Name: ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶロボットマイクロコンタクト印刷とシーケンシャル求核置換を用いて、組織培養基材に複数のPEGブラシパターンを作製する方法。10ミクロンの精度で直交配位子を固定化し、生物学的リガンドの空間的制御を可能にする。

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この作業、GTK、TK、およびJDMのための資金は、ウィスコンシンディスカバリー研究所とウィスコンシン同窓会研究財団によって提供されました。

1.生成エラストマースタンプ<ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMSスタンプのシリコンマスターを生成するには、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用したフォトマスクの特徴パターンを設計します。 <ol><li> 300μmの内径（ID）および1200ミクロンの中心から中心までの間隔が600μmの外径を持つ年輪の20×20のアレイとしての第1のパターンを設計します。 </li><li> 600μmのIDおよび1200μmの中心から中心までの間隔が900μmの外径を持つ年輪の20×20アレイのような第二のパターンを設計します。 </li><li>さらに、45°の角度で1200ミクロンの中心から中心までのコーナーパターンから離れ、各アレイ設計のすべての四隅に1×1mm 2の正方形の基準マークを配置。 </li><li>他の場所15またはマイクロ流体ファウンドリと共同で詳述標準的なリソグラフィ技術を用いて300μmのフィーチャーの深さに相関する、1アスペクト比：1この実験で使用するための、シリコンマスターを製作。 注：フィーチャーが100μmの基板表面と接触する前にスタンプの異常変形につながる可能性がより低いと深さ。 注：このプロトコルは、すでに作成に特殊な装置やクリーンルームを必要とするフォトレジストの記載されたパターンをシリコンマスターを取得したことから始まります。それは、これらのパターン化されたマスターを作成するために製作者や中核施設と相談するのが最善です。 </li></ol></li><li> Silanizeシリコンマスター（トリデカフルオロ-1,1,2,2- tetrahydroocty）トリクロロシラン蒸気とのインキュベーションにより、O / N。 注：シラン蒸気は非常に有毒であり、唯一の化学ドラフト内で処理する必要があります。 </li><li> PDMSプレポリマーと、60℃でペトリ皿、O / Nでシラン化シリコンのマスターの上に硬化剤PDMSの1の比率：10を硬化させることにより、シリコンの巨匠の逆レプリカを作成します。 </li><li>シリコンマスターからPDMSスタンプを外し、アクリロニトリル·ブタジエン·スチレンへのスタンプ（ABS）バッキングまたはその他の剛性材料を接合接着剤を使用してね。 注：選択した材料は、透明または生体適合性である必要はない。しかし、それはロボットのツーリングとPDMSよりも剛性とのインタフェースのための平坦な表面を提供する必要があります。 </li></ol> 2.準備カバースライド<ol style="margin-left: 40px;"><li>穏やかな窒素気流下エタノールを用いてリンスして乾燥される前に1分間、アセトン、トルエン、メタノールおよび超音波処理で顕微鏡カバースライドをすすぎ（24ミリメートル×50ミリメートル＃1）。 注：唯一の化学ヒュームフード内でトルエンとアセトンを処理します。 </li><li>集束電子ビーム蒸着器を用いて、18.0ナノメートルの金（Au）が続く〜3.5 nmのチタン（Ti）と被覆カバースライド。 注：この手順では、シリコン、ポリスチレンなどの金コーティング、種々の基材と互換性があります。それは、これらはオンサイト生成することが可能であるが、金被覆基材は、商業供給業者を介して入手可能である。 注：基板上のAu層であるべきままのTi層は、3nm以上厚さでなければならないトン以上厚さ5nmと最終基板16,17の理想的な光学特性に応じて厚さが1ミリメートルにするすべての方法を範囲とすることができる。基板は、製造のための光学的に透明である必要はない。しかしながら、製造された基板の顕微鏡分析を容易にする。 </li><li>使用直前に穏やかな窒素下でエタノールとドライと金コートカバースライドをすすぐ。 </li></ol> 3. R​​-μCP外環の<ol style="margin-left: 40px;"><li>選択的に準拠した多関節ロボットアーム（SCARA）システムとのR-μCPする前に、システムのソフトウェアを使用して、ロボットのツールエフェクターおよび付随するデュアルカメラシステムのキャリブレーションを行います。 