Name: マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶマクロファージの食作用とアクチン重合の蛍光定量法。マウスJ774細胞を用いたハイスループット解析で、免疫応答と細胞運動のメカニズムを効率的に評価できます。

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著者は、RO1 DA 12104、RO1 DA 022935、RO1 DA031202、K05DA033881、P50 DA 011806、1R01DA034582(S.R.へ)およびF31 DA026264-01A1、T32 DA07097(J.N.へ)の資金源に感謝します。

注：このプロトコルは、我々の以前に発表された研究12で使用される食作用およびアクチン重合の定量化などの複数の用途に使用することができる。プロトコルの改変が種々に向いて、 表1の細胞型および粒子が正常に過去の研究で利用した。ファゴサイトーシスまたはアクチン重合の定量化のためのこのプロトコルの標準的な使用は、 図1に示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600"> 図1：食作用およびアクチン重合の定量化のための蛍光分析のダイアグラム細胞は、メッキ処理し、付着させた後、緑色蛍光（FITC）で標識された粒子は、食作用のために細胞に添加する。この反応は、トリパンまたはantibiによって停止される耳の洗浄（非内在化粒子を除去するため）、および固定を4％パラホルムアルデヒドを用いて行われる。その後、細胞を赤色蛍光アクチン標識（ローダミンファロイジン）、青色蛍光標識（DAPI）で染色する。食作用およびアクチン重合のインデックスは、緑/青（FITC / DAPI）、または赤/青（ローダミン/ DAPI）蛍光の相対蛍光単位の比として定量化される。 1.細胞をプレーティングし、治療注：開始する前に、少なくとも4技術的反復で治療を実行することを検討し、プレートレイアウトで次のコントロールが含まれていますのみ（単独DAPIまたは単独のローダミンと、染色されていない）細胞および唯一の粒子。 <ol><li>汚染からサ ​​ンプルを保護するために、無菌細胞培養フード中で1〜4を段階的にすべての試薬 ​​添加を行う。 </li><li> （ウェル）50μl中1〜5×10 4細胞で96ウェルプレート中でプレートマクロファージ（マウスJ774細胞株）の予熱されたメディアを補足。この方法のための理想的なプレートリーダ機能に応じて、透明または黒底黒色96ウェルプレートである。 <ol><li> （食作用のために生細菌を使用していない場合）を補った培地は、補体カスケードの干渉を避けるために、FBSを10％熱不活性化、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを使用する。接着細胞を使用して接着するため、非接着細胞を1〜2時間を許可する場合、500×gで10分間、細胞と共にプレートをスピンダウン。 </li></ol></li><li>を100μl（1×）の最終体積50μl中に2×濃度（補充した培地中で、より好ましくは、PBS中に再懸濁させまたは）において所望のアゴニスト/アンタゴニストまたはビヒクルコントロールを追加し、所望の時間インキュベートする。マルチチャンネルピペットと試薬リザーバは、最速の処理を容易にする。 </li></ol>蛍光粒子の2オプソニンftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "幅=" 500 "/&gt; 表1：試験済みの細胞型との蛍光分析、蛍光粒子食作用およびアクチン重合の表1は、細胞型の組み合わせ（細胞株および初代細胞）を示す我々のグループは、蛍光測定法を介して使用されていること。野生型細胞による貪食及びアクチン重合見以外の、我々はまた、GFP（緑色蛍光タンパク質）を発現するトランスフェクト細胞による食作用を調べるために、これらの粒子のいくつかを利用している。蛍光レポーターを含むプラスミドでトランスフェクトした細胞の蛍光を、またDAPI 表の凡例に加えて、細胞のマーカーとして使用することができる：A -アクチン重合。 P - 食作用。 PT - GFPによる食作用は、トランスフェクトされた細胞を標識した。 OPDex - デキストランビーズをオプソニン。 