リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

次の実験の全体的な目標は、T 細胞受容体切除サークルまたは REX と K の置換組換え切除サークルまたは修正の両方を 1 つのアッセイで定量化することにより、胸腺と骨髄の産出量を推定することです。これは、DNA増幅後に3つのターゲット間の1対1の比率を維持するために、まず、TRX修正のDNA配列と単一コピー参照遺伝子のDNA配列の断片を含むトリプルインサートプラスミドを構築することによって達成されます。次に、トリプルインサートプラスミドの段階希釈を行うことにより、標準曲線を作成し、実際のリアルタイムPCRによる3つのターゲット配列の絶対定量を可能にします。

最後に、リアルタイムPCRアッセイを実行し、トレとクラックの絶対定量化を行います。報告された結果は、健康な子供と大人の年齢と性別による胸腺と骨髄の産出量の変化を示しています。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、新生児や乳児の骨髄と胸腺の出量の両方を分析する必要があったときで、通常は採血量が大人に比べて少ないことを考慮して

そこで、サンプル調製と試薬のコストを最適化するために、Track and Corrects定量を1つのアッセイに2つの方法を組み合わせることにしました。この技術の意味は、原発性免疫不全および後天性免疫不全の診断にまで及びますが、この方法は、TMB細胞の喪失を伴うすべての疾患にも使用でき、骨髄移植後の新たな再構成を研究するためにも使用できますこの方法を通じて、ヒトの疾患への洞察を提供することができます。また、主にリンパ球の恒常性が関与する基礎研究にも適用できます。

の主な利点は、トリプルサープラスミッドを採用することにより、単一の標準硬化のみが必要であり、実験のばらつきを減らすことです。一般に、この方法を初めて使用する方は、トリプルインサートプラスミドの調製に必要な手順が長いため、または標準曲線の調製に関連する問題のために苦労する可能性があります。まず、標準的な密度勾配分離法を使用してEDTAチューブに収集された若い健康な被験者の末梢血など、PCRによって検出可能なTRXおよび亀裂を有する可能性が非常に高い細胞を含むサンプルを取得します。

末梢血単核細胞を分離し、テキストプロトコルに従って細胞からDNAを抽出した後、プライマー特異的なFort TRX REXおよびTCRアルファ定数遺伝子を使用して、レックスシグナル、ジョイントレックスシグナルジョイントおよびTCRアルファ定数遺伝子フラグメントを増幅します。PCR 2.1トポベクターのTAアクセプター部位にTraxシグナルジョイントのPCR産物を挿入し、プラスミドDNAを使用してXL One Blue化学的にコンピテントな細胞を熱ショックにより変換し、ベータラクターゼ補完を失ったアンピシリン耐性白色コロニーを新しいマスターディッシュ上に分離し、PCRを使用してトレックフラグメントを含むコロニーを特定します。トレック陽性コロニーの1つを増殖させ、DNAを単離した後、SP oneを使用してプラスミドとTCRα定常遺伝子増幅産物を消化し、TCRα定常遺伝子フラグメントをプラスミドにライゲーションします。

形質転換、コロニーの選択と拡大、DNAの単離を繰り返して正しいフラグメントを挿入し、SPではなく後3つを使用してプラスミドと正しいPCRフラグメントを消化し、このプロセスを繰り返してDNAをライゲーションして単離します。3つのインサートの配列を確認したら、コロニーを拡大し、テキストプロトコルに従ってMIDI調製によりプラスミドDNAを精製し、標準曲線を調製します。ここに示すようにプラスミドの質量と濃度を計算した後、プラスミドのアリコートを解凍し、DNAの直鎖アリコートで2マイクログラムを直鎖化する1つを示します。

式C one V one は C 2 V 2 に等しくなります。ここに示すように、シリーズの最初の標準曲線ポイントを調製するために必要な希釈量を計算するには、1〜10回の希釈をシリーズに調製して、残りの標準曲線ポイントを取得します。プラスミド希釈液は、使用するまでマイナス80°Cで保存します リアルタイムPCR用のサンプルを調製するには、次のように分析するサンプルごとに少なくとも2回の繰り返しを含むPCRプレートを、レックスとクラック用、TCRアルファ定数用の2つの別々のチューブで配置します。

必要なウェルの総数に対してマスターミックスを準備します。プレートのウェルに20マイクロリットルを追加します。次に、末梢血単核細胞またはP BMCから抽出したゲノムDNAを5マイクロリットル加えます。

反応プレートをシールするために光学接着剤カバーを使用する前に、テンプレートなしの制御井戸に5マイクロリットルの水を追加します。次に、プラスミドDNA標準曲線希釈液を解凍し、最高希釈液を調製します。行 A から H と列 1 から 4 の間にある井戸のみを明らかにします。

そして、短時間のボルテックス後、各希釈点の5マイクロリットルを指定された点まで追加します。ウェルの底に気泡がないこと、および試薬が底に沈殿していることをよく確認してください。リアルタイムPCRシステムを使用して、以下のプロトコルでアッセイを実行します。