注：これらの用具は、 図1に描かれている。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> 図1. R-μCPシステムとロボットアームツーリング。 &gt;（A）は、すべてのツールと備品付きのR-μCPシステムの大規模ビュー、（a）は、真空チャック、（b）は、試薬槽、（c）は下向きのカメラ、（d）のスタンプネスティング·フィクスチャ、（e）のロボットツール。 （B）〜（h）のABS担保PDMSスタンプを保持し、（f）は、ダイヤモンド先端エッチングツールと、（g）の空気圧吸引ツールを描いたロボットアーム工具。 <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li>手動で600μmのIDと900μmのODは年輪がスタンプネスト固定具に下向きに突出したPDMSスタンプを置く。手動図1Aに表示された真空チャックの上に新たに洗浄金被覆coverslideを置き、結合ラボ真空を使用して固定する。 </li><li>ロボットコントロールを使用して、 図2Aに示すように、金被覆coverslideの中心点の上に下向きにカメラを合わせる。 注：この時点では、最初に目視検査によって定義することができ、PDMSスタンプは非常にラーグであるため、高い精度を必要としない金コートスライドよりえー。 </li><li> 4つの基準をエッチングするためにロボットアームを指示する "X"の寸法を有する正方形の頂点のマークをロボットアームに取り付けられたダイヤモンド先端エッチングツールを使用して金被覆coverslideを中心に3.8ミリメートル3.8 mmの（ 図2Bに描かれ、自動化されたプロセス） 注：これは、すべての4つの基準マークが下向きにカメラのいずれかの視覚的なフレーム内にあるようにします。 </li><li>ロボットの空気圧吸引ツールを使用して、アップを拾うと、PDMSは、図2Cのようにスタンプネスティング·フィクスチャ上の1ミリメートルをスタンプ保持する。 （自動プロセス） </li><li> 図2DおよびEに描か上向きにカメラとLED照明リングを使用して、スタンプの正方形の基準マークを視覚化し、タイムスタンプの平均値X、Yを決定するために、カメラのソフトウェアで10回、それらを識別し、および角度は、中心からオフセットロボット工具軸。 （自動プロセス） </li><li>のように、 注：内部計算が正確に整列させるロボットシステムのソフトウェアによって実行されるスタンプの及び将来のR-μCPステップでカバースリップのX、Yの中心位置および角度オフセット。 </li><li> 図2Fに示されるように3.8）アルカンチオールATRP開始、ω-カプトブロモイソブチレート（エタノール中の2mM）の浴にスタンプを置きます。 （自動プロセス） </li><li>アルカンチオール溶液からスタンプを削除し、 図2Gのように、エタノールを蒸発させるために0.48バール（5 PSI）に加圧し窒素流の上に置きます。 1分後、窒素気流の圧力が均一な乾燥を確実にするために1.03バール（15 PSI）にある増加。 （自動化されたプロセス） 注：不完全な乾燥は、パターン忠実度の全部または一部が失われます。 </li><li>乾燥させた後、金被覆スライドの計算された中心位置の上にスタンプを移動し、 図2Hに示すようにZ軸モータ力を監視しながら、100μmの増分でそれを下げる。 注：これは、Z軸モータによって経験ロボットガイダンスソフトウェアに表示されてトルクとして伝達される。 （自動プロセス） </li><li> 79.2キロパスカルの所定の圧力が達成された後、スタンプを下げ停止し、15秒間、金でコーティングされたスライドとの接触を維持する。 （自動プロセス） NOTE：ここで、圧力値は、現在のスタンプの設計及び機能の高さのために最適化される。スタンプの設計は、試行錯誤プロセスによってこれらの相応特に高アスペクト比のスタンプ、チューニングのために、変更された場合。 </li><li>ゆっくりと金コートスライドからスタンプを削除し、バックスタンプネスティングフィクスチャ内のスタンプを置く。 （自動プロセス） </li>オール&gt; 4.マイクロパターンカバースライド上PEGMEMAのSI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li>マイクロパターンcoverslideを保持する真空圧力を解放し、50ミリリットルのシュレンクフラスコに移す。シール及び脱気シュレンクは、真空ポンプを用いてフラスコ。 </li><li>追加のマクロモノマーPEGMEMA（208.75ミリモル）、水（34.4ミリリットル）、メタノール（43.8ミリリットル）、銅（II）ブロミド（1ミリモル）、及び2 '、2ビピリジン（3ミリモル）を含むATRP反応混合物5.5mlのシュレンクフラスコ。 </li><li>反応を開始するために、水中でL-アスコルビン酸ナトリウム（454.3ミリモル）0.5 mlを加え、それが不活性ガス下、RTで16時間続けることができる。 注： 図3A-Bに示すようにL-アスコルビン酸ナトリウムの添加に続いて、反応の色が暗褐色に光が緑色からシフトする。 注：反応は16時間を超えて継続することができますが、それはかなりのPEGブラシの長さを増加させることはありません。 </li></ol><imgalt ftp_upload></imgalt> SI-ATRPの開始図3（A）反応およびL-アスコルビン酸ナトリウムを添加した後、（B）以降の色の変化の開始。 SI-ATRP手順に従ってマイクロパターンcoverslide表面の（C）の顕微鏡画像。スケールバー1ミリメートル。 <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li>シェンクフラスコからマイクロパターンcoverslideを取り外して、穏やかな窒素気流下エタノール、水、エタノール、乾燥ですすいでください。 NOTE：SI-ATRPに続いて、表面改質は、目に見えるべきであり、 図3Cのように、顕微鏡下で画像化し、分析することができる。 注：これは、それが基質を免疫染色する必要がなくなるように裁判の精度をテストするための最も簡単な方法です。 </li></ol>マイクロパターンPEGMEMA鎖の5アジド官能基化<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li> N 6 mlを加え、反応バイアルを100 mMのアジ化ナトリウムを含有するN-ジメチルホルムアミド（DMF）。 24時間37℃で、この反応を維持する。 注：唯一の化学ヒュームフード内でDMFを処理します。アジ化ナトリウムを秤量する場合は注意が必要です。 </li><li>完了後、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを除去し、窒素気流下エタノールを水と乾燥をすすぐ。 </li></ol>臭素官能化PEGMEMA鎖の6パッシベーション<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中の微細化coverslideを置きます。 </li><li> 100mMのエタノールアミンと反応バイアルに300mMのトリエチルアミンを含有するジメチルスルホキシド（DMSO）を6mlを加える。 24時間40℃で、この反応を開催しています。 注：唯一の化学ドラフト内で、DMSO、エタノールアミン、トリエチルアミンを処理します。 </li><li>完了するとマイクロパターンcoverslを削除反応バイアルからのIDEは、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。 </li></ol>内環の7、R-μCPとPEGMEMAのSI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3.12300μmのIDと小さな特徴を持つ年輪が以前にマイクロパターン年輪の内側に配置されるように年輪を突出600μmの外径とPDMSスタンプに置き換えて、 - 以前のステップ3.2および3.6で説明したように、R-μCPステップを実行する。 注：このスタンプ用の圧力閾値が132.0キロパスカルである。前述のように、これらの圧力設定は、この実験で使用されているタイムスタンプ機能のために最適化される。 </li><li> 4.4 - 以前のステップ4.1で説明したように、SI-ATRPステップを実行。 </li></ol>マイクロパターンPEGMEMAチェーン8.アセチレン官能基化<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li> 100 mMのDMSOを含有する6mlのを追加します。反応バイアルにプロパルギルアミン。 24時間室温でこの反応を維持する。 注：唯一の化学ヒュームフード内でDMSOおよびプロパルギルアミンを処理します。 </li><li>完了時に反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを削除し、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。 </li></ol> 9.銅触媒」をクリックして "アセチレンのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li>硫酸銅（15ミリモル）/トリス[（1-ベンジル1 H -1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（TBTA、30ミリモル）を6ml（1を加える：1（v / v）の水反応バイアルを562μMアジドPEG 4 -Biotinコンジュゲートを含む/ DMF）。