HKOP - オプソニン殺さ熱。 <ol><li>蛍光粒子とラベルを常時光から保護されていることを確認し、DURる処理、洗浄、ならびにインキュベーションの間の光退色を防止するために<ol><li>製造業者の仕様を使用して、：（ 大腸菌 K-12株E2861）乾燥粒子のために、蛍光熱殺したオプソニン（HKOP）細菌を量る。 10ために必ず大量のアカウントを作るように注意してください：1から20：1の細菌：細胞比（または少なくとも10：1の比率を-一般的に食作用の定量化に使用される）13,14。粒子数は、製造業者によって提供されるか、または1 mg / mlのストック溶液の連続希釈をcoutingを介して決定することができる。 </li><li> 50μlのPBSに再懸濁し、最高の設定で1分間ボルテックス。適切なボルテックスを確認します（ここでは、プロトコル全体）粒子がオプソニン化の有効性に影響を与える可能性が凝集する傾向があるように。 </li><li>懸濁液中の粒子のような蛍光標識デキストランビーズ（DEXビーズ）のために、ボルテックスで1分間のストック溶液は、体積dのビーズ濃度に依存して懸濁液または50μlのを取る1ビーズ：細胞比etermineは10を容易にするために、ビーズのマウント。 </li></ol></li><li>粒子へのオプソニン化試薬の等量のを追加し、激しくさらに1分間ボルテックス。 </li><li> 1時間37℃で試薬をオプソニン化した粒子をインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、500×gで5分間、粒子を遠心分離し、過剰オプソニン化試薬を含む上清を取り除く。 100μlのPBS、ペレットを再懸濁するためにボルテックスし、500×gで5分間の遠心分離を追加することで粒子を洗浄する。 <ol><li>適切なオプソニン化および非結合抗体の除去を確実にするためにこれらのステップを2回繰り返します。 </li></ol></li><li> （1 96ウェルプレートのために十分な）メディアの5ミリリットルでそれらを再懸濁することによりオプソニン化粒子のワーキング溶液を調製し、細胞に添加するまで離れて光から保管してください。 </li></ol> 3.貪食<ol><li>無菌の試薬貯蔵中の粒子の使用液を置きます。ここから、50を追加56（50ng / mlの最終濃度のための） 工程1で調製した細胞へのオプソニン化粒子のlおよび食作用は、標準的な細胞培養条件で発生することを可能にする。以下に示すこの方法（ 図2）を用いて評価することができる食作用の二つの方法がある。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600"> 図2：連続の比較に対する食作用を同期連続食作用、彼らはゆっくりウェルの底に細胞に到達するように時間をかけて粒子の連続内在化を示している。対照的な同期ステップ（遠心分離）は、細胞との粒子接触を高め、底に沈むように粒子を強制的に、そして細胞による即時の内在化につながる。シンクロナイズド食作用は、より迅速に部品を内部化より速いプロセスであり、増加した細胞に起因するicles：粒子接触。 <ol><li><ol><li>それらは徐々に底に沈むと細胞との接触、細菌がウェルの底に達するとで取得することを可能にするために、より長い時間枠を利用よう細胞が連続的にオプソニン化細菌を貪食することができ、連続貪食法（図2）のための細胞とタッチします。時間経過実験を行う場合は、異なる時間間隔で細菌を追加し、処理速度を向上すると同時に、反応プレート全体を停止させる。 </li><li>粒子を高める同期化貪食法（図2）の場合：遠心分離による細胞の接触、全ての時点の同期を容易にするために、細胞および粒子（500×gで5分）とすぐに、粒子が添加されるように、含む全プレートをスピンダウンし細胞相互作用：パーティクルを促進する。 <ol><li>右のセントリの完了後に開始時間経過を測定しますfugationステップ。経時的実験を行う場合は、以下に説明するように、異なる時間間隔で独立して、各時点で停止する。 </li></ol></li></ol></li></ol>注：同期された食作用法がやや面倒前の1からですが、短い時間でより高い貪食インデックスを提供します。 4.食作用の停止<ol><li>接着細胞の場合は、上清を除去し、PBSで希釈したトリパンブルーの50μlのを追加：非内部化細菌の蛍光を消すためには、（1 2希釈）。 </li><li>非接着細胞の場合は、プレートをスピンダウンし、上清を除去します。希釈されたトリパンブルーの50μlのを追加。細胞の損失を最小限に抑え、十分な洗浄を可能にするために、各洗浄の間（500×gで5〜10分）でプレートを遠心分離することを確認してください。 </li><li>パンインキュベーション後、（PBSをうまく明確になるから削除されるまで）任意の残留パンを削除するには、PBSで細胞を2回洗浄する。 Trはypanはなく、生きた細菌やOPDexビーズのために、蛍光標識した非内部化熱殺した、細菌粒子の蛍光15,16を消光することが示されている。生菌については、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、又は代わりに非内在化粒子からの蛍光の交絡効果を回避するために、トリパン洗浄などの抗生物質での洗浄が含まれる。 </li><li> PBSで洗浄し、次いで、4％パラホルムアルデヒド100μlで細胞を固定し、室温で15分間インキュベートする（各洗浄につきウェル当たり100μlで）。このステップでは、週間まで4℃で細胞を保存するか、染色および定量に直接進む。 注：すべてのその後の工程は、この点の序文には、細胞培養フードの外で行うことができます形成する。 </li><li>すべての液体を除去し、PBSで再構成5 ng / mlのでDAPIの50μlを添加する。染色のために5分を許可した後、PBSで2回洗浄します。洗浄工程の後、各ウェルのレコード食作用に50μlのPBSを追加。 </li> 5.アクチン染色注：食作用に加えて、蛍光測定法、アクチンの強度を測定することによってアクチン重合の定量化を可能にする、葉状仮足の阻害時に低減され、pseudopodiae、および膜は、阻害剤（ 図1A）を用いた治療の結果として波打ちう。これは食作用に加えて、アクチン重合の定量化に関心のある場合は、オプションのステップです。アクチン重合が食作用のために蛍光粒子を使用して、最終的な目標である場合はオプションです。 <ol><li>パラホルムアルデヒド固定（ ステップ4.3）に続いて、各洗浄のために、ウェルあたり100μlのPBSでプレートを2回洗う。透過化のためにPBS中の0.1％トリトンX-100の50μlを加え、室温で-5分間インキュベートする。 </li><li> （上記のように）PBSを用いて0.1％トリトンX-100を2回洗浄し、ラベの非特異的結合を回避するために、20分間、1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックしL。 </li><li>ブロッキングの後、BSA溶液を除去し、すぐにローダミンファロイジンを追加します。ローダミン染色の作業溶液を調製するには、（1プレートには十分）5mlのPBSに（製造者によって提供される）メタン酸溶液100μlを使用しています。ワーキング溶液からウェルあたり50μLを加え、室温で20分間インキュベートする。 注：4.4細胞は定量化のための準備ができてステップのように洗浄ステップとDAPI染色に続いて。 </li></ol> 6.定量<ol><li> λ= 460nmでλ= 355 nmの励起フィルターと発光フィルターを使用して、蛍光プレートリーダー、記録λ= 518 nmのλ= 488nmでの励起フィルターおよび発光フィルターを用いて緑色蛍光、および青色の蛍光を使用して、食作用を定量化する。 </li><li> λ= 355 nmおよびλ= 460nmの（上記）、および赤色インフルエンザ介して蛍光プレートリーダー、記録青色蛍光を使用してアクチン重合を定量化するλ= 584 nmおよび発光フィルターのλ= 620 nmでの励起フィルターを経由してorescence。 注：オービタルまたは中央検出は、記録のために許容可能である。いくつかの細胞型が軌道記録が有利であることができ、その場合、中央、よりよくのエッジに多くを集める。特に、軌道の周りに3点の平均値は、より正確な結果を得るために使用することができる。 </li><li>アクチンの定量化（ 図1） 対粒子標識または食作用に応じて、（DAPI）から青色蛍光読み出しによって緑色または赤色蛍光の合計RFUを分割。ハイプレート間の差異に起因して、最高の観察された傾向を説明するために、より信頼性の高い統計分析を容易にするために、（そのような= 0制御をトンと比較してのような）相対インデックスを使用。 </li></ol></ol>

