ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

次の実験の全体的な目標は、複数のマイクロパターンPEGブラシを使用して組織培養基質を生成し、生物学的リガンドの空間的に正確で部位特異的な固定化を可能にする直交化学を提示することです。これは、金コーティングされた基板上にロボットマイクロコンタクト印刷を行うことにより、アカンチオール、A TRP開始剤の堆積アレイによって達成されます。第2のステップSIとして、マイクロパターン基板上にTRPを行い、末端臭素基を有するPEGブラシを生成します。

次に、末端臭素基は、適切に調製された生物学的リガンドのIM動員を可能にするために、1つまたは2つの化学反応性基で官能基化されます。次に、プロセス全体を繰り返して、2番目の化学基で官能基化します。結果は、直交する官能基化された2つのPEGブラシを10ミクロンの精度で重ね合わせたマイクロアレイを示しています。

これは、反応性基と蛍光分子の結合に続いて、カスタム画像解析ソフトウェアを使用して検証されます。手動のマイクロコンタクト印刷などの方法に対するこの技術の主な利点は、ロボットマイクロコンタクト印刷がミクロン単位の精度で複数の印刷ステップを重ね合わせることができると同時に、最大限の柔軟性と基板設計を可能にすることです。この方法によって得られる精度と逐次的な求核置換反応により、複数の生物学的リガンドで官能基化された組織培養基質を作製することができ、ミクロンスケールで硫酸塩の時間的および空間的制御を行うことができる。

S-I-A-T-R-Pが登場する前は、金でコーティングされたカバースライドは、A-P-D-M-Sスタンプでパターン化されているはずでした。この比較的一般的な手順は、テキストプロトコルで説明されています。まず、バキュームを解除して、ロボットからパテントカバースライドを取り外します。

次に、それを長さ50ミリリットルのschフラスコに移し、フラスコを密封し、負の30PSI真空を適用します。次に、シリンジを使用して5.5ミリリットルのA TRP反応混合物をフラスコに加え、続いてシリンジを介して水に0.5ミリリットルのLアスコルビン酸ナトリウムを追加します。反応の色が薄緑色から暗褐色に変わるのを観察します。

不活性ガス下で反応を16時間継続させます。反応が完了したら、カバースライドを取り外し、エタノールですすぎ、次に水、次にエタノールですすぎます。その後、窒素でやさしく乾かします。

グラフトされたP-E-G-M-E-M-Aブラシのマイクロアレイは、肉眼で見えるはずです。顕微鏡を使用して、P-E-G-M-E-M-A鎖であるAzadにこれらの変化を詳細に明らかにします。パターンカバースライドを20ミリリットルのガラス反応バイアルに移し、100ミリモルのアジ化ナトリウムを含む6ミリリットルのDMFを追加します。

摂氏37度で24時間反応を続けます。翌日、パテントカバースライドをエタノールですすぎ、穏やかな窒素流下で乾燥させて、残りの臭素官能基化P-E-G-M-E-M-A鎖を鎮静化します。マイクロパターンカバースライドを20ミリリットルのガラス反応バイアルに移し、100ミリモルのエタノールアミンと300ミリモルのトリエチルアミンを含む6ミリリットルのDMSOを追加します。

氏40度で24時間進行させます。.パターンカバースライドをエタノールですすぎ、窒素流下でやさしく乾燥させます。次のステップは、2番目のPDMSスタンプを使用してロボットマイクロコンタクト印刷とそれに続くスタンピングを繰り返すことです。

再度 SI A TRP を使用して、2 番目のマイクロ アレイ PEG ブラシをグラフ化します。次に、2番目のマイクロアレイP-E-G-M-E-A鎖フランソワをアセチレン官能基化します。マイクロパターンカバー。

DMF中の100ミリモルプロパグアミン6ミリリットルを含む20ミリリットルのガラス反応バイアルにスライドさせます。反応を24時間進行させます。翌日、室温でパテントカバースライドをエタノールですすぎ、穏やかな窒素流で乾燥させます。

その後、パテントカバースライドはビオチンエレーションの準備が整います。まず、マイクロパテントカバースライドを20ミリリットルのガラス反応バイアルに入れます。まず、ビオチンはアセチレン末端鎖を食べました。

アジドPEG 4ビオチン結合体を含む6ミリリットルの硫酸銅を反応バイアルに加え、続いて1.2ミリリットルの0.15を加えます。水中のミリモルrビン酸を水で反応を初期化し、窒素で反応を10秒間泡立てます。次に、バイアルをパラフォームで密封し、反応を24時間放置します。

翌日、室温でカバースライドを水ですすぎ、12ウェルポリスチレン皿に移します。次に、DPBSで室温でロバ血清を1時間後に投与し、ビオチン高揚したグループで、ストレプスDEIN 5 46コンジュゲートを1ミリリットルあたり2マイクログラムのDPBS染色で2時間後に室温で2時間染色します。カバースライドをDPBSで5回すすぎます。

Tobi ITINは、azi終端チェーンをaateします。カバースリップを6ウェルポリスチレンプレートのウェルに入れ、20マイクロモルのD-B-C-O-P-G 4ビオチンを含む2ミリリットルのDPBSを塗布します。次に、カバースライドを室温で24時間インキュベー

4の前と同様にカバースライドをすすぎ、ストレプトアビジン4 88で染色します。DPBSでミリリットルあたり2マイクログラムでコンジュゲートします。2時間後。

カバースライドを再度すすぎ、顕微鏡で画像化します。このロボットマイクロコンタクト印刷プロトコルを使用します。末端アルキン基を持つPEGブラシANN UIの正確にパターン化された配列は、末端aziグループを持つより大きなPEGブラシANN UIの別の配列内でパターン化されました。

アジド基とアルキン基の空間分布は、蛍光プローブのクリックケミストリーとストレプトアビジン結合を使用して観察しました。両方の蛍光チャンネルのオーバーレイは、スタンプが重ならなかった方法を示しています。アライメントの精度は、SCARの限界であるサブ10ミクロンと計算されました。

印刷を行うために使用されるシステム。このビデオを見れば、ロボットマイクロコンタクトプリンティングを使用して複数のペグブラシアレイをオーバーレイするカスタム組織培養基質を生成する方法について十分に理解できるはずです。相補的なケミストリーで官能化されています。