反応を初期化するために混合物に、水中のL-アスコルビン酸（0.15ミリモル）1.2 mlを加え。 </li><li> 10秒間反応液を通してバブル窒素を、パラフィルムでバイアルを密封し、RTで24時間反応させる。 </li><li> completio時にnは、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを取り除くには、水ですすぎ、12ウェルポリスチレン皿に入れてください。 </li></ol>ビオチン化アセチレン基の10。免疫蛍光検出<ol style="margin-left: 40px;"><li>ブロックは、RTで1時間DPBS（10％ロバ血清）でcoverslideを微細化。 RTで2時間DBPSでストレプトアビジン546コンジュゲート（2μg/ ml）を（PBS中3％ロバ血清）とビオチン化アセチレン基用ステイン。 </li><li>穏やかに攪拌しながら10分間DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回すすいでください。 注： 図4Bは、このステップが完了した後、スライドの画像を示している。 </li></ol> 11.銅を含まない」をクリックして "アジのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端注：必要に応じて、この基板改質工程は、細胞培養中にその場で行うことができる。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12ウェルPにマイクロパターンcoverslideを残すDBPS以下olystyrene皿リンス。 </li><li> 20μMのDBCO-PEG 4 -Biotinを含むDBPS（または細胞培養培地）の2ミリリットルを追加し、この反応は室温で24時間継続することができ（またはインキュベータ内で37℃）。 </li><li>完了後、DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回リンス（または単にメディア変更を実行する）。 </li></ol>ビオチン化アジド基の12免疫蛍光検出<ol style="margin-left: 40px;"><li> RTで2時間2ミリリットルのDPBS中ストレプトアビジン488コンジュゲート（2μg/ ml）を（3％ロバ血清）とビオチン化アジド基用ステイン。 </li><li>穏やかに攪拌しながら10分間マイクロパターンcoverslideのDPBS中5回すすいでください。 </li><li>画像は、共焦点蛍光顕微鏡を用いてcoverslideマイクロパターン。この工程が完了した後の図4A-Cは 、スライドの画像を示している。 NOTE：組織培養アッセイのための基質を使用する場合、セクション10と、このプロトコルの12をスキップ。希望degre後に官能化のeは、窒素気流下、100％エタノール及び乾燥両面を洗浄することによって操作coverslideを滅菌する。無菌の生物学的安全キャビネットにスライドを移し、細胞播種と文化を進める前に、PBSで5回のスライドをすすぎます。 </li></ol></ol>

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<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

組織工学のための理想的な基質は、バイオインスパイアードし、それにより、ネイティブの組織内で発見の重要な生理活性リガンドの空間分布を再現することになる。彼らはまた、リガンドの時間的な調整およびそれらが向け組織形態形成および細胞運命の空間的に制限された誘導を可能にするために提示される空間パターンを可能にする動的な特性を有するであろう。このような基板の製造は、基板上の複雑かつ高度に秩序化された向きで、複数の生化学的手がかりの固定化を必要とします。 in vitroでの細胞のニッチのすべての内因性要因をシミュレートすることは無理ですが、ここで説明したR-μCPシステムは、空間的な向きのマイクロスケール制御と直交する生理活性化学の複数の領域の固定化を可能にします。 PEGブラシアレイが固定化リガンドと結合したままこ​​とを考慮すると、これらの基板の有用性をさらに増大させる生体特異的相互作用を誘発することができる、未結合PEGブラシは、タンパク質吸着に耐性のままであり、したがって、細胞接着および移動を制御するために役立つことができる。細胞外マトリックス（ECM）タンパク質ま...