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著者には競合する金銭的利益はありません。

蛍光技術の主要な制限は、実験の分散、ならびに十分に洗浄し、非接着細胞の使用に関連する細胞の喪失である。 分散は、実験を実験からの粒子の同一の番号を維持する正確な方法ではないストック溶液の調製時に秤量し、ピペッティングなどの蛍光粒子の変化によるところが観察される。 （ - ;粒子がすぐに追加および削除t = 0の対照）実験間の変動の問題に対処するために、データは％の食作用として、例えば、相対的な用語で表現または対照からの変化を折り畳むことができる。分析のこの形式は、再現性のトレンドを生成し、制御から％の食作用の値は、実験から実験に似ています。データ分析のこの種類は3-6の実験反復して統計的有意性を促進する。蛍光技術は、効果的に観測された傾向dは検討して再生するために使用することができ十分なデータ分析を利用の場合、その変動性のespite。技術のマスタリングで、それは一日に約半96ウェルプレート、または600の処理を実行する単一の科学者のために可能である。 細胞の損失は、主に、非接着細胞タイプを用いた研究において観察されている。こ...

蛍光シグナルの定量は、広く、フローサイトメトリー、PCRに至るまでの科学的方法の多数で使用される共焦点顕微鏡法、およびELISAを多重化分析をFRETされている。蛍光イメージングと定量化は、広範なアプリケーションがあり、様々な細胞プロセスの定量分析のための素晴らしいツールとなることができます。蛍光マーカーとその信号を使用すると、10年間で革命をもたらしてきた、蛍光プレートリーダーの出現は、細胞プロセスの間に放出される蛍光のハイスループット定量化が容易になった。 蛍光分析は、食作用の定量化に大きなツールとして役立つことができる。食作用は、1800 1メチニコフによる食細胞の発見以来研究されてきた。長年にわたり、種々の方法が、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫病原体2-5侵入に対する自然免疫防御に必須のこの重要なプロセスを調べるために利用されている。その後、内在化粒子（手動でまたはソフトウェアを用いて）6~8の計数によって定量した貪食された細胞を可視化するために、定量化に利用顕微鏡および立体解析技術の従来の方法。定量分析のために単独で、顕微鏡を使用するいくつかの欠点は、細菌の手動カウントが労働集約的であり、観察者の偏りが発生しやすくなることである。食作用の定量化に使用される別の方法は、細菌培養プレート上（食作用の後）細胞溶解物からの細菌のメッキの微生物学的手法であるが、この方法は、殺菌メカニズムと部分的に内在化細菌の存在を考慮するために失敗することができる。この方法は、顕微鏡に比べ、より労働集約的であると分析するのに数日かかります。フローサイトメトリー食作用を定量化するための最速、最も効果的な方法であると思われると多くのグループ9-11により利用されてきたが、高コストは、一般的で関連付けられている前述のアッセイと比較した場合、分析に必要なトゥルメントは最も高価な方法になります。 蛍光測定法は、それがコスト法外としてではない機器を使用して蛍光の公平な定量化を提供するので、粒子の内在化の分析のためのフローサイトメトリーには良い代替手段です。蛍光測定の他の追加の利点は、高効率、および標識された内在化粒子によって放出される蛍光を定量するための高スループット能力である。 蛍光法の利点は、食作用以外のプロセスの定量化に外挿することができる。例えば、蛍光分析は、細胞内または膜結合型受容体、細胞透過性/生存率の変化、トランスフェクション効率、およびアクチン重合における変調の発現の変化をもたらす任意のプロセスを研究するために適用することができる。蛍光技術の一つの欠点は、使用されるラベルに応じて、高があってもよい、ということである通常、そのようなコントロールからの倍変化またはパーセント増加として、相対的な定量化を介してデータを示すことによって解決することができる可変性を実験する実験。

