浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化
November 27th, 2014
粘膜レベルでの病原体と免疫防御の生体内時空間相互作用は、既存の脊椎動物宿主では容易には画像化されません。ここで紹介する方法は、ゼブラフィッシュの幼魚の水泳膀胱を感染部位として使用して、生きた脊椎動物の粘膜カンジダ症を研究するための汎用性の高いプラットフォームを示しています。
この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼体を使用して粘膜カンジダ症をモデル化することです。これは、最初に生きたアルビカンスを含む溶液をマイクロニードルにロードすることによって達成されます。第2ステップでは、ゼブラフィッシュの稚魚の遊泳膀胱に一定量の酵母細胞を注入します。
次に、魚を均質な接種物についてスクリーニングし、所望の時間インキュベートします。最後のステップでは、共焦点顕微鏡を使用して、病原体とゼブラフィッシュの免疫系とのダイナミックな相互作用を追跡します。さらに、水泳用膀胱をマイクロで解剖して、より高解像度の共焦点画像を取得できます。
ここで紹介する方法は、真菌病原体に対する免疫応答の失敗につながるイベントの正確な順序や粘膜表面でのカンジダビーコンなど、真菌免疫学および微生物学の主要な質問に答えます。手順を開始する前に、摂氏33度のインキュベーターで2%アロスを含む注射皿を温めます。.30分後、25ミリリットルのピペットを使用して、4日目のプレートから100ミリリットルのE 3メディアプラスPTUを取り出し、受精後のゼブラフィッシュを、魚を吸引しないように注意しながら、1ミリリットルあたり4ミリグラムの2ミリリットルを追加します。
トリカメタンスルホン酸は、動物を麻酔するためにメディアにストックします。15分後、解剖顕微鏡を使用して水泳用膀胱が膨らんでいる魚を特定し、プラスチック製の移送ピペットを使用して30匹のゼブラフィッシュを予熱注入皿に移します。余分なメディアを取り外し、その後、角度で皿を保持し、ボロケイ酸塩キャピラリーにスーパー接着0.012インチの直径の釣り糸を使用して、垂直に整列した魚の3つのラインを作るために、次に徹底的に10倍10の濃度で新たに準備された海のアルビカンのチューブを渦巻き1ミリリットルあたり7番目のCFUs。
次に、3マイクロリットルの酵母溶液をECクリップマイクロニードルにロードします。パルス幅を適切な設定に設定します。次に、注射皿を回転させて、マイクロニードルと魚の頭との間に20度の角度に達し、水泳用膀胱の後ろを狙います。
次に、マイクロニードルを水泳用膀胱に押し込み、針の穴が内腔にあることを確認し、水たまりを押します。どの魚が注入されたかを確認するのが比較的簡単であれば、ボーラスが気泡を置換し、その後、水泳用膀胱の背面が媒体で満たされるため、ボーラスとフェノールレッドの同時注入は、成功した注入の視覚化をさらに容易にすることができます。30匹の魚すべてを注入した後、皿にE 3培地を浸し、魚を回収皿に空にします。
10匹の動物を1ミリリットルのEスリー培地が入った1.7ミリリットルの遠心分離管に移し、200マイクロリットルのトリカで魚を安楽死させます。次に、各動物について、マイクロスライド上に1センチ間隔で正方形に4滴の真空グリースを配置し、正方形の中央に新たに準備した2%の低融点の2滴を追加します。次に、1匹の魚を別のスライドガラスに置き、解剖顕微鏡で動物の心臓の鼓動が止まったことを確認し、余分な水分を取り除きます。
次に、1組の細いピンセットを使用して頭を固定位置に保持し、もう1組を使用して前腸を引き下げます。水泳用膀胱を空気圧ダクトで持ち上げ、消化管から分離し、アグロが固まる前に準備したマイクロスライドの1つの中央に置きます。最後に、カバースリップをティッシュにかぶせ、真空グリースとアガロースに触れるまで静かに押し下げ、採取後10分以内に水泳用膀胱をイメージします。
4ナノリットルのシーアルビカンスを7分の1の10の1.5倍で注入します。ミリリットルあたりのCFUは、最も一貫性のあるデータを提供し、魚あたり10〜50個の酵母細胞の範囲をもたらします。接種材料を15〜25個の酵母細胞に絞り込むと、表現型と応答がさらに厳密になります。
好中球は、マウスやヒトのカンジダ症に対する抵抗性において重要な役割を果たしており、ゼブラフィッシュの泳ぎ膀胱に生きたアルビカンスが感染すると、好中球が迅速かつ持続的に動員されます。これは、熱死酵母細胞が注入された場合には発生しません。フィラメントは、酵母細胞の注入後に急速に発達し、注入後最初の24時間にわたって糸状成長が続き、その後、この数は個々の魚を非侵襲的に追跡する能力を低下させ始め、これらの縦断的研究を可能にし、疾患の進行と宿主の応答における個々の個人差を強調します。
マウスイメージングでは非現実的な実験プロトコルですが、免疫細胞または上皮細胞とcアルビカンスとの相互作用は、ここで提示されたモデルでは比較的容易です。しかし、先ほど示したように水泳用膀胱を解剖すると、画像の品質が大幅に向上します。これは、蛍光が遍在的に発現し、アルファカティーンシトリン魚系統から解剖された遊泳膀胱のこれらの画像で観察されるように、周囲の組織に無関係な蛍光があるトランスジェニック魚系統を視覚化する場合に特に有用です。
この手順に従います。モーフ技術や化学的阻害治療などの他の方法は、粘膜カンジダ症における特定の免疫細胞またはシグナル伝達経路の役割は何かというような質問に答えるために使用できます。
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概要
この研究は、幼若ゼブラフィッシュを用いて粘膜カンジダ症のモデル化する方法を提示します。泳泳膀は感染部位として機能し、病原体と免疫の相互作用のリアルタイムイメージングを可能にします。
研究の主要な構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 感染症
背景
- 粘膜カンジダ症は生きた脊椎動物で研究するのは困難です。
- 幼若ゼブラフィッシュはイメージングのための透明なモデルを提供します。
- 粘膜レベルでの病原体相互作用の理解は治療法の開発に不可欠です。
- 共焦点顕微鏡は免疫反応の詳細な観察を可能にします。
研究の目的
- 生きたゼブラフィッシュで粘膜カンジダ症を研究するためのプラットフォームを開発すること。
- 病原体と免疫系との動的な相互作用を視覚化すること。
- 真菌感染に対する免疫反応の理解を深めること。
使用された方法
- 生きたカンジダ・アルビカンスを含む溶液をマイクロニードルにロードすること。
- 幼若ゼブラフィッシュの泳泳膀に酵母細胞を注入すること。
- 均一な接種株を持つ魚をスクリーニングし、それらをインキュベートすること。
- 共焦点顕微鏡を使用して病原体と免疫の相互作用を観察すること。
主要な結果
- ゼブラフィッシュでの粘膜カンジダ症の成功したモデル化。