同時に非ファウリング本来の特性を維持しながら、共有結合した生化学的リガンドを表示するために、PEGグラフト化表面の能力は、それらの培養基材1,2,3上のエンジニアリング·カスタムマイクロスケール環境のための理想的な選択肢となっています。リガンドコンジュゲートしたPEGブラシにより媒介される生物特異的相互作用は、個々の細胞の表現型上の生体内組織の微小環境において 、複雑な内に見られる生化学的手がかりの効果の還元主義分析を可能にします。さらに、バイオ直交性の「クリック」化学は、それらが天然のコンフォメーション4-6に示されているように、リガンドの方向性固定化を容易にすることができる。このように、PEGのマイクロスケールの空間パターニングは、固定化された生化学的手がかり6,7により誘導される細胞のシグナル伝達を研究するためにインビトロニッチでデザイナーを作成するための汎用性の高いツールですブラシ。 生化学立方の空間パターンを生成するための一般的な方法ESは、PEG共役アルカンチオールのパターンを有するマイクロコンタクト·プリンティング（μCP）金でコーティングされた基材を必要とする。その後、PEG化アルカンチオールの自己組織化単分子膜（SAM）マイクロパターンは、生化学分子の物理吸着を制限例えば、タンパク質、基板のみ8,9の非パターン化領域への。しかし、この技術によって生成されたSAMは、長期細胞培養培地中で酸化に敏感である。したがって、SAMは、アルカンチオールμCP&#39;dは、しばしば他の部位の非ファウリングの安定性10を増加させるために表面開始原子移動ラジカル重合（SI-ATRP）を用いて、PEGポリマーブラシをグラフトされる。具体的には、アルカンチオール重合開始剤のμCP、ω-meraptoundecylブロモイソブチレート、ポリSI-ATRP続いて金被覆表面上のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（PEGMEMA）モノマー、長期のマイクロパターン安定性、非有する表面を生成するPEGブラシを汚れ。さらに、これらの<html>さらに、多様な化学的部分11を提示するように改変されることが可能である。 この性質を利用して、沙ら。ら 。直交「クリック」化学を提示する多成分PEGMEMAブラシで培養基板を設計する方法を開発した。この方法では、それらは、複数の固定化リガンド6のマイクロパターンを提示する培養基材を作成するために、順次、アジ化ナトリウム、エタノールアミン、プロパルギルアミンと求核置換を散在μCP/ SI-ATRPの一連のステップを使用。新規な培養基質を設計する手動μCPと一緒にそのような化学物質を使用する可能性は計り知れないが、これは、複数のμCPステップが単一の基板上に整列することが可能な精度と正確さによって制限される。精度と高精度、再現これらの多用途の技術を用いてインビトロニッチ複合体を製造するために必要とされるであろう。 この制限に対処するためにe_content &quot;&gt;は、いくつかの自動化および半自動μCPシステムが生成されている。チャクラらカスタムスタンプはレールシステム上に配置し、使用して金被覆したスライドと等角接触させるμCPシステムを開発コンピュータ制御の空気圧アクチュエータが、この方法は、カスタムスタンプ設計の正確な製造を必要とし、複数のμCP12ステップの実行時 ​​に達成精度のnoレポートを10μmの精度を報告している。最近では、統合されたキネマティックカップリングシステムを利用する方法単一のパターンを使用して、1μm未満の精度を報告したが、正確に13を成形するための金型からのスタンプの特徴の正確な制御の欠如に起因する複数のパターンを位置合わせすることができなかった。また、従来の方法の両方は、基板は、パターン形成工程の間に固定されたままにする必要が、大幅であることができる表面改質の化学的性質の多様性を制限する利用した。切手のデザインと製造における最大の柔軟性を可能にしながらここでは、複数のμCPステップの正確かつ精密な位置合わせが可能な自動化されたR-μCPシステムについて説明します。さらに、パターニングされた基板を繰り返し、それによって連続的な求核置換を含む、多様な基質修飾化学薬品の使用を可能にする、プレス加工の間にシステムから除去することができる。基板は、化学反応を用いて操作達6,14等7の両方によって以前に細胞培養のために使用されている。したがって、我々は、複雑でマイクロパターン生化学的手がかりと培養基質の製造のためのスケーラブルな方法を開発するR-μCP逐次求核置換反応をマージした。

<table><tbody><tr><td>スカラ&nbsp;</td><td>エプソン</td><td>LS3-401ST</td><td>必要に応じて、精度を向上させたハイエンドモデルもご用意しています。&nbsp;</td></tr><tr><td>(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)トリクロロシラン</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>注意、化学ヒュームフードでのみ取り扱う必要があります。ウェーハをシラン化するときは、すべてのシランが蒸発するまで、誰もフードに入らないようにしてください。</td></tr><tr><td>Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>エルスワース接着剤株式会社</td><td>NC9020938</td>使用<td>前に真空暴露により溶液を脱気します。