Name: 生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するためのインビトロ髄鞘形成アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶレンチウイルスを用いた一次オリゴデンドロサイト前駆細胞の遺伝子導入法と選択的なタンパク質発現による髄鞘形成メカニズムの解析。神経細胞との共培養系で髄鞘形成を評価する。

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この作業は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRCフェローシップ#454330からJX、プロジェクト助成金#628761 SMに、APP1058647からJX)、多発性硬化症研究評議会(MSRA #12070からJX)、メルボルン大学研究助成金支援スキームとメルボルン研究CIフェローシップからJXへ、またオーストラリア大学院奨学金からHPとAFへの支援を受けました。オーストラリア、ビクトリア州イノベーション、産業、地域開発省。

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</ol>

著者らは、この研究に関して利益相反はないことを宣言します。

軸索の髄鞘形成は、脊椎動物の中枢神経系および末梢神経系の両方の最適な機能のために重要なプロセスである。髄軸索の生成と維持管理は、神経、（シュワン細胞またはオリゴデンドロサイトから）グリアと細胞外マトリックスタンパク質との間の分子間相互作用を含む複雑かつ協調的なプロセスである。このプロトコルの重要性と適用性は、混合、共培養の設定内の1つの特定の細胞型にタンパク質の操作を可能にすることである。複数の細胞型のインビボおよびインビトロ髄鞘形成アッセイの両方で、髄鞘形成に関与しているように、特定のタンパク質またはシグナル伝達経路の活性をブロックするために鈍い薬理学的ツールを使用すると、タンパク質は、ニューロンのいずれかから、髄鞘形成の際に発揮することの影響についての具体的な情報を提供することができない、またはグリア視点、タンパク質一意つの細胞型によって発現されない限り。このように、 インビトロ髄鞘形成などオリゴデンドログリアのタンパク質は髄鞘形成の際に発揮することの効果を調べるために私たちを可能にする、具体的にOPCを形質導入するレンチウイルスの使用と関連して言う。我々は成功したオリゴデンドロ...

