </li><li>約48時間後以降のMEFと毎日に再プログラムされた細胞を播種した後、新鮮な培地と一緒に過ごした人間PSCメディアを変更します。 </li><li> 0.2％ゼラチンでコーティングした、個々のウェルの中に特定のコロニーの約8~10個片を配置することにより、3〜4週間後、21ゲージ針で形態のように、典型的なESCとの個々のコロニーをピックアップし、24ウェルプレートに出てサブクローニング24ウェルプレートプレシード人間PSC培地中のCF1マウス由来のMEFとED。 注：採取したコロニーの増殖後、コロニーをタンパク質レベルでの胚様体形成及び多能性マーカーの発現解析によって、多能性として特徴づけされなければならない。 </li></ol> 2.ベクトル統合サイト分析とSTEMCCA切除<ol><li> 10に記載されるように、非限定的な線形増幅PCRによってSTEMCCA組込み部位を分析する。 </li><li>古い人間のESC培地を吸引除去することにより、ゲノム、物品税STEMCCAの所望の領域に1の統合を確実にするためにアッセイすることの後。その後、24時間、標準PSCメディアの3ミリリットルで8 / mlのトランスフェクション剤と濃厚アデノのCre-PuroRウイルスの45μLを兼ね備えています。 </li><li> 24時間のインキュベーション期間の後、混合ウイルス上清を吸引し、ヒトPSC培地で細胞を2回洗浄する。メディア毎日のウィットを変更し、5日間、2μg/ mlのピ​​ューロと一緒に新鮮なヒトPSCメディアを配置H新鮮な培地と抗生物質。 </li><li> 5日後、0.2％ゼラチンでコーティングされたウェル上に21ゲージの針を有するコロニーを、残りのサブクローンは、12ウェルプレートにCF1miceから派生したMEFで予めコーティングし、上記で詳述したように膨張する。 注：凍結ストックを得るために十分な拡張した後、無フィーダー条件への変換が必要です。ほとんどの細胞が正常に形質導入​​されず、インキュベーションの5日間にわたって抗生物質に屈するように少なくとも95％の幹細胞コロニー死を期待する。アデノのCre PuroR因子を含まないコロニーのサンプルをreexposing、感染細胞の宿主染色体への0.001から1パーセントの効率で統合しているがない統合が13を発生していない確認する100％の細胞死を確実にするためにピューロする。 </li><li>マトリックスが液体になるまで約2時間（製造業者の推奨）の期間にわたって、氷上でプレ等分基底膜マトリックス1バイアルを解凍し、冷基本培地中で1：30の最終濃度に希釈するアウト。共同ウェルあたり1mlで6ウェルプレート中のウェルの所望の数で。 1時間室温で放置します。 </li><li> （18ゲージの針を使用して、またはガラスもしくはプラスチック製の「先端」）は、クロスハッチ、少なくとも20〜30個のコロニーよく以前のMEFで被覆されたから。プレートからMEFの高揚と伝達を低減するように注意してください。 <ol><li>滅菌プラスチックピペットチップの簡単な使用のために、火に、より複雑な加熱から、多数の異なるアプローチを介してガラスパスツールピペットの引っ張り、及び仕上げクロスハッチングデバイスを生成するか、私たちの場合のように、 21-および/または18-ゲージの針。 </li></ol></li><li>インキュベーション後にコーティングされたウェルから行列を吸引除去する。 </li><li> 200μlのピペッターで古いプレートから穏やか掻きによってコロニーの部分を削除し、慎重にマトリックスでコーティングされたプレートで新鮮な複合メディア1の3ミリリットルに入れる。 37℃、5％CO 2加湿インキュベーター中で一晩インキュベートする。変化媒体48時間継代後に。 </li><li>市販のDNA抽出キットを使用して、80％以上の密集度で、ポスト切り出し、無フィーダー変換されたhiPSCsからゲノムDNAを抽出します。 </li><li> STEMCCAのレンチウイルスの外因性の統合のための特異的なプライマーとの適切な切除のために分析します。gDNAを-hendo-MycSフォワード、5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNAを-hWPREリバース、5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;。 