キット182などの代替キットもご利用いただけます。</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 カバー スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>48393106</td><td>これらは、ニーズに合わせてさまざまな寸法のサプライヤーから購入できます。</td></tr><tr><td>CHA-600 テレマーク 電子ビームエバポレーター</td><td>テレマーク</td><td>SEC-600-RAP</td><td>は専門的なトレーニングを必要とします。</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>-20°Cで保存。他のATRP開始剤は、このR-&muとして使用されてもよい。CPプラットフォームは、すべてのマイクロパターニングモダリティに適用できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>Schlenk チューブ フラスコ 50 ml</td><td>シンセウェア</td><td>60003-078</td><td>ダイアフラム付きのゴム栓が必要です。</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>MEHQおよびBHTフリーのレディカル阻害剤を含有して出荷されます。</td></tr><tr><td>メタノール(認定ACS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A412-4</td><td>注意、薬品ヒュームフードでのみ取り扱います。</td></tr><tr><td>銅(II)臭化</td><td>物シグマアルドリッチ</td><td>437867</td><td>注意、サージカルマスクで露出を制限します。</td></tr><tr><td>2,2'-ビピリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D216305</td><td>注意、サージカルマスクで露出を制限します。</td></tr><tr><td>ナトリウムL-アスコルビン酸</td><td>シグマAldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 mlホウケイ酸ガラスシンチレーションバイアルフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムアジ化</td>物<td>シグマAldrich</td><td>S2002</td><td>注意、サージカルマスクで露出を制限します。</td></tr><tr><td>N、N-ジメチホルムアミド</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>227056</td><td>注意、化学ヒュームフードでのみ取り扱います。</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>注意、化学薬品ヒュームフードでのみ取り扱います。</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T0886</td><td>注意、化学薬品ヒュームフードでのみ取り扱ってください。</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド<td>シグマアルドリッチ</td><td>276855</td><td>注意、化学薬品ヒュームフードでのみ取り扱ってください。</td></tr><tr><td>プロパルギラミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P50900</td><td>注意、化学ヒュームフードでのみ取り扱います。</td></tr><tr><td>200プルーフエタノール</td>ウィ<td>スコンシン大学材料流通サービス</td><td>2292</td><td>注意、化学ヒュームフードでのみ取り扱います。</td></tr><tr><td>アジド-PEG3-ビオチン</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>DMF</td></tr><tr><td>銅(II)硫酸塩</td>に可溶化 <td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>注意、サージカルマスクで露出を制限します。</td></tr><tr><td>トリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>14190144</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9663</td>ロ<td>バ血清汚染されたアイテムはバイオハザード物質と見なされ、それに応じて廃棄する必要があります。他のさまざまな化合物(例:BSA)が利用可能であり、この目的を果たします。