PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡
2014年10月24日
この手順の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して光受容体タンパク質の高解像度画像を収集することです。これは、最初に光受容体のサンプルを取得し、それを希釈することによって達成されます。2番目のステップは、タンパク質サンプルを、切断したばかりできれいな雲母の表面に約30秒間適用することです。
次に、MICAをバッファーですすいで、結合していない分子や緩く付着した分子を取り除きます。次に、適切なプローブが装備された液体セルにサンプルを取り付けます。このアセンブリはスキャナーにロードされます。
液体セルに緩衝液を充填した後、チップをサンプルにかみ合わせ、スキャンを開始します。最終的には、ピーク力を組み込んだ原子間力顕微鏡です。定量的なナノ機械的特性マッピングを使用して、サンプル表面上の単一の光受容体タンパク質の画像を収集します。
ピークフォースqとmを組み込んだ原子間力顕微鏡は、生物学的に活性な高分子の機能を決定する重要な構造的および化学的特性は何かなど、分子生物学の分野における重要な質問に答えることができます。NMRやX線結晶構造解析などの現在の方法と比較した場合、この技術の主な利点は、生物学的に関連性のある環境で無傷のタンパク質やその他の生体高分子の高解像度画像を取得できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、プローブと溶液のチューニングに複数のステップが必要であり、その一部は非常に複雑であるため、苦労します。
ピークフォースqとm、および自動化ソフトウェアにより、これらのステップのいくつかがよりシンプルになり、新規ユーザーや学部生にとってプロセスがはるかに容易になります。この手順を実演するのは、私の研究室の3人の学部生、Marie Kroger、Blair Sorenson、およびJessica Thomasです。これらの学生は、来年、微生物学、化学工学、化学の分野で大学院の研究を追求する予定です。
これらの項目は、特定の順序でオンにする必要があります。最初にコンピューター、次にコントローラー、そして最後に光ファイバーライト。顕微鏡はFMとLF fmを読み取る必要があります。
カメラは、ソフトウェアのFM光学ヘッドの中央に配置されている必要があります。以下を選択する必要があります。実験カテゴリは機械的特性です。
実験グループは定量的ナノメカニカルマッピングであり、実験は流体中のピーク力qとmです。設定を正しく選択すると、実験を読み込んでセットアップできます。カメラの焦点は、ステージを配置するためにコースコントロールを使用して、最初にZ対物レンズを使用して設定する必要があります、目標は、ステージ表面の1ミリメートル前にA FMヘッド開口部を配置して、新たに切断されたマイカとサンプルディスクを操作することです円形のディスクグリッパーピンセットを持っています。
まず、手付かずの洗浄済み部品から流体セルを組み立てます。まず、ホースアダプターをクリーンフルードセルのポートに取り付けます。次に、フラットヘッドピンセットを非常に穏やかに使用して、Oリングを流体セルのくぼみに押し込みます。
次に、プローブリテーナークリップで、スプリングを軽く押して溝から離します。同じピンセットを使用して、プローブをつかみ、先端が細胞の中心を向くように溝にスライドさせます。次に、クリップを使用してプローブを固定します。
次のステップは、A FM.It のクランプが完全に引っ込められていることを確認することです。サンプルの上にアセンブリを下向きに置きます。アセンブリをAFMのスタッドに取り付けて、安定化します。
clを下げますamp。Oリングを検査するには、Oリングが見えるまで顕微鏡の下向きスイッチを押します。サポートディスクと流体セルの間でしっかりと圧縮する必要があります。
流体セルは、粗調整ノブを使用して焦点を合わせることができます。次に、XY調整を使用して、プローブの先端に焦点を合わせます。メタリックな金色の三角形のように見えます。
次に、ダウンピゾレバーを使用して、チップをサンプル表面に近づけ、チップ、反射にフォーカスを調整し、この反射に対するカンチレバーの位置を監視します。現在、それらは密接に整列している必要がありますが、完全に重なっているわけではありません。次に、シリンジを準備します。
1ミリリットルの緩衝液を入れ、アダプターを取り付けます。次に、シリンジをイジェクトホースに取り付け、プランジャーを完全に伸ばします。次に、アダプターを使用してホースを流体セルに取り付けてチャンバーを満たし、チャンバーの中心がいっぱいになるまでプランジャーを静かに押します。
気泡や液体セルから顕微鏡にこぼれたりしてはなりません。次に、シリンジをチャンバーの上のしっかりと支えられた位置に置きます。次に、カメラフィードとXY変換ノブを使用します。
レーザーを画面上に配置するためには、レーザーが拡散した赤い点として表示される必要があります。位置を特定したら、レーザーコントロールを使用してプローブに移動します。最後に、顕微鏡の合計信号が4から6の間で最大になるまでレーザーとミラーのコントロールを調整し、象限ダイオードを調整します。
次に、スキャンヘッドのノブを使用して、顕微鏡の値が可能な限りゼロに戻るまで、垂直方向と水平方向のたわみを調整します。続行する前に、必ず適切な取得オプションを選択してください。スキャンレートを[サンプル/ライン]ウィンドウで約1ヘルツに設定します。
「256」と入力します。スキャンアシスト自動制御用。スキャンアシストの自動Z制限には個別を選択し、オフを選択します。
Z制限は500ナノメートル、スキャンサイズは1ミクロンである必要があります。設定が正しく設定された状態で、プローブを測ります。プローブの先端が表面に近づくにつれて、Zパゾ電圧が変化するのを観察します。
先端が範囲外に出た場合は、引き抜いて再アプローチすると、プローブ先端の交換が必要になる場合があります。これが機能しない場合は、先端がかみ合っているときに、各取得ウィンドウに線が表示され、これらの線が画像を構築します。マイカの画像の連続撮影を開始します。
ゆっくりとズームインして、MICAの表面が平らできれいであることを確認します。冷蔵イメージングバッファー溶液を含む4チャンバーペトリ皿を調製します。各チャンバーには少なくとも5ミリリットルが必要です。
希釈したタンパク質のアリコートを飲む前に、マイクロピペットで穏やかにかき混ぜます。次に、200マイクロリットルのアリコートを取り、希釈したタンパク質をMICA表面に塗布します。溶液が表面に存在するまで約30秒待ちます。
次に、ディスクグリッパーを使用して、ディスクを傾けずに持ち上げ、すぐに最初の緩衝液プールに浸します。1秒間、ディスクがベンチと平行に保たれていることを確認します。すすぎステップでは、サンプルをペトリ皿と平行に保つことが非常に重要です。
これらの柔らかく柔軟な分子は、水溶液の強い流れによって表面が歪むことがあります。次に、ディスクを他の3つのプールのそれぞれに、プールごとに1秒間短時間浸します。次に、ディスクを乾いたほこりのない布に移します。
