グレースケール解析を用いたマウスの抜け毛の定量分析のための新たな手法

脱毛症は、化学療法の副作用を含む多くの異なる状態で発生する可能性のある脱毛の一般的な形態です。 私たちは、標準的なゲルイメージャーを使用してグレースケール分析を行い、マウスの脱毛を定量化する方法を開発しました。これにより、有望な新しい脱毛症治療法の研究が容易になります。

この手順の全体的な目標は、光吸収を使用して髪の密度を定量化することです。これは、最初にゲルイメージャーで動物を撮影することによって達成されます。次のステップは、写真上の関心領域を定義し、関心領域内の光吸収を決定することです。

次に、光の吸収を写真の標準と比較します。最終的には、同様に治療された動物間で光の吸収を平均化して、介入が発毛に及ぼす影響を示すことができます。この手法の主な利点は、偏りがなく、定量化可能で、再現性があることです。

これは、Inovaのような標準、統計手法を使用して結果の統計的有意性を判断できるため、非常に重要です。このプロトコルでは、反射撮影用の光源が組み込まれたゲルイメージャーを使用します。これにより、良好な光の均一性が確保されますが、トランス照明は解析に適さないシルエットを作り出します。

まず、ゲルイメージャーを準備し、焦点と視野を設定します。印刷されたテキストを使用すると、マウスの焦点が少しずれることがありますが、これは実際に機能します。関心のある小さな領域の量子誤差を減らすには、関心のある領域での優れた光学平均化を目標に、撮影された領域全体の光源の均一性を確認します。

次に、動物を準備します。急速に発症し、作用時間が短い麻酔薬を選択し、動物を静止させて撮影するのに十分な量を提供します。次に、動物をイメージャーに垂直に、できるだけ平行に近づけて配置します。

背側の写真を撮るには、動物を手足を伸ばして腹臥位に置きます。腹側の写真の場合は、動物を仰臥位に置きます。横方向に回転していないことを確認してください。

吸収値は画像間で引き出すことができますが、これはマシンが設計した目的ではありません。したがって、グレースケール標準を追加すると、データの編集時に吸収値を正規化できます。次に、撮影領域にグレースケール標準を配置します。

次に、チャンバーを閉じて、カメラのチャンバーに入る可能性のある周囲照明を減らします。F ストップを、対象領域が飽和または露出不足にならない露出に設定します。その後、写真を撮ります。

画像が飽和するようにFストップを選択した場合、グレースケール値は値に固定され、Bはまったく使用されません。次に、F.Stopを1つ変更し、対象領域と標準を線形露出範囲に保ち、撮影が完了した状態で2枚目の写真を撮ります。動物を保温台に置き、回復するまで監視します。

スターナルリカンベント。その後、動物をケージに戻し、最終的にはビバリウムに戻して完全に回復させます。ゲルイメージングソフトウェアを使用して光吸収を定量化するには、動物の画像上に関心領域をマークし、動物全体の背側から見渡します。

長方形の画像、楕円形の画像、またはフリーハンドのツールを使用して、上肢から下肢までのスペースの輪郭を描き、できるだけ横方向に伸びます。動物の腹側全体を見るために、動物の背中の縁内に保ちます。2 つの長方形を使用します。

1つは手入れされている骨盤領域を覆うため、もう1つは手入れされていない胸部を覆うためのものです。薬物が投与された場所など、関心のある小さな領域も必要に応じてマークを付けることができます。次に、グレースケール吸収標準で関心領域をマークします。

次に、マークされた各関心領域からの吸収を記録して、写真間で比較します。曝露と吸収の対数対数関係を使用して、吸収レベルをバックグラウンド標準に正規化します。これを行うには、吸収の対数に対する曝露の対数の曲線をプロットします。

グレースケール吸収基準から取得した値を使用して、各写真の基準の変動を次のように調整します。まず、ROIを読み取るためのFストップと参照用のFストップを選択し、読み取りFストップですべての写真の標準試料の平均吸収を計算します。この平均が参考基準値またはRSVです。

次に、各写真の読み取り値と参照値のFストップ設定の吸収差を計算し、標準と定義された各ROIについて同じ計算を行います。次に、1つのFストップのデータを使用して、示された式を使用して各ROIの補正吸収を計算します。これに続いて、標準的な統計的手法を適用して、脱毛症ADAをモデル化したモデルC3 HHEJ生着マウスのデータを分析し、さまざまな曝露で説明された方法を使用して分析しました。

重複しないROIの変動は、予想通り密接に相関していました。同様の比較では、3週間にわたって同じ密接な相関関係が生じました。マウスは、予想される脱毛を定量化するために画像化されました。

この期間に画像化されたマウスの80%が脱毛を示しました。比較すると、正常なC 57黒色6匹のマウスは、同じ時間枠で脱毛を示さなかった。2 番目の研究では、化学療法による脱毛症が、記載されている手法を使用して定量化されました。

マウスはシクロホスファミドで3週間治療され、2か月後には対照と比較して有意な脱毛が見られました。マスターすれば、各画像は5分以内に分析できます。このビデオを見れば、標準的なゲルイメージングシステムを使用してげっ歯類の発毛量を定量化する方法についてよく理解できるはずです。