</td></tr><tr><td>12ウェルポリスチレンプレート</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>プレートは、さまざまな寸法のサプライヤーから購入できます。</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-ビオチン</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>DMF</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンに可溶化、Alexa Fluor 488 共役Life</td><td>Technologies</td><td>S-11223</td> PBS<td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンに可溶化、Alexa Fluor 546 抱合Life</td><td>Technologies</td><td>S-11225</td><td>PBSに可溶化</td></tr><tr><td>ニコンA1-R 共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ニコン エクリプス Ti、A1R</td><td>エピ蛍光顕微鏡は、機能化されたマイクロパターン化された基質を画像化するのに十分です。</td></tr></tbody></table>

ロボットマイクロコンタクト印刷（r-μcp）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

組織工学では、培養中の組織形態と細胞運命の空間制御をミクロンスケールで示すことが望ましいです。グラフトポリ(エチレングリコール)(PEG)ブラシを提示する培養基質は、マイクロスケールで非ファウリング性で細胞接着抵抗性の領域、および細胞が共有結合したリガンドとの生体特異的相互作用に関与する領域を作成することにより、このタスクを達成できます。このような基質を用いて複雑な組織を設計するためには、異なる生物活性を付与するように機能化され、in vivoニッチを模倣するマイクロスケールの配向に整列した複数のPEGブラシを逐次的にパターン化する必要があります。マイクロコンタクト印刷(μCP)は、このようなグラフトPEGブラシをパターニングするための汎用性の高い技術ですが、手動のμCPはマイクロスケールの精度で行うことはできません。そこで、高度なロボティクスとソフトリソグラフィー技術、および新たな表面化学反応を組み合わせて、複雑でマイクロスケールで高秩序なパターンのPEGブラシを培養基質に作製し、直交する「クリック」ケミストリを提示するためのロボットマイクロコンタクトプリンティング(R-μCP)支援法を開発しました。ここでは、このような基板を作製するためのワークフローについて詳しく説明します。

「クリック」化学反応で官能化された直交PEGグラフト化ブラシのアレイと培養基質を設計するための手動アライメントμCP技術の使用は、以前の研究6で実証されている。しかし、これは、パターンの向きの最小の制御を提供し、多くの場合、官能化された領域の重複が生じる。ここでは、小説のR-μCPシステムは、この制限を克服するために使用され、その能力を正確にパターンを300μmIDと600μmのODが600μmの有するPEGブラシ年輪の別々のアレイ内に末端アルキン基を提示するとともに、PEGブラシ年輪の配列末端アジド基を提示するIDと900μmのODは14を示している。 PEGはアジドPEG 3 -BiotinとブラシとPEGを提示アジの反応はDBCO-PEG 4 -Biotinとブラシ提示アルキンの反応に続いて、基板は、蛍光プローブを用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡（Fを使用して画像化したigure 4）。 2つのPEGブラシアレイは、サブ10ミクロンの精度で整列させたことを計算されたカスタムMATLABプログラムを使用して、これ...

生物学的リガンドのマイクロスケールパターンで機能化された細胞培養基質は、組織工学の分野で非常に有用です。ここでは、複数のマイクロパターン化されたポリ(エチレングリコール)ブラシを使用して、生体リガンドの空間的に正確で部位特異的な固定化を可能にする直交化学を示す組織培養基質の汎用性の高い自動製造を実演します。

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

次の実験の全体的な目標は、複数のマイクロパターンPEGブラシを使用して組織培養基質を生成し、生物学的リガンドの空間的に正確で部位特異的な固定化を可能にする直交化学を提示することです。これは、金コーティングされた基板上にロボットマイクロコンタクト印刷を行うことにより、アカンチオール、A TRP開始剤の堆積アレイによって達成されます。第2のステップSIとして、マイクロパターン基板上にTRPを行い、末端臭素基を有するPEGブラシを生成します。次に、末端臭素基は、適切に調製された生物学的リガンドのIM動員を可能にするために、1つまたは2つの化学反応性基で官能基化されます。次に、プロセス全体を繰り返して、2番目の化学基で官能基化します。結果は、直交する官能基化された2つのPEGブラシを10ミクロンの精度で重ね合わせたマイクロアレイを示しています。これは、反応性基と蛍光分子の結合に続いて、カスタム画像解析ソフトウェアを使用して検証されます。