10μmの原液にPCRグレードの水を用いて凍結乾燥したプライマーを再構成する。 </li><li>以下の5段階のプロトコルを用いてPCRを実行し、3分間95℃での初期変性;以下の各35サイクル：20秒間98℃での変性、15秒間62℃でのプライマーアニーリング、及び15秒間72℃での伸長。 3分間の72℃での単一サイクルの最終伸長が続く。 </li><li>アガロース1.5グラムを秤量し、50mlの1×トリス - 酢酸-EDTA緩衝液中に配置することによって、3％アガロースゲルを作る。アガロースまで、電子レンジを溶解し、PでのDNAゲル染色に配置されているローパー希釈、混合し、室温で1時間凝固させ、ゲルカセットに適切な容積を分配する。 </li><li> PCR産物の負荷12μlを3％アガロースゲルにローディング色素を3μlと混合した。 80 Vで30分間ゲルを実行する</li><li>適切な切除を示すバンドがないことを紫外光を可視化する。 </li></ol>前後の切除したhiPSCsから定量的PCRを用いた遺伝子発現差の3定量<ol><li>商業RNA抽出用キットを用いて、ポスト切り出し、無フィーダー変換されたhiPSCsから全RNAを抽出します。 </li><li>逆転写製造業者の説明書に従って市販のキットを用いて全RNAを1μgまで。アンカーオリゴ（dT）18及びランダムヘキサマープライマーを使用してください。 注：PCRプロトコルは4 KBよりもより多かれ少なかれの遺伝子転写物に合わせて調整されていることを確認してください。特異的プライマーは、いずれかの遺伝子STEMCCAもともと統合Iのために作られる必要がありますNtoを。 </li><li> 20μMストック溶液をPCRグレードの水で凍結乾燥されたプライマーを再構成する。 </li><li>フォワード10μMのUPLプローブ、2Xライトサイクラー480プローブマスター、および20μMで構成され、プライマーを逆反応を20μlあたりのサンプルの5 ngのを使用してください。 </li></ol> GMPグレードの条件に4.コンバージョン<ol><li> GMPグレードの条件にフェイルオーバ後に切除hiPSCsを移行するの初日には、合わせて人間のPSCからなるメディアのブレンドを作るメディア1（複合メディア1）、臨床グレード適正製造基準（GMP）に準拠したメディア（複合メディア2 ）80:20の割合で。 </li><li>吸引物古い複合メディア1とを80:20の比率で新しい複合メディア1及び2、予め温めた3mlのを配置オフ。この特定の比率で3日間、毎日メディアを変更します。バック37℃、5％CO 2インキュベーター中に置き細胞。 </li><li> 4日目に、50：50の割合で混合メディア1と2を作る。古い培地とREPLACオフ吸引除去50:50の比率で複合メディア1及び2を予め温めたメディアと電子。この特定の比は3日間のメディアを変更します。バック37℃、5％CO 2インキュベーター中に置き細胞。 </li><li> 7日目に、20：80の比率で組み合わせたメディア1と2を作る。吸引除去古い培地オフと20:80の比率で組み合わせたメディア1及び2に、予め温めたメディアと交換してください。この特定の比は3日間のメディアを変更します。バック37℃、5％CO 2インキュベーター中に置き細胞。 </li><li> 100比率：10日目に、0で混合メディア1と2を作る。吸引除去古い培地オフと0の組み合わせメディア1及び2に、予め温めたメディアと交換してください：100の比率。この特定の比率で毎日メディアを変更します。細胞は、完全に定義異種非含有のメディアに今ある。バック37℃、5％CO 2インキュベーター中に置き細胞。 注：この全体の変換プロセス中に、18ゲージ針を用いてルーチン継代適切コロニーサイズおよび密度を維持するために必要とされる。 P上のプランコロニーサイズ、フルエンシー、および分化のもとにすべての4から5日間、細胞をassaging。 </li><li>メーカーが推奨するように定義される異種非含有基質と6ウェルプレート中でもコート1。 </li><li>機械的に通過コンフルエントも、すでに18ゲージ針で6ウェルプレートから、異種非含有培地条件に変換する。