軸索の髄鞘形成は、両方の中枢神経系および末梢神経系における活動電位の迅速かつ効率的な伝送のために重要である。特殊化した細胞は、シュワン細胞が中枢神経系における末梢神経系およびオリゴデンドロサイトでは、ラップアラウンドおよびミエリンでensheathe軸索、効果的に神経を絶縁し、跳躍伝導1を容易にする。髄鞘形成の過程は、網膜神経節ニューロン2、人工ナノファイバー3、またはシュワン細胞4またはオリゴデンドロサイト5-7のいずれかとの共培養後根神経節ニューロンを用いてインビトロで研究することができる。 インビトロ髄鞘形成アッセイは、神経系のミエリン形成を研究するための確立されたモデルであり、それは、生体内 5-8 のミエリン形成時に発生する基本的なプロセスの多くを複製します。アッセイは、CのためのOPCと後根神経節（DRG）ニューロンの精製集団の共培養を、（関与NSの髄鞘形成）またはシュワン細胞（PNSの髄鞘形成のため）。特定の条件下で、これらの髄鞘形成細胞は、生体内に存在するミエリン特異的タンパク質の同一の相補体を発現する形質膜の絶縁命じ、超構造的に検証され、多層のシートのDRG軸索をensheathe。 インビトロでの CNS ​​の髄鞘形成を研究する最も一般的に使用される細胞モデルに成功などのニューロトロフィンのような外因性因子は、インビトロ 5,6 における CNS髄鞘形成に発揮することの効果を研究するために使用されたDRGニューロンおよびOPCの共培養である。そのような増殖因子または小分子薬理学的阻害剤のような外因性因子は広くDRG-OPC共培養モデル7,9を用いて、髄鞘形成におけるシグナル伝達経路の役割を研究するために使用されている。しかし、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの両方を含む混合共培養の設定で、それは正式に可能残って、成長因子またはPharのいずれかmacological阻害剤は、DRGニューロンおよびオリゴデンドロサイト（OL）の両方に効果を発揮している可能性があります。これは、具体的のみのDRGによって発現されるタンパク質またはオリゴデンドログリアは、このデュアルセルシステムを使用して、髄鞘形成の際に発揮することの役割を分析する機能を提供していますか。明確に乏突起膠細胞におけるシグナル伝達経路を直接インビトロ髄鞘形成アッセイのためのDRGニューロン上に播種する前に、同様に、野生型および変異型タンパク質の両方を過剰発現するためのエレガントな方法であることが証明された髄鞘形成、OPCのレンチウイルス形質導入、調節していることを確認するためにオリゴデンドロサイトによる構成的に発現するタンパク質のノックダウン式として。このように、このアプローチは、具体的に質問すると髄鞘9,10を研究するためのオリゴデンドロサイト内のシグナル伝達経路を操作するための手段を提供しています。 本稿では、我々は、レンチウイルスを経由してオリゴデンドロサイトに選択的に目的のタンパク質を過剰発現するように開発し​​たメソッドを報告in vitroでの髄鞘形成を研究するためのアプローチ。技術は、目的の遺伝子を含む発現ベクターの生成で始まり、続いて、pENTRベクター（をpENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP）にクローニングされた野生型、構成的に活性またはドミナントネガティブ型であること。 （目的の遺伝子を含む）このベクターは、CMVプロモーター供与体（をpENTR L4-R1のpENTR-pDNOR-CMV）および2K7レンチベクターは、CMVプロモーターを含む2K7ベクターは、目的の遺伝子を生成するための酵素反応で合成される内部リボソーム侵入部位およびGFP（ 図1）。 PMD2.GウイルスエンベロープとpBR8.91ウイルスパッケージと組み合わせて、このゲートウェイクローニングさ2K7構築物は、その後のOPCを形質導入するために使用することができるレンチウイルスを生成するために、HEK293T細胞に同時トランスフェクトすることができる。一旦OPCは、目的のタンパク質を高レベルで発現するレンチウイルスに感染した。これらのOPCは、その後のDRGニューロン培養と効果発現が上に播種することができる所望のタンパク質の高レベルを調べることができる髄鞘形成に及ぼす。共培養は、ウェスタンブロット分析によってミエリンタンパク質の発現について評価し、免疫細胞化学によって有髄軸索のセグメントを形成するために可視化される。