手動のマイクロコンタクト印刷などの方法に対するこの技術の主な利点は、ロボットマイクロコンタクト印刷がミクロン単位の精度で複数の印刷ステップを重ね合わせることができると同時に、最大限の柔軟性と基板設計を可能にすることです。この方法によって得られる精度と逐次的な求核置換反応により、複数の生物学的リガンドで官能基化された組織培養基質を作製することができ、ミクロンスケールで硫酸塩の時間的および空間的制御を行うことができる。S-I-A-T-R-Pが登場する前は、金でコーティングされたカバースライドは、A-P-D-M-Sスタンプでパターン化されているはずでした。この比較的一般的な手順は、テキストプロトコルで説明されています。まず、バキュームを解除して、ロボットからパテントカバースライドを取り外します。次に、それを長さ50ミリリットルのschフラスコに移し、フラスコを密封し、負の30PSI真空を適用します。次に、シリンジを使用して5.5ミリリットルのA TRP反応混合物をフラスコに加え、続いてシリンジを介して水に0.5ミリリットルのLアスコルビン酸ナトリウムを追加します。反応の色が薄緑色から暗褐色に変わるのを観察します。不活性ガス下で反応を16時間継続させます。反応が完了したら、カバースライドを取り外し、エタノールですすぎ、次に水、次にエタノールですすぎます。その後、窒素でやさしく乾かします。グラフトされたP-E-G-M-E-M-Aブラシのマイクロアレイは、肉眼で見えるはずです。顕微鏡を使用して、P-E-G-M-E-M-A鎖であるAzadにこれらの変化を詳細に明らかにします。パターンカバースライドを20ミリリットルのガラス反応バイアルに移し、100ミリモルのアジ化ナトリウムを含む6ミリリットルのDMFを追加します。摂氏37度で24時間反応を続けます。翌日、パテントカバースライドをエタノールですすぎ、穏やかな窒素流下で乾燥させて、残りの臭素官能基化P-E-G-M-E-M-A鎖を鎮静化します。マイクロパターンカバースライドを20ミリリットルのガラス反応バイアルに移し、100ミリモルのエタノールアミンと300ミリモルのトリエチルアミンを含む6ミリリットルのDMSOを追加します。この反応を翌日摂氏40度で24時間進行させます。.パターンカバースライドをエタノールですすぎ、窒素流下でやさしく乾燥させます。次のステップは、2番目のPDMSスタンプを使用してロボットマイクロコンタクト印刷とそれに続くスタンピングを繰り返すことです。再度 SI A TRP を使用して、2 番目のマイクロ アレイ PEG ブラシをグラフ化します。次に、2番目のマイクロアレイP-E-G-M-E-A鎖フランソワをアセチレン官能基化します。マイクロパターンカバー。DMF中の100ミリモルプロパグアミン6ミリリットルを含む20ミリリットルのガラス反応バイアルにスライドさせます。反応を24時間進行させます。翌日、室温でパテントカバースライドをエタノールですすぎ、穏やかな窒素流で乾燥させます。その後、パテントカバースライドはビオチンエレーションの準備が整います。まず、マイクロパテントカバースライドを20ミリリットルのガラス反応バイアルに入れます。まず、ビオチンはアセチレン末端鎖を食べました。アジドPEG 4ビオチン結合体を含む6ミリリットルの硫酸銅を反応バイアルに加え、続いて1.2ミリリットルの0.15を加えます。水中のミリモルrビン酸を水で反応を初期化し、窒素で反応を10秒間泡立てます。次に、バイアルをパラフォームで密封し、反応を24時間放置します。翌日、室温でカバースライドを水ですすぎ、12ウェルポリスチレン皿に移します。次に、DPBSで室温でロバ血清を1時間後に投与し、ビオチン高揚したグループで、ストレプスDEIN 5 46コンジュゲートを1ミリリットルあたり2マイクログラムのDPBS染色で2時間後に室温で2時間染色します。カバースライドをDPBSで5回すすぎます。Tobi ITINは、azi終端チェーンをaateします。カバースリップを6ウェルポリスチレンプレートのウェルに入れ、20マイクロモルのD-B-C-O-P-G 4ビオチンを含む2ミリリットルのDPBSを塗布します。次に、カバースライドを室温で24時間インキュベートします。4の前と同様にカバースライドをすすぎ、ストレプトアビジン4 88で染色します。DPBSでミリリットルあたり2マイクログラムでコンジュゲートします。2時間後。カバースライドを再度すすぎ、顕微鏡で画像化します。このロボットマイクロコンタクト印刷プロトコルを使用します。末端アルキン基を持つPEGブラシANN UIの正確にパターン化された配列は、末端aziグループを持つより大きなPEGブラシANN UIの別の配列内でパターン化されました。アジド基とアルキン基の空間分布は、蛍光プローブのクリックケミストリーとストレプトアビジン結合を使用して観察しました。両方の蛍光チャンネルのオーバーレイは、スタンプが重ならなかった方法を示しています。アライメントの精度は、SCARの限界であるサブ10ミクロンと計算されました。印刷を行うために使用されるシステム。このビデオを見れば、ロボットマイクロコンタクトプリンティングを使用して複数のペグブラシアレイをオーバーレイするカスタム組織培養基質を生成する方法について十分に理解できるはずです。相補的なケミストリーで官能化されています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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