重要なことは、事前条件メディアに継代する前に、1時間1X ROCK阻害剤を用いて細胞に（組み合わせたメディアは2）新しいメディアを配置。 </li><li>セルに転送されていることを新しいプレートから合成基質溶液を吸引する。旧版からの幹細胞塊を含むすべてのメディアを取り外し、新しいプレートに移す。 </li><li> （一度インキュベータ内部に直接どのような方法でタッチされていない理想的なプレート）バック最小限の物理的擾乱による2日間、37℃、5％CO 2インキュベーター中に置き細胞は最大付着を可能にする。 注：細胞は、毎日のメディアの変更が必要になります。継続的passaginG 4日ごとに重要になります。最適なESC様形態（高い核 - 比）を有するコロニーの一部のみが、21ゲージ針を通路使用。これはよく成長し、最終的に均質なコロニーが得られる適切なhiPSCコロニーのための選択を保証します。コロニーのようなESCの導出に全体的な時間は、初期の複合メディアを変更した後15〜20日の間です。 </li><li> 18ゲージの針を使用して、最初のクロスハッチによりコロニーをすべてGMPグレードのポスト切除hiPSCsダウンフリーズ。 200μlのピペッターを使用してオフにすべてのピースを持ち上げて、4℃で5分間200×gで15ミリリットルコニカルバイアルと遠心分離機に細胞を含むすべてのメディアを転送。 </li><li>細胞は遠心分離されていますが、冷凍メディアは冷たい組み合わせたメディア2等量のからなる7.5％の最終DMSO濃度で凍結培地作る。 </li><li>細胞をペレット化した後、古い培地をオフに吸引し、冷凍メディアでペレットを再懸濁ワイズドロップします。すぐにTRバイアルを凍結し、-80℃の冷凍庫に入れてansfer。 </li></ol> 5.キャラクタライズGMPグレードのポストを切除hiPSCs <ol><li>多能性マーカー、変換後の適切な発現を確実にするために、3 QPCR方法論に従うステップで述べたのと同じ手順で、表1に列挙されたプライマーを使用してキー多能性マーカー（SOX2、OCT4およびNANOG）の発現を定量するためにQPCRを使用してステップ3に記載されているものと同じ手順。 </li><li>使用は、以前に公開10のキットに記載されている標準的な条件に従って、非ヒトシアル酸Neu5Gcを（N -glycolylneuraminic酸）を検出するためにフローサイトメトリー。 </li><li>穏やかに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて細胞を細胞培養プレートを洗浄する。 </li><li>室温で5分間1×解離試薬を用いてコロニーを解離する。 </li><li>ステップ5.4の5分間のインキュベーション時間の間に設けられ、ブロッキング溶液（準備氷冷したPBSでのエージェントのブロッキング0.5％とすることでキット）。 </li><li>フローサイトメトリー分析のためのチューブの以下のセットレーベル：未染色を。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）DAPI。対照抗体1：200;一次抗体1：200。二次抗体を1：200のロバ抗ニワトリのIgG（H + L）。サンプルのMEF。マトリックス上のサンプルのポストを切除細胞;と合成基質上のポスト切除した細胞のサンプル。 </li><li>穏やかに15 mlのコニカルチューブに溶液および転送コンテンツをブロック2 mlを加えることにより、ステップ5.4からの細胞凝集体を取り除く。 4℃で5分間80×gで遠心し。 </li><li>ステップ5.7で述べたようにソリューションや遠心分離機をブロックで細胞を2回洗浄する。 </li><li>静かに各抗体の対応する希釈体積を有するブロッキング溶液100μl中およそ1×10 6細胞を再懸濁する。穏やかが1時間4℃で揺らしながらインキュベートする。 </li><li>ステップ5.8のように洗浄を3回繰り返します。 </li><li>希釈富栄400μlの細胞ペレットを再懸濁1（キットから）ffer：ステップ5.6の下にリストされているように、チューブ2、6、図7、図8のためのDAPIの100。 </li><li> 40μMストレーナーを通してひずみ細胞とは、フローサイトメーターを介して実行。 </li></ol>

