Name: リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学ぶ TRECとKRECの同時定量法。リアルタイムPCRを用いて胸腺と骨髄の産出量を評価し、小児や乳児の免疫学研究に有用な手法を解説します。

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著者には謝辞がありません。

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

TREC および KREC の定量化は、いくつかの注意点が考慮されていれば、最近の胸腺および骨髄の出力の適切な推定値と見なすことができます。標準曲線を使用した絶対定量法では、リアルタイムPCR反応プレート上により多くの試薬とより多くのスペースが必要ですが、既知の量の出発物質に基づいて構築された標準曲線から未知のサンプル量が補間されるため、非常に正確な定量結果が保証されます。さらに、この方法は、少量のターゲットを検出するのに適しています。方法論的観点からは、標準曲線点に対応する凍結プラスミド希釈液が予想よりも早く分解される可能性があることが重要な点です。これには、各実験手順の前に、最初に保存されたプラスミドからの新しい希釈液、特に最も希薄なものを調製する必要があります。最終的な計算では、PBMC 量の推定値としてのリンパ球と単球数の間の不完全な等価性により、106 あたりに表される値と血液 ml あたりに表される値との間の変換にいくらかのバイアスが追加される可能性があります。全血から直接抽出された既知の量のDNAから2つのターゲット(TRECとKREC)の量を決定するための改善を行うことができ、単球とリンパ球数の必要...

T細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除組換え切除サークル（KRECs）を導く、ゲノムDNAの再結合プロセスの間に、それぞれ、T細胞およびB細胞の割合で切除される小さな環状DNAエレメントであるT-およびB細胞受容体の高度に多様なレパートリーの形成。これらは、機能を有さないが、それらは安定であり、複製できないので、それらは、それぞれの細胞分裂後に希釈され、したがって、2つの娘細胞のいずれかでのみ持続する。したがって、末梢血におけるそのレベルは、胸腺および骨髄の出力の推定値として想定することができる。 TRECアッセイは、主として胸腺出力の程度を評価するために、過去15年間にわたって使用されてきたが、最初に開発された1 KRECアッセイは、B細胞増殖および健康および疾患におけるB細胞の恒常性への寄与、2を測定するごく最近骨mのマーカーとして提案されている出力を矢印。3,4ここで、我々はTRECsとKRECs両方の同時定量化のために開発された方法について説明します。4 この組み合わせ方法では、リアルタイムPCRによってDNAの定量に関連する変動はTRECs、KRECsおよびT細胞受容体α定数の断片を含むトリプル挿入プラスミドを希釈したユニークな標準曲線の使用（TCRAC）により除去される1：1比1遺伝子。これはTRECとKRECコピー数をより正確に評価することが可能となる。また、同じ反応における2つの標的の同時定量試薬コストを低減することができる。 提案TREC / KRECアッセイは、重症複合免疫不全（SCID）、4共通変数免疫不全、5自己免疫疾患、6-8とHIV感染の小児や成人におけるT-の程度およびB細胞ネオ産生を測定するために役立ちます図9また、ために使用することができる造血幹細胞移植、10酵素補充、11および抗ウイルス9または免疫調節療法後の免疫の回復を監視する。6-8 SCID患者は、基礎となる遺伝的欠陥にもかかわらず、患者無ガンマグロブリン血症TRECアッセイを用いて認識されるため、最終的に、KREC定量を用いて同定することができる、TREC / KRECアッセイはまた、新生児スクリーニングプログラムにおいて免疫不全を検出するために用いることができる。この場合には12、テストが濾紙上にブロットし、乾燥させ、血液の小さなスポットから抽出されたDNAに対して実施する必要があり、高感度かつ特異的でなければならない対象疾患、ならびに高度に再現可能で費用対効果。 テストでKREC定量の導入は、日常的にウィスコンシン州はintroducする最初になった2008年以来、米国（WI、MA、CA）の一部で行われている免疫不全のために新生児スクリーニングの性能を向上させる必要がありますその出生後のスクリーニングプログラムにおけるTRECsの電子分析。13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>密度勾配分離法</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 血液ミニキット (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>DNA 抽出</td></tr><tr><td>未修飾 DNA オリゴヌクレオチド HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba 試薬 S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>凍結乾燥製品を100 pmol/&microに再懸濁します。l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA ポリメラーゼ:10x Buffer II および 25 mM MgCl2</sub</td><td></td> <td>N8080156</td><td></td>></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td><td>を含む Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>凍結乾燥製品を100 pmol/&microに再懸濁します。l</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c 分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アプライド バイオシステムズ 2720 サーマルサイクラー</td><td>アプライド バイオシステム/ライフテクノロジー</td>ズ <td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>ファスト 7500 リアルタイム PCR システム</td><td>アプライド バイオシステムズ/ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ SDS 配列検出ソフトウェア 1.4</td><td>アプライド バイオシステムズ/ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