<table><tbody><tr><td>2K7 レンチベクター&nbsp;</td><td></td><td></td><td>博士Suter9</td></tr><tr><td>5-フルオロ-2&prime;-デオキシウリジン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルーア488ヤギ抗マウスIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルーア488ヤギ抗ウサギIgG(H + L)</td><td>ライフサイエンス</td><td>A11008</td><td></td></tr>ア<tr><td>レクサフロー594ヤギ抗マウスIgG(H + L)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement</td><td>Stem Cell Technologies&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (ヒト)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン (d-ビオチン)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 蛍光封入剤</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 高グルコース, ピルビン酸, グルタミン無</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウム</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>プロモーターおよび目的の</td><td></td><td></td>遺伝子のためのエントリーベクター <td>プロトコル 1-2 に従って生成します</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>フォルスコリン&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>グルコース (D-グルコース)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>ストックソリューションを見る</td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG</td><td>ジャクソン イムノリサーチ</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgM&nbsp;</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td>ズ 23017015 <td></td></tr><tr><td>LB ミディア</td><td></td><td></td>ム <td>ストックソリューションを見る</td></tr><tr><td>LB-寒天</td><td></td><td></td><td>ストックソリューションを見る</td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツの L-15 ミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン- 200 mM (100x) 液体</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus enzyme</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, no Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>マウス & α; & ベータ;IIIチューブリン&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>マウス&アルファ;MBP(モノクローナル)</td><td>ミリポア</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Naピルビン酸&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (マウス)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;450-03</td><td></td></tr><tr><td>O1抗体 - マウス抗O1</td><td>ミリポア</td><td>MAB344</td><td>O1ハイブリドーマ細胞が利用できない場合の代替</td></tr><tr><td>O1ハイブリドーマ細胞</td><td></td><td></td><td>免疫パニングに使用される抗O1抗体を含む馴化培地</td></tr><tr><td>- マウス抗O4</td>ミリ<td>ポア</td><td>MAB345</td><td>O4ハイブリドーマ細胞が利用できない場合の代替</td></tr><tr><td>O4ハイブリドーマ細胞</td><td></td><td></td><td>免疫パニングに使用する抗O4抗体を含む馴化培地</td></tr><tr>コン<td>ピテントセル</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A10460</td><td></td></tr><tr><td>ワンショット Stbl コンピテントセル</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>パパインサスペンション</td><td>ワーシントン/クーパー</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>デンハム博士からの親切な贈り物10</td></tr><tr><td>PDGF-AA(ヒト)</td><td>ペプロテック</td><td>PT10013A500&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン100倍溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI)&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤錠 (コンプリートミニ)</td><td>ロシュ</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td></td><td></td> クロー<td>ナーゼ</td></tr>酵素 <tr><td>プトレシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ & α; ニューロフィラメント</td><td>ミリポア</td><td>AB1987&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ & アルファ;MBP(ポリクローナル)</td><td>ミリポア</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2ハイブリドーマ細胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>免疫パニングに使用する抗Ran2抗体を含有する馴化培地</td></tr><tr><td>ラット抗CD140A/PDGFRa抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC培地</td><td></td><td></td><td>コンピテントバクテリア付属</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>SPE I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH8</td><td></td><td></td><td>ストック溶液を参照してください</td></tr><tr><td>TNE 溶解バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素 B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェリン (apo-Transferrin human)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤 鶏卵白</td><td>ロシュ</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッド (0.05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>非抱合型グリフォニア シンプリシフォリア レクチン BSL-1</td><td>ベクター研究所&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>ウリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するためのインビトロ髄鞘形成アッセイ

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

髄鞘形成は、末梢神経系（PNS）のニューロンおよびグリア細胞を形成するミエリン、中枢神経系（CNS）におけるオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞の両方を含む複雑なプロセスである。我々 は、in vitro髄鞘形成アッセイ、in vitroでのCNS ​​ミエリン形成を研究するための確立されたモデルを使用しています。これを行うには、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）髄鞘共培養を形成するために、精製された主要なげっ歯類後根神経節（DRG）ニューロンに添加される。オリゴデンドロサイトによって発現される特定のタンパク質は、ミエリン形成の際に発揮することを、具体的な役割を調べるために、我々は選択的にDRGニューロン上に播種される前に、野生型、構成的に活性またはドミナントネガティブタンパク質を過剰発現するレンチウイルスを使用したOPCを伝達するプロトコルを開発した。これは、私たちは特に髄鞘形成の調節にこれらのオリゴデンドログリアのタンパク質の役割を調べることができます。プロトコルがotの研究にも適用することができる彼女の細胞型は、このようにしてそのようなシグナリング及び補償メカニズムの研究のための標的オリゴデンドロサイトのような所望の細胞型によって発現されるタンパク質の選択的操作を可能にするアプローチを提供する。結論として、レンチウイルスに感染したOPC を用いたin vitro髄鞘形成アッセイを組み合わせること髄鞘形成に関与する分子メカニズムの解析のための戦略的なツールを提供しています。

レンチウイルス産生のために使用されるフラッグタグ化細胞外シグナル関連キナーゼ1（フラッグのErk1）構築物を酵素2K7構築物およびウイルス産生に必要なパッケージングおよびアクセサリーのコンストラクト（ 図3）の両方を含む、使用した構築物の制限消化によって確認される。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> 図3：DNA構築の検証 。レンチウイルス産生に必要なすべてのDNA構築物はStbl3細菌から精製し、制限酵素消化によって確認した。付属品及び包装ベクターが示され、未切断プラスミド（A）と比較して、NcoIおよびEcoRIで消化し ​​た。 2K7-GFPは、SpeIおよびSacIIで（A）で消化し ​​た。 2K7-フラッグ酸化Erk1 DNAをSpeI単独SacIIでのい...