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ジェームズ・A・バーン(JAB)とアグスティン・ベガ・クレスポは、フィブロセル・サイエンス社から研究資金を受け取ります。JABはフィブロセル・サイエンス社の科学コンサルタントです。他の著者は、開示すべき競合する利益を持っていません。

私たちは、要因のないhiPSCsを導出し、将来ヒトの治療における下流細胞分化のためのGMPグレードの条件にこれらの細胞を変換することにより、それらが臨床的に関連することの方法論について説明します。このプロトコルは、種々の細胞型に広く適用可能であるが、我々が原因の患者からの抽出の容易さとパーソナライズされたヒトの治療への適用のために、ヒト皮膚線維芽細胞を再プログラムすることにしました。制限は限り臨床的に関連する細胞誘導体への完全な分化が14懸念されるように改善されると、GMPグレードの条件への提示の変換は、さらに、関連する異なる種々の細胞型になるであろう。 この研究の最初の部分はSTEMCCAのレンチウイルスとヒト線維芽細胞を再プログラミングすることを含む。この技術は、その再現性、比較的高い初期化効率（0.02％）、およびヒトにわたって再プログラムする堅牢能力に大部分が選択されたyの異なる細胞型10。この技術は、センダイウイルス、エピソームプラスミド、および低再プログラミングの効率と再現性10苦しむ合成mRNAを基に再...