50°Cで2分間加熱し、95°Cで10分間加熱した後、95°Cで15秒間45サイクル変性します。そして、結合されたプライマープローブ e ひざまずき、摂氏60度で1分間伸びます。リアルタイムPCRデータを解析するには、保存した結果ファイルをソフトウェアで開き、ウィンドウ上部の[結果]タブをクリックします。

解析メニューをクリックし、解析設定を選択します。ソフトウェアがすべての検出器を選択し、閾値サイクルの自動CTを選択することで、閾値を自動的に決定します。ソフトウェアがデフォルトでバックグラウンド削除の自動ベースラインを設定するようにします。

[Amplification Plot] というタブをクリックし、ウィンドウの右端にある、対応するドロップダウン メニューで 3 つの検出器のいずれかを選択します。select manual CTのすぐ下で、ウィンドウの下部に閾値を手動で設定し、選択した検出器の標準曲線希釈点に対応するウェルを選択し、マウスをテーブルの対応するセル上にドラッグして増幅プロットを表示します。しきい値を手動で調整するには、赤いしきい値の線を上下にドラッグし、[分析] をクリックして結果を再分析します。

しきい値の設定が結果にどのように影響するかを確認するには、レポートタブを選択し、それぞれの標準曲線希釈点の結果のCTを確認します。増幅プロット タブで最適な配置を得るためにしきい値を移動する場合は、しきい値がバックグラウンド ノイズより十分に高く、プラトー フェーズより下にある指数関数的増幅の領域にあることを確認します。増幅プロットが対数スケールで表示されない場合は、プロットを右クリックしてグラフ設定を呼び出し、実行後のY ais設定をlogとして設定します。

プロットの線形部分の途中にしきい値を設定し、増幅曲線が互いにほぼ平行になるように観察します。レポートタブをクリックして、CT結果を確認します。しきい値の配置により、各標準曲線の 2 回の反復の精度が最大になる結果が得られることを確認します。

希釈点。[レポート]タブの下の標準曲線希釈点の極端な桁数を最もよく反映する点にしきい値が設定されていることを確認します。ウィンドウ下部の表でマウスを再度ドラッグして、標準曲線のウェルに対応する細胞を選択します すべての検出器について、3つのターゲットの結果として得られるCTが同じ希釈点で非常に類似していることを確認します。

たとえば、差、0.5 CT以下、必要に応じてしきい値を再調整し、ウィンドウの下部にあるレポートタブで再チェックします。NTC ウェルを選択し、NTC ウェルに増幅が存在しないことを確認します。これは CT が undetermined に相当します。[標準曲線]タブを選択し、プロットウィンドウの右側で、ドロップダウンメニューから検出器を選択し、報告された標準曲線の傾きが負の3.55から負の3.32の範囲にあるかどうかを確認します。これは91〜100%のPCR効率に対応します測定係数またはR二乗が0.998より大きいことを確認してください。

レポートタブをクリックし、チャートの下の表の対応するセルで、ポジティブコントロールのCTが、同じ既知のポジティブコントロールでの以前のアッセイの結果と一致していることを確認します。ファイルメニューをクリックして保存し、CSVファイルにエクスポートして、すべてのウェルの量をカンマ区切り値を含むテキストファイルにエクスポートします。最後に、スプレッドシートソフトウェアでCSVファイルをインポートし、次の式を適切に設定して、6つのPBMに対する10あたりのトラック数または修正数を計算します。

このビデオで説明されているアッセイは、87人の健康な対照(0歳から17歳までの42人の子供と24歳から60歳の成人45人)の代表的なサンプルで実施されました。ここに示すように、トレッキングの数は、成人の胸腺退縮が0年から3〜4年であるため、年齢とともに急激に減少しました。

トレッキング数は、女性よりも男性の方が急速に減少するため、性別にもより依存します。これは、適切な基準範囲を設定する能力に影響を与える可能性があります。しかし、これらのグラフは、クラックの数が年齢とともに減少し、子供のみに見られるパターンと同様に、T TREXで見られるパターンと同様に減少していることを示しています。一方、成人では、骨髄の産出量は生涯を通じてかなり安定しており、性別に依存しません。

トリプルインインサートプラスミド調製には約2〜3週間かかりますが、その後、保存されたプラスミドの割り当ては3年間持続します。テクニックの残りの部分は、適切に実行すれば、わずか4〜5時間で完了します。この手順を試みる際には、DNAのクロスコンタミネーションを避けるために、プラスミドに関連するすべての操作を専用の領域で行うことが非常に重要です。

また、標準管の開発後の結果を分析する際には、標準管の安定性を検証することも不可欠です。この技術は、臨床免疫学または血液学の分野の研究者に、骨髄移植後の免疫再構成の結果を監視するための一次免疫不全の同定のための改良されたツールを提供しました。このビデオを見れば、トリプルインプラスミドの取得方法、標準曲線の調製方法、リアルタイムPCR実験の実行方法、およびtraxとクラックの再現性のある絶対定量を得るために必要な計算の実行方法について十分に理解できるはずです。