リアルタイムpcrによるt細胞受容体切除サークル（trecs）とk-削除換え切除サークル（krecs）の同時定量

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T細胞受容体切除サークル(TREC)およびK-欠失組換え切除サークル(KRECs)は、T細胞およびB細胞受容体を生成する組換えプロセス中に形成される環状化されたDNA要素です。 TRECとKRECは複製できないため、細胞分裂のたびに希釈され、細胞内に残ります。 末梢血中のそれらの量は、胸腺および骨髄量の推定値と見なすことができます。定評があり、一般的に使用されているTRECアッセイとKRECアッセイの改良版を組み合わせることで、新たに産生されたTリンパ球とBリンパ球の両方を1回のアッセイで定量できるデュプレックス定量リアルタイムPCRを開発しました。TRECおよびKRECの数は、細菌プラスミドにクローニングしたTRECおよびKRECシグナルジョイントを、参照遺伝子として機能するT細胞受容体α定常遺伝子のフラグメントとともに連続希釈して調製した標準曲線を使用して取得します。結果は、TRECおよびKRECの数/ 106細胞または血液1mlあたりとして報告されます。これらのDNA断片の定量は、小児と成人の両方における骨髄移植後の免疫再構成のモニタリング、免疫不全の特性評価の改善、または特定の免疫調節薬物活性の理解を深めるために有用であることが証明されています。

24 45歳の成人 - 60（男性/メス：16分の29）： - 17（17分の25オス/メス）42 0歳の子供：アッセイは、87健常対照の代表的なサンプルで実施した。結果は、10 6 PBMCあたりTRECsとKRECsとして得られたし、その後の血液1mlあたりTRECsとKRECsを算出した。 4年- TRECsの数は、0から3の非常にシャープなファッションに特に胸腺退縮、4に年齢とともに減少します。それは、女性よりも男性においてより急速に減少するので、成人では、TREC番号は、性別に依存する。5これは非常に正確な場合には、年齢、おそらく性別に基づいて区別されるべき適切な基準範囲を設定することで問題を作成すること正規性の推定が必要である。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52184/52184fig3display.jpg"> ...

ここでは、T細胞受容体切除サークル(TREC)とK-欠失組換え切除サークル(KRECs)の同時定量化の方法について説明します。TREC/KRECアッセイは、胸腺および骨髄出力のマーカーとして使用できます。

リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

次の実験の全体的な目標は、T 細胞受容体切除サークルまたは REX と K の置換組換え切除サークルまたは修正の両方を 1 つのアッセイで定量化することにより、胸腺と骨髄の産出量を推定することです。これは、DNA増幅後に3つのターゲット間の1対1の比率を維持するために、まず、TRX修正のDNA配列と単一コピー参照遺伝子のDNA配列の断片を含むトリプルインサートプラスミドを構築することによって達成されます。次に、トリプルインサートプラスミドの段階希釈を行うことにより、標準曲線を作成し、実際のリアルタイムPCRによる3つのターゲット配列の絶対定量を可能にします。最後に、リアルタイムPCRアッセイを実行し、トレとクラックの絶対定量化を行います。報告された結果は、健康な子供と大人の年齢と性別による胸腺と骨髄の産出量の変化を示しています。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、新生児や乳児の骨髄と胸腺の出量の両方を分析する必要があったときで、通常は採血量が大人に比べて少ないことを考慮してのことです。そこで、サンプル調製と試薬のコストを最適化するために、Track and Corrects定量を1つのアッセイに2つの方法を組み合わせることにしました。この技術の意味は、原発性免疫不全および後天性免疫不全の診断にまで及びますが、この方法は、TMB細胞の喪失を伴うすべての疾患にも使用でき、骨髄移植後の新たな再構成を研究するためにも使用できますこの方法を通じて、ヒトの疾患への洞察を提供することができます。また、主にリンパ球の恒常性が関与する基礎研究にも適用できます。の主な利点は、トリプルサープラスミッドを採用することにより、単一の標準硬化のみが必要であり、実験のばらつきを減らすことです。一般に、この方法を初めて使用する方は、トリプルインサートプラスミドの調製に必要な手順が長いため、または標準曲線の調製に関連する問題のために苦労する可能性があります。まず、標準的な密度勾配分離法を使用してEDTAチューブに収集された若い健康な被験者の末梢血など、PCRによって検出可能なTRXおよび亀裂を有する可能性が非常に高い細胞を含むサンプルを取得します。末梢血単核細胞を分離し、テキストプロトコルに従って細胞からDNAを抽出した後、プライマー特異的なFort TRX REXおよびTCRアルファ定数遺伝子を使用して、レックスシグナル、ジョイントレックスシグナルジョイントおよびTCRアルファ定数遺伝子フラグメントを増幅します。PCR 2.1トポベクターのTAアクセプター部位にTraxシグナルジョイントのPCR産物を挿入し、プラスミドDNAを使用してXL One Blue化学的にコンピテントな細胞を熱ショックにより変換し、ベータラクターゼ補完を失ったアンピシリン耐性白色コロニーを新しいマスターディッ

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

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それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

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