成体ヒト細胞は、4つの主要な転写因子4,5のレンチウイルスベースの発現の結果として、エピジェネティックなリモデリングとリプログラミングを受ける能力があることが示されています。リプログラミング分野における重要な進歩は、タンパク質発現の正確な化学量論的比を可能にする4つのリプログラミング転写因子すべてを収容する単一の切除可能なレンチウイルス幹細胞カセット(STEMCCA)の使用でした6。さらに、特定の多様な感染範囲で形質導入されると、STEMCCAは、リプログラミングプロセス中に主に単一のゲノム統合イベントを引き起こす可能性があります7。Cre/loxP技術を利用し、幹細胞株の誘導後にリプログラミングベクターを切除するSTEMCCAの切除可能バージョンの導入により、因子フリーのヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)株を導出することが可能になりました8。さらに、ヒトiPS細胞の治療への応用を強化するためには、GMP(Good Manufacturing Practice)グレードの細胞株をゼノ含有状態からゼノフリー状態へ変換するための、迅速で容易に適用可能な新しい方法論を実施する必要がありました。ここでは、統合された遺伝子発現の違い、特にイントロンに統合した場合の遺伝子発現の違いをより正確に評価する関連方法論と、臨床グレードの細胞を推定GMP条件に変換する方法について説明します。
以前の研究では、STEMCCA形質導入後の統合遺伝子の遺伝子発現の違いを分析するために、比較的感度の低いマイクロアレイ転写解析のみを使用していました3,9。ここでは、統合された遺伝子発現の違いをさらに調べるために、高感度定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)解析の方法論を紹介します。重要なことは、現在のセーフハーバー基準では、ウイルスが組み込まれた遺伝子を持つヒトiPS細胞が廃棄されているため、これらの細胞が下流のヒト細胞治療薬に適用できることが制限されていることです9。私たちは、完全に特徴付けられた導入遺伝子を含まないイントロン再プログラムされたhiPSCを使用することで、現状が変わる可能性があることを提案します。さらに、もともとゼノ含有条件下で誘導されたさまざまな細胞タイプに容易に適用できる堅牢なGMPグレードの細胞変換プロトコルを導入します10。これは、ヒトの治療関連性を維持するために臨床グレードの条件を必要とする将来の細胞リプログラミング実験の開発に大きな機会を提供します。
これらの方法論は、現在のセーフハーバー基準を拡張して、統合されたイントロンからのSTEMCCA切除後も正常な遺伝子発現プロファイルを維持する特性評価されたSTEMCCA再プログラムhiPSCラインを含めるための基盤を提供します。また、ヒト以外の動物抗原を含まない臨床グレードの条件に完全に変換することで、以前はゼノを含む条件でのみ再プログラムされ、特徴付けられていた多くの細胞タイプを組み込むのに役立ちます。これらの方法論を組み合わせることで、米国食品医薬品局(FDA)は、限定的な承認をヒト胚性幹細胞(ESC)ベースの治療薬からhiPSCベースの治療薬に拡大することを検討する説得力のある根拠となります11。
私たちは最近、完全に特性評価され、推定される臨床グレードの条件に変換された因子フリーのhiPSC系統の導出を詳述しました10。ここでは、STEMCCAレンチウイルスを利用したhiPSC誘導のプロトコールについて詳しく説明します。次に、これらの幹細胞は切除プロセスを経て、遺伝子発現の特性評価が行われます。最後に、hiPSCは、ゆっくりとした変換法によってGMPグレードの条件に変換されます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">培地および試薬</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (基礎培地)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep、ペニシリン-ストレプトマイシン、100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>4°Cで融解;C、アリコート、&マイナスで保存します。20度;C</td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>4°Cで解凍します。C、アリコート、&マイナスで保存します。20度;C</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td><td>GSR-2001</td><td>10 & micro;0.1% ウシ血清アルブミン中の g/ml ストックを 1x PBS に溶解し、&minus で保存します。80度;C</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア(ビレリカ、マサチューセッツ州、米国)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル(基底膜マトリックス)</td><td>BDバイオサイエンス(サンノゼ、カリフォルニア州、米国)</td><td>356231</td>ストック<td>マトリゲルバイアルを10mlのDMEM / F12で1:2希釈します。アリコートと&minusで保存します。20°C。</td></tr><tr><td>CELLstart (Synthetic Substrate)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche (スイス、バーゼル)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Medium/freezing medium</td><td>Lonza (スイス、バーゼル)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (米国カリフォルニア州ヘラクレス)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン、豚の皮から</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>PBSで0.2%のストックを作り、オートクレーブして室温で保存します。</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ)</td><td>5850</td><td>サプリメント 5x を基本培地と組み合わせ、分注し、4 °Cで保存します。Cは最大2週間。</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>4°Cで解凍します。C O / N、アリコートと4°で保管。Cは最大2週間。</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (Dissociation Reagent)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene/transfection agent</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>VWR (West Chester, PA, USA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>10-cm plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>18-gauge needle</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>21-gauge needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Flow Cytometer</td><td>KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Version 6.1.3 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems (ウィルミントン)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>高純度RNA単離キット</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td><td>Sialix (Newton, MA, USA)</td><td>Basic Pack</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Media</strong</td></tr><tr><td>>Combined media 1</td><td>StemCell Technologies andStemgent</td><td></td><td>は、mTeSR1 と Nutristem</td></tr><tr><td>Combined 培地 2</td><td>StemCell Technologies と Stemgent</td><td></td><td>は、TeSR2 と Nutristem</td></tr><tr><td>HUF 培地</td><td></td><td></td><td>Dulbecco ' を等量ずつ構成しています。修正されたイーグル」10% ウシ胎児血清、1x 非必須アミノ酸、1x グルタマックス、および 1x プリモシン</td></tr><tr><td>ヒト多能性幹細胞培地</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 に 20% ノックアウト血清補充、1x グルタマックス、1x 非必須アミノ酸、1x プリモシン、1x &β;-メルカプトエタノール、および 10 ng/ml 塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培</td></tr>地/F12 [DMEM/F12]。<tr><td colspan="4">DMEM/F12、ダルベッコ'修正されたイーグル」sミディアム/F12;PBS、リン酸緩衝生理食塩水。</td></tr></tbody></table>

