浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼体を使用して粘膜カンジダ症をモデル化することです。これは、最初に生きたアルビカンスを含む溶液をマイクロニードルにロードすることによって達成されます。第2ステップでは、ゼブラフィッシュの稚魚の遊泳膀胱に一定量の酵母細胞を注入します。

次に、魚を均質な接種物についてスクリーニングし、所望の時間インキュベートします。最後のステップでは、共焦点顕微鏡を使用して、病原体とゼブラフィッシュの免疫系とのダイナミックな相互作用を追跡します。さらに、水泳用膀胱をマイクロで解剖して、より高解像度の共焦点画像を取得できます。

ここで紹介する方法は、真菌病原体に対する免疫応答の失敗につながるイベントの正確な順序や粘膜表面でのカンジダビーコンなど、真菌免疫学および微生物学の主要な質問に答えます。手順を開始する前に、摂氏33度のインキュベーターで2%アロスを含む注射皿を温めます。.30分後、25ミリリットルのピペットを使用して、4日目のプレートから100ミリリットルのE 3メディアプラスPTUを取り出し、受精後のゼブラフィッシュを、魚を吸引しないように注意しながら、1ミリリットルあたり4ミリグラムの2ミリリットルを追加します。

トリカメタンスルホン酸は、動物を麻酔するためにメディアにストックします。15分後、解剖顕微鏡を使用して水泳用膀胱が膨らんでいる魚を特定し、プラスチック製の移送ピペットを使用して30匹のゼブラフィッシュを予熱注入皿に移します。余分なメディアを取り外し、その後、角度で皿を保持し、ボロケイ酸塩キャピラリーにスーパー接着0.012インチの直径の釣り糸を使用して、垂直に整列した魚の3つのラインを作るために、次に徹底的に10倍10の濃度で新たに準備された海のアルビカンのチューブを渦巻き1ミリリットルあたり7番目のCFUs。

次に、3マイクロリットルの酵母溶液をECクリップマイクロニードルにロードします。パルス幅を適切な設定に設定します。次に、注射皿を回転させて、マイクロニードルと魚の頭との間に20度の角度に達し、水泳用膀胱の後ろを狙います。

次に、マイクロニードルを水泳用膀胱に押し込み、針の穴が内腔にあることを確認し、水たまりを押します。どの魚が注入されたかを確認するのが比較的簡単であれば、ボーラスが気泡を置換し、その後、水泳用膀胱の背面が媒体で満たされるため、ボーラスとフェノールレッドの同時注入は、成功した注入の視覚化をさらに容易にすることができます。30匹の魚すべてを注入した後、皿にE 3培地を浸し、魚を回収皿に空にします。

10匹の動物を1ミリリットルのEスリー培地が入った1.7ミリリットルの遠心分離管に移し、200マイクロリットルのトリカで魚を安楽死させます。次に、各動物について、マイクロスライド上に1センチ間隔で正方形に4滴の真空グリースを配置し、正方形の中央に新たに準備した2%の低融点の2滴を追加します。次に、1匹の魚を別のスライドガラスに置き、解剖顕微鏡で動物の心臓の鼓動が止まったことを確認し、余分な水分を取り除きます。

次に、1組の細いピンセットを使用して頭を固定位置に保持し、もう1組を使用して前腸を引き下げます。水泳用膀胱を空気圧ダクトで持ち上げ、消化管から分離し、アグロが固まる前に準備したマイクロスライドの1つの中央に置きます。最後に、カバースリップをティッシュにかぶせ、真空グリースとアガロースに触れるまで静かに押し下げ、採取後10分以内に水泳用膀胱をイメージします。

4ナノリットルのシーアルビカンスを7分の1の10の1.5倍で注入します。ミリリットルあたりのCFUは、最も一貫性のあるデータを提供し、魚あたり10〜50個の酵母細胞の範囲をもたらします。接種材料を15〜25個の酵母細胞に絞り込むと、表現型と応答がさらに厳密になります。

好中球は、マウスやヒトのカンジダ症に対する抵抗性において重要な役割を果たしており、ゼブラフィッシュの泳ぎ膀胱に生きたアルビカンスが感染すると、好中球が迅速かつ持続的に動員されます。これは、熱死酵母細胞が注入された場合には発生しません。フィラメントは、酵母細胞の注入後に急速に発達し、注入後最初の24時間にわたって糸状成長が続き、その後、この数は個々の魚を非侵襲的に追跡する能力を低下させ始め、これらの縦断的研究を可能にし、疾患の進行と宿主の応答における個々の個人差を強調します。

マウスイメージングでは非現実的な実験プロトコルですが、免疫細胞または上皮細胞とcアルビカンスとの相互作用は、ここで提示されたモデルでは比較的容易です。しかし、先ほど示したように水泳用膀胱を解剖すると、画像の品質が大幅に向上します。これは、蛍光が遍在的に発現し、アルファカティーンシトリン魚系統から解剖された遊泳膀胱のこれらの画像で観察されるように、周囲の組織に無関係な蛍光があるトランスジェニック魚系統を視覚化する場合に特に有用です。

この手順に従います。モーフ技術や化学的阻害治療などの他の方法は、粘膜カンジダ症における特定の免疫細胞またはシグナル伝達経路の役割は何かというような質問に答えるために使用できます。