ここでは、中枢神経系髄鞘形成のin vitroモデルを介してオリゴデンドロサイトにおけるそれらの役割を特異的に調査するために、オリゴデンドロサイト前駆細胞をウイルス的に操作して目的のタンパク質を過剰発現するための柔軟で戦略的な基盤を提供するプロトコルを紹介します。

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

この手順の全体的な目標は、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはOPCをウイルス的に操作して、目的のタンパク質を過剰発現させることです。CNS Myelination Nationのin vitro研究では、これは最初にレンチウイルスベクターをクローニングすることによって達成されます。次のステップは、レンチウイルスを産生し、実験に最適なウイルス濃度を決定することです。これに続いて、解剖および培養されたOPCはレンチウイルスに形質導入されます。最後のステップは、形質導入されたOPCをDRGから解剖した培養ニューロンに播種することです。最終的に、ミエリン化共培養物のミエリンタンパク質発現をウェスタンブロット解析により評価し、免疫染色により有髄軸索セグメントの形成を可視化します。薬理学的ツールなどの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、レンチウイルスアプローチにより、我々が所望の細胞型において野生型または変異タンパク質のいずれかを選択的に過剰発現することを可能にすることであり、この場合、オリゴデンドロサイトトランスフェクションの日の朝にテキストプロトコルに記載されているように、必要な2K7レントベクターを調製し、 25ミリリットルの培地を含むT1 75フラスコに3,200万HEK 2 93 T細胞を調製します。重要なのは、トランスフェクションの前にこれらの細胞を固定する必要があるため、必要に応じて早めにプレート化することです。50ミリリットルのFalconチューブで、表1に詳述されているようにT 1 75フラスコトランスフェクション用のマスターミックスを調製し、温かいDMEMボルテックスにDNAを添加し、次に滅菌PEIラストを添加して早期の沈殿を避けます。チューブを3〜4回反転させてよく混合し、ベンチで約15分間インキュベートします。細胞上の培地を交換してから、トランスフェクション混合物を添加します。DROPWISEは、培地を細胞上で穏やかに混合し、細胞を一晩インキュベートします。翌日。GFPの発現は、蛍光顕微鏡で確認することができます。トランスフェクションの48時間後、ウイルス上清の最初のバッチを回収し、25ミリリットルの新鮮な培地を細胞に加えます。ウイルス上清を1,140Gで4°Cで10分間遠心分離します。細胞破片のペレットを含まないウイルス上清を新しいチューブに移し、摂氏4度で保存します。翌日、トランスフェクション後72時間後に、ウイルス上清遠心分離機の最後のバッチを回収して細胞の破片を除去し、クリアされたウイルス上清の最初のバッチとプールします。次に、ウイルス上清を170, 000Gで90分間超遠心分離することにより、ウイルスを濃縮します。摂氏4度で。超遠心分離機を降ろし、上清を注ぎ、沈殿したPEIとウイルスの口蓋を残します。これは30ミリリットルのチューブの底には見えません。このプロセスを繰り返します。すべてのウイルススーパーナットを同じ30ミリリットルチューブにバッチで遠心分離してウイルスを濃縮し、各超遠心チューブにウイルスを再懸濁します。500マイクロリットルのサトーメディアを追加し、チューブをフィルムで覆います。次に、チューブを30秒間ボルテックスし、ピペットチップでペレットを機械的に取り除きます。この渦巻き除去サイクルを約6回繰り返して、ペレットが佐藤培地に完全に懸濁していることを確認します。次に、佐藤に再懸濁したウイルスをすべて新しいマイクロチューブにプールします。溜まった上清を最大速度で1分間短時間回転させます。PEIをペレット化するには、ウイルスを含む上清を回収し、溶液を0.45ミクロンのフィルターに通し、注射器で包み込みます。