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）は、レンチウイルスベースの再プログラミング方法論を用いて生成することができる。しかし、ゲノムの積極的に転写領域内に残っている可能性の発癌性遺伝子の痕跡は、人間の治療への応用1で使用するための彼らの可能性を制限する。さらに、治療に関連する誘導体に幹細胞のリプログラミングまたは分化由来の非ヒト抗原は、ヒト臨床状況2において使用されるこれらのhiPSCsを排除する。このビデオでは、外因性の導入遺伝子の自由要因フリーhiPSCsを再プログラムし、分析するための手順を提示する。これらhiPSCsその後、レンチウイルスを含む特定のイントロンにおける遺伝子発現異常を分析することができる。この分析は、以前に3遺伝子発現の差を検出するために使用されるあまり敏感技術に勝る利点を有する敏感な定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて行ってもよい。への完全な変換臨床グレードの適正製造基準（GMP）の条件は、ヒトの臨床関連性を可能にする。私たちのプロトコルは、別の方法論が提供する現在のセーフハーバー基準による非ヒト抗原にすべての免疫原性リスクを排除する必要があり、人間の治療用途-ためのGMPグレードのhiPSCsを導出するための要因の無特徴付けられたhiPSC系誘導体を、拡張し、含まれることを提供しています。このプロトコルは、任意のタイプのレンチウイルス再プログラミングされた細胞に広く適用可能であり、GMPグレードの条件に再プログラミングされた細胞を変換するための再現性のある方法を提供します。