余分な水分を布に移しますが、ディスクを完全に乾かさないでください。布がサンプルに触れないようにしてくださいサンプルディスクグリッパーで布からサンプルを慎重に取り出し、サンプルをAFMスキャナーに置きます。サンプルの上に流体セルを置き、セットアップとイメージングを進めます。
プローブのすべてのパラメータの後、スプリングサイズと先端半径が適切に設定されます。イメージング時と同様にプローブを測定します。マイカ、先端が表面に近づくにつれてZPアゾを観察してください。
画像を撮影するときは、スキャナーが同じ領域を少なくとも2回連続して画像化できるようにしてください。連続キャプチャを使用して、各画像を保存します。必要に応じて、画像のサイズと位置を調整します。
自動化されたソフトウェアが特定の画像サイズのスキャンパラメータの調整を終了したら。ソフトウェアの電源を切って問題ありません。画像の焦点を手動で調整し、スキャンレート、Z制限、ライン数、設定値を調整します。
画像の焦点が合いが合いが悪くなりすぎた場合は、ソフトウェアの電源を入れ直して元の開始位置に戻します。タンパク質を拡大しながら、スキャンレートを下げ、それに比例してライン数を増やして、画像の解像度を上げます。あとで。画像を分析するときは、まず、フラット化アイコンをクリックして画像をフラット化します。
0 次数を選択し、操作を実行します。場合によっては、適切にフラットな画像を得るために、プレーンフィットを使用する必要があります。プレーンフィットアイコンを選択し、カーソルを使用して画像内の平らな領域に平面を描画します。
プレーンフィットを実行し、必要に応じて操作を繰り返します。次に、断面タブを選択して、タンパク質の寸法を測定します。解析対象の分子や領域にカーソルを合わせて線を引きます。
このプロセスを複数の領域で繰り返します。オーバーレイが所望される場合、任意の数の生体分子を、その光適応状態の光受容体タンパク質のためのFMを用いて研究することができ、新たに切断された雲母基質は、タンパク質吸収のための適切な平坦な表面である。単一視細胞タンパク質二量体は、ピークフォースQNMモードを用いて観察できた。
矢印は個々の二量体を指し、アスタリスクは画像解析ソフトウェアを使用したタンパク質凝集体を示します。タンパク質の断面積は、画像を平坦化した後に測定できます。XY データは高さの測定値と相関します。
これらは、さまざまな計算に使用できます。このビデオを見た後、生物学的に関連性のある環境の表面上のタンパク質の高解像度画像を収集するためのA FM実験を設定できるはずです。ピーク力qとmを使用して、一度習得すると、この手法は約3〜4時間で実行できます。
したがって、ピーク力qおよびmは、機器分析、生化学、現代物理学などの実験コースに在籍する学部生に紹介するのに適した原子間力顕微鏡法の形態です。この手法は、開発後、走査型プローブ顕微鏡の分野の研究者が、タンパク質、核酸、さらには生物学的に関連性のある培地中の生体分子を探索する道を開くことになりました。
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概要
本論文では、原子間力顕微鏡 (AFM) を用いて、タンパク質光受容体の構造を調査する方法について説明します。PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) の技術を用いて、みか表面上の完全なタンパク質二量体を明らかにします。
主な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物理学
- 構造生物学
背景
- タンパク質光受容体は、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。
- 原子間力顕微鏡は、生体分子の高分解能イメージングを可能にします。
- これらのタンパク質の構造を理解することは、それらの機能に関する洞察を提供することができます。
- PF-QNM は、AFM のイメージング機能を向上させる新しい技術です。
研究目的
- 光受容体タンパク質の高分解能イメージを取得します。
- タンパク質二量体の構造的完全性を調査します。
- タンパク質構造の可視化における PF-QNM の有効性を示します。
使用方法
- 光受容体タンパク質のサンプル調製。
- 塗布前のタンパク質サンプル希釈。
- みか表面に新鮮に分割したサンプルを塗布。
- バッファーで洗浄して、結合していない分子を除去。
主な結果
- みか上の完全なタンパク質二量体のイメージングに成功しました。
- ナノメカニカル特性マッピングにおける PF-QNM の能力のデモンストレーション。
- 光受容体の構造の詳細を明らかにする高分解能イメージ。
- タンパク質構造に関する将来の研究のための方法の検証。
結論
- この方法は、タンパク質光受容体の研究のための信頼できるアプローチを提供します。
- PF-QNM は、タンパク質構造-機能の関係の理解を深めます。
- この技術は、同様の調査のために他の生体分子にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy with PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) enables high-resolution imaging of intact protein photoreceptors in biologically relevant environments, supporting target validation by revealing structural details of light-sensing proteins. This approach reduces reliance on crystallization and NMR, offering a label-free method to assess protein integrity and oligomerization states early in discovery. The automation via ScanAsyst software improves reproducibility and accessibility for screening applications, accelerating mechanistic de-risking of photoreceptor targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of protein dimerization and aggregation states to interrogate therapeutic hypotheses about photoreceptor function.
- Operational Value: Provides label-free, native-condition imaging that avoids artifacts from fixation or staining, supporting reliable target confirmation.