精製されたウイルスをセディアで2050年と100マイクロリットルの容量に分注し、すべて摂氏マイナス80度で保存します。このプロトコルでは、初代オリゴデンドロサイト前駆細胞を調製します。OPCは、次の成長因子、C-N-T-F-P-D-G-F-N NT 3を含むセディア10ミリリットルで10センチメートルプレートで培養され、細胞は8%二酸化炭素の下で24時間培養されている必要があります。メディアを吸引することから始めて、完全に取り外します。次に、成長因子を含む同じメディアの10ミリリットルと交換します。OPCをレンチウイルスに感染させ、必要な量のウイルスを培地に滴下して目的のタンパク質を発現させます。また、別のOPCプレートで、GFPのみを発現するコントロールレンチウイルスを培地培養液に混合し、細胞をさらに48時間混合します。次に、プレートからOPCを回収して、培養したGRGニューロンに播種します。まず、各プレートを8ミリリットルのEBSSで2回すすいでください。トリプシンEDTA 0.05%の1ミリリットルを暖かいEBSSの9ミリリットルで構成します。希釈したトリプシンを5ミリリットル各プレートに加えます。摂氏37度で最大2分間インキュベートします。EBSSに5ミリリットルの30%FBSを添加してトリプシンを中和します。次に、10ミリリットルのピペットを使用します。プレート表面からOPCを洗います。プレートを毎回4分の1回転させて、すべてのセルを収集します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を室温で180Gで15分間遠心分離し、上清を吸引して再投与します。細胞ペレットを成長因子を含まない1ミリリットルの温かい悲しい培地に懸濁し、細胞を数えます。次に、22mmカバースリップで培養したDRGニューロンを、プレートから培地を完全に吸引して調製します。次に、200, 000 OPCを各カバースリップに滴下します。播種量は、カバースリップあたり200マイクロリットル未満でなければなりません。プレートを動かさずに細胞を落ち着かせます10分後、各ウェルにミリリットルの温かいものをトッピングします。次に、残りの姉妹OPCを再生します。成長因子を含むomedを使用すると、後で目的のタンパク質の発現を確認するために使用できます。細胞外シグナル関連キナーゼとタグ付けされたフラグ。1つのコンストラクトはレンチウイルスの生産制限に使用されました酵素を使用して、OPCに使用する最適なウイルス希釈を決定するためのパッケージングコンストラクトとアクセサリーコンストラクトを検証しました。IR one レンチウイルスは、HEK 2 93 T 細胞でウイルス希釈率の範囲で HEK 2 93 T 細胞で滴定しました。目的遺伝子の発現レベルは時間とともに増加しました。次に、精製したOPCを感染させ、導入遺伝子の発現を確実にするために少なくとも2日間培養しました。FLAGおよびGFPレベルは、姉妹OPCで確認されました。次に、OPCをDRGニューロンに装着しました。その後、OPCはオリゴデンドロサイトに分化し、西洋人によって評価されたように、ミエリンタンパク質を発現し始めました。MBP染色によって可視化された有髄性オリゴデンドロサイトの一部は、軸索密度が考慮されるように、ニューロフィラメントまたはベータ3チューブリンによって染色されました。髄鞘形成レベルを分析するとき OPCを播種した後、培養することが重要です。姉妹のAPCs。このようにして、目的のタンパク質または目的のタンパク質のタグは、共培養で確認できない場合でも、姉妹APCでその発現を確認できます。

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

学ぶレンチウイルスを用いた一次オリゴデンドロサイト前駆細胞の遺伝子導入法と選択的なタンパク質発現による髄鞘形成メカニズムの解析。神経細胞との共培養系で髄鞘形成を評価する。

生産と選択的に伝達する一次オリゴデンドロサイト前駆細胞へのレンチを使用するためのインビトロ髄鞘形成アッセイ

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