我々はSTEMCCAレンチウイルスベースの再プログラミングアプローチを用いて、臨床グレードの因子フリーhiPSCsを導出するためのプロトコルを提示する。 図1Aは、MEFの層上STEMCCAアプローチを再プログラミングした後に、三つの異なる予め切除hiPSC系統の代表的な写真を示す。 STEMCCAの再プログラミングアプローチの主な利点は、異なる研究グループと場所で、複数の科学者によって達成一貫性のある再プログラミングの成功にある。 図1Bは、切除後の逆転写PCRゲルを提示し、完全に無料ですつの特定のサブクローン（2.3）を示すSTEMCCAのレンチウイルスから、特定のシーケンスSTEMCCA。 図2Aに内因ための具体的なアンプリコンバンドの欠如によって証明されるように合成マトリックス上にマトリックスとポスト切除した異種非含有GMPグレードのhiPSCsを含む異種の事前変換hiPSCsを示しています。標準の多能性関連因子の定量（SOQPCRを用いて、X2、OCT4およびNANOG）は、</em...

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

次の実験の全体的な目標は、レンチウイルスベースの再プログラムされた因子を含まないヒト誘発多能性幹細胞を誘導し、これらの細胞を推定臨床グレードの条件に変換することです。これは、まず、成人の皮膚ヒト線維芽細胞を、単一のexサイズレンチウイルス幹細胞カセットまたは幹細胞カーでHI PSCに再プログラミングすることによって達成されます。次に、再プログラムされたHI PSCをアデノクリーpurrウイルスに曝露して、宿主ゲノムからステムカーを完全に切除および除去します。その後、フィーダーフリーのHI PSCからゲノムDNAを抽出し、続いてAGUEL分析を行い、適切なステムカー切除を確認します。最後に、ファクター3のH IPCは、完全に定義されたゼノフリー条件への低速変換法により、推定GMPグレードの条件に変換されます。最終的に、ヒト成人の真皮線維芽細胞のウイルスベースのリプログラミングとH IPCの臨床グレードの条件への完全な変換は、成人ヒト細胞を再プログラミングし、それらを臨床的に関連性のある状態に変換するためのこの方法論の広範な適用性を強調しています。この技術の意味するところは、ヒト人工多能性幹細胞の臨床応用にも及び、完全に因子を含まず、臨床グレードの条件に変換されるため、ヒトの治療薬と互換性があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、リプログラミング切除および臨床グレードの変換ステップを学ぶのが難しいため、因子3および臨床グレードのヒト誘導多能性幹細胞の解凍を開始するために従わなければならない主要な複雑で特定の手順のために学ぶことが困難です。成体の皮膚ヒト線維芽細胞またはHAFを摂氏37度の水浴中で2分間。バイアルの上部を水に沈めないように注意してください。1ミリリットルの細胞スラリーを15ミリリットルのクロニクルバイアルに入れて細胞を再懸濁し、DMSOを滴下して希釈します。あらかじめ温めたハフ中型遠心分離機4ミリリットルをゆっくりと加え、バイオレットをGの200倍にして室温で10分間待ちます。次に、sup、nacent、reusを吸引します。0.2%ゼラチンに6ウェルプレートプレコの1つのウェルにミリリットルあたり100、000細胞に中型の細胞を懸濁します。細胞懸濁液を2ミリリットル加え、次に2ミリリットルの懸濁液を2ミリリットル加えます。まあ、感染の多様性を測定するために、またはMOIの岩石をプレートを左右に前後に動かして細胞を均等に分布させた後、加湿チャンバー内で摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。24時間後、細胞を数えた後、8つの形質導入ユニットまたは同等のレンチウイルス濃縮物のSを2倍に解凍し、ハフメディウムを使用して10の1倍に希釈しますトランスフェクション試薬の1ミリリットルあたり8マイクログラムを補充した半媒体を使用して、ミリリットルあたり8 TSに。感染率の10倍で細胞を形質導入します。形質導入ウェルを均一に混合し、レンチウイルス形質導入の約24時間後に一晩インキュベートします。ハフ培地を取り外し、標準的なヒト多能性幹細胞またはPSC培地と交換します。6日目に2日目から6日目に毎日培地を2枚に0.2%ゼラチンコーティングされた10センチ皿1.5〜1.75回10枚に6匹のマウス胚性線維芽細胞を補体成分因子1またはCF1マウス由来のマウスに7日目に半培地で交換する。再プログラムされた線維芽細胞の6ウェルプレートのうちの1ウェルに室温トリップを追加します。彼女は細胞をそっと持ち上げ、新鮮なヒトPSC培地プレートでGを100倍回転させ、すべての細胞を1対16の比率で2つの10センチメートルCFIメスプレートに回転させます。骨材を時計回りのらせん状に分配し、約48時間インキュベートしてから培地を交換します。3〜4週間後、21ゲージの針を使用して、典型的なESCのような形態を持つ特定のコロニーの8〜10個の個々の断片を選び、増殖後にCFI MFSの個々のウェルにサブクローンします。添付のテキストプロトコルに記載されているように、幹細胞統合部位を確認した後、胚体形成およびマーカー発現解析により、細胞が多能性であることを確認します。最初に古い人間のPSC媒体を標準のPSC媒体の3ミリリットルに組み合わせて吸引することにより、ステム車を物品税化します。45マイクロリットルの濃縮アデノクリープールまたはウイルスとトランスフェクション剤のミリリットルあたり8マイクログラム。次に、細胞に加え、インキュベーション後24時間インキュベートし、ウイルスのすりおかし酸を吸引し、ヒトPSC培地を誘導して細胞を2回洗浄します。次に、純粋なマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムのHPSC培地を添加し、5日後に毎日交換し、残りのコロニーをサブクローンして、ビデオの前半で説明したようにそれらを拡大します。