- 病原体に対する免疫反応のリアルタイムイメージング。
- 泳泳膀の顕微鏡的解剖により高解像度の画像を取得。
- 感染の時空間的ダイナミクスに関する洞察。
結論
- ゼブラフィッシュモデルは粘膜カンジダ症の研究に効果的です。
- 共焦点顕微鏡は病原体相互作用の貴重な洞察を提供します。
- この方法はさらなる研究のために他の粘膜感染症に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish via swimbladder injection enables high-resolution, in vivo analysis of host-pathogen interactions at mucosal surfaces. This approach provides predictive confidence for early-stage target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery pipelines. The model's reproducibility and imaging capabilities support translational continuity from discovery through preclinical research for mucosal pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell and epithelial barrier function in response to mucosal infection.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing the sequence of immune events and cell recruitment.
- Facilitates functional validation of candidate targets and pathways involved in mucosal defense.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of immune modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible infection model for quantitative assessment of host-pathogen dynamics.
- Enables high-content imaging readouts for screening immune or pathogen-modulating compounds.
- Supports assay scalability and platform reuse for diverse mucosal pathogens beyond Candida albicans.
- Allows for robust evaluation of compound effects on immune cell recruitment and pathogen behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mucosal infection models for translational biomarker discovery.
- Enables longitudinal, non-invasive tracking of disease progression and host response heterogeneity.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into protective immunity.
- Supports preclinical validation of immune-modulating interventions in a vertebrate system.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish swimbladder infection model bridges early discovery and preclinical research by enabling real-time, quantitative analysis of mucosal host-pathogen interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell roles and pathway contributions to mucosal defense.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of immune cell recruitment, pathogen proliferation, and spatio-temporal dynamics.
- Translational Research: Offers continuity for biomarker alignment and disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Adaptable for studying other mucosal pathogens and immune-modulating strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mucosal infection research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early mechanistic insight.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and confocal imaging.
- Needs access to high-resolution microscopy and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of inoculum size and imaging protocols.
- Adaptable to various transgenic lines and pathogen types with protocol optimization.
- Imaging quality may be limited by tissue fluorescence and requires careful dissection for optimal results.