- Predictive Value: Supports assessment of structural stability and conformational changes under physiological buffer conditions, informing lead selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces quantitative nanomechanical maps (e.g., adhesion, deformation) that serve as functional readouts for compound-induced conformational shifts.
- Reproducibility: ScanAsyst automation minimizes user-dependent variability in probe tuning and scanning parameters, enhancing assay robustness.
- Scalability: Compatible with fluid imaging and routine mica preparation, allowing repeated use across multiple protein targets in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to photoreceptor proteins involved in optogenetics and circadian signaling pathways, linking structural insights to functional modulation.
- Preclinical Continuity: Enables structural validation of photoreceptor variants or mutants prior to cellular or in vivo testing.
- Mechanistic De-risking: Correlates nanomechanical properties with light-adapted states, reducing uncertainty in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
PF-QNM fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural and mechanical data that inform early go/no-go decisions. It complements biochemical assays by adding direct nanoscale imaging of target engagement and oligomerization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on photoreceptor oligomerization and structural integrity in native-like conditions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative topographical and mechanical outputs for assessing compound effects on protein structure.
- Analytics: Delivers height, adhesion, and deformation maps at each pixel, enabling multiparametric comparison of protein states.
- Translational Research: Bridges structural discovery to preclinical validation by confirming target integrity before functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable AFM workflow for diverse macromolecules, reducing revalidation effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target structure by resolving dimers and aggregates without crystallization.
- Operational Value: Automation via ScanAsyst reduces training burden and improves inter-user consistency.
- Strategic Value: Enables faster structural triage of targets, reducing time spent on low-confidence candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of protein quality and stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, fluid cell handling, and protein surface chemistry.
- Depends on access to AFM systems with PeakForce QNM and ScanAsyst software, fluid cells, and probes suitable for biological samples.
- Necessitates standardization of sample dilution, mica preparation, and buffer conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different protein concentrations, surface treatments, and environmental conditions (e.g., pH, ionic strength).
- Limited by sample adhesion efficiency and potential tip-induced deformation on very soft samples, as noted in the need for parameter optimization.