次に、プレEloqua基底膜マトリックスの1バイアルを氷上で解凍し、冷たい基礎培地を最終濃度1〜30に希釈します。ウェルあたり1ミリリットルを使用して、6ウェルプレートのウェル数をコーティングし、プレートを室温で1時間放置します。次に、18ゲージの針を使用して、以前にmesでコーティングされた井戸から少なくとも20〜30のコロニーをクロスハッチします。プレートからの細胞の浮き上がりと細胞の移動を減らすように注意してください。1時間のインキュベーション後、コーティングされたウェルから200マイクロリットルのピペットでマトリックスを吸引します。古いプレートからコロニーの一部をそっとこすり落とし、新しく組み合わせた培地3ミリリットル(マトリックスコーティングされたプレートに1つ)に慎重に置きます。48時間インキュベートした後、ポストが切除され、フィーダーフリーで変換されたHI PSCが80%coの流暢さに達したら、毎日培地を交換します。市販のDNA抽出キットを使用して、ステムカーレンチウイルスの外因性組み込みに特異的なここに示すプライマーを使用してゲノムDNAを抽出します。PCRでDNAを分析し、適切な切除を行い、切除後のHI PSCをGMPグレードの条件に移行します。HPSC複合培地1と臨床グレードのGMP準拠培地または複合培地2を、80〜20のプレウォームから摂氏37度の比率で混合します。細胞から古い結合培地1を吸引し、新しい温かい培地溶液の3ミリリットルと交換します。4日目に適切なコロニーサイズと密度を維持するためにテキストプロトコルに従って継代する3日間毎日培地を交換し、培地を温かい組み合わせ培地1と2の50 50混合物と交換し、3日間インキュベートします。7日目に培地を毎日交換し、温めた組み合わせ培地1と2をそれぞれ20〜80の比率に切り替え、3日間毎日交換します。10日目は、ウォーム、100%組み合わせたミディアムツーに切り替え、毎日交換します。これで、細胞は完全に定義されたゼノフリー培地に入れられます。次に、規定のゼノフリー基質を使用して6ウェルプレートの1ウェルをコーティングした後、コンフルエンスセルのウェル内のゼノフリー培地を1つのx岩石を含む新鮮な培地と交換します。1時間インキュベートした後、18ゲージの針を使用して、新たに調製した細胞に細胞を機械的に注入します。よく細胞を2日間邪魔されずにインキュベートさせて、テキストプロトコルに従って細胞を特徴付ける前に最大限の接着を可能にします。この図は、ステムカーアプローチでステムカーアプローチで再プログラミングした後の3つの異なる切除前H-I-P-S-Cラインの代表的な写真を示しています。ここに示されているのは、切除後の逆転写PCRゲルで、ステムカーレンチウイルスから完全に解放された1つの特定のサブクローンを示しています。この図では、ゼノ含有マトリックス上のプレコン変換された IPC と合成マトリックス上のポスト ゼノフリー GMP グレード H IPC が、SOX 2、OCT 4、nanog などの標準多能性関連因子の定量を示しています。ここでは、QPCR の使用について説明します。最後に、ここで見られるように、コンコン変換前およびコンバート後のHI PSCをGMPグレードの条件に交換し、フローサイトメトリーを通じて、非ヒト抗原を示すシアル酸およびグリコールニューロン酸を試験しました。このビデオを見た後、ステムコリプログラミングウイルスを使用してヒトの成人皮膚線維芽細胞を再プログラムし、ウイルスをゲノムから切り出し、これらのHI PSCをヒトの治療薬と完全に適合する臨床グレードの条件に完全に変換する方法を十分に理解しているはずです。第3世代の抗ウイルスベクターであるSTACAを使用することは、非常に危険であり、予防策であることを忘れないでください。この手順を実行する際には、このような適切なPPEとVSLの2つ以上の組織培養室を使用する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

遺伝子組み換えの最近の進歩にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESC）のトランスフェクションは、気まぐれなプロセスのままです。我々の知る限りでは、人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）トランスフェクトする体系的かつ効率的な方法が報告されていない。ここでは、効率的にトランスフェクトし、人間性IPSCをnucleofectするための堅牢なプロトコルを記述。...

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。...

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

人工多能性幹細胞（iPS細胞）の定期的な特性評価は、それらの多能性状態の維持を確認するために、これらの細胞が他のアプリケーションに使用される前の重要なステップです。ここでは、免疫細胞化学によるヒトiPS細胞の簡便かつルーチンな特性評価を可能にするために特別に設計された、ヒトiPS細胞の小規模増殖法について説明します。...

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal...

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

学ぶ成人皮膚線維芽細胞を用いた無導入因子hiPSCの作製法。レンチウイルスベースのリプログラミングとアデノCreウイルスによるカセット切除、GMPグレードへの変換プロセスを解説。再生医療への応用可能性を示す。

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

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