<table><tbody><tr><td>1 &mu;m黄緑色の蛍光蛍光Fluo-Spheres;</td><td>分子プローブ</td><td>F8852</td><td>は50&muを組み合わせます。50&muのll opsonizing reagent 37oC で 30 分間</td></tr><tr><td>Heat killed E. coli BioParticles フルオレセイン コンジュゲート</td><td>Molecular Probes</td><td>E2861</td><td>recomposition (5 mg) in 50 &mu;PBSのlと50&muと組み合わせます。l オプソナイジング試薬を 37 °C で 30 分間;C</td></tr><tr><td>オプソナイジング試薬</td><td>Molecular Probes</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">以下のアイテムは多くのブランドで販売されていますが、この調査で使用したアイテムは次のメーカーのものです。</td></tr><tr><td>RPMI 細胞増殖培地</td><td>Gibco</td><td></td><td>10% FBS および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加; 37°C で温熱;C 使用前のC</td></tr><tr><td>蛍光プレートリーダー - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (16%)</td> <td>フィッシャー・サイエンティフィ</td><td>ックAA433689M</td>使用<td>前に4%に希釈</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>グライナー</td><td>655097</td><td>クリアまたはブラックまたはクリアボトム - ブラックプレート</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット (8 - 12チャンネル)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ(0.6 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腎臓(10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

蛍光分析の目的は、食作用および他の細胞プロセスを分析する効率的な、費用対効果の高い、高スループットの方法を提供することです。この技術は、細胞の種々の特性を調べるために、接着性および非接着性の両方の細胞型の、さまざまに使用することができる。食作用を研究する場合、蛍光技術は、マクロファージなどの貪食細胞型を利用し、蛍光が蛍光パンブルーの存在下で消滅させることができ、オプソニン化粒子を標識した。 96ウェルプレート中の付着マクロファージのメッキに続いて、蛍光粒子（緑色または赤色）が投与された細胞は、時間の種々の量のために貪食させる。蛍光粒子の内在化に続いて、細胞が内在化されていない、または単に細胞表面に付着している細菌からの蛍光シグナルの消滅を促進するトリパンブルーを用いて洗浄される。パンの洗浄の後、細胞を固定し、PBSで洗浄し、NDの細胞の核を標識するのに役立つDAPI（核青色蛍光ラベル）、で染色した。核（青）または粒子（赤/緑）蛍光のプレート読み取りを通して、簡単な蛍光定量によって、我々は緑の相対蛍光単位の比率調べることができます：青を、セルごとに内部移行し、蛍光細菌の量の貪食指数が示す決定する。洗浄のために96ウェル方式とマルチチャンネルピペットを用いたアッセイの持続時間は、データ収集の最後に、食作用の端部から、45分未満である。フローサイトメトリーを同様に使用することができるが、蛍光法の利点は、高スループット、サンプルの最小限の操作および細胞あたりの蛍光強度の迅速な定量化と評価の迅速な方法である。同様の戦略は、非接着細胞、生標識細菌、アクチン重合、および蛍光を利用する本質的に任意のプロセスに適用することができる。そのため、蛍光法は、低コスト、高throughpのための有望な方法であり、細胞プロセスの研究ではUT機能を提供します。

このプロトコルを使用して、食作用およびその後のアクチン重合を定量化する2つの主要な方法は、連続または同期化された食作用を観察することです。 顕微鏡分析（ 図1B）は、蛍光光度計が記録されているものと同等の蛍光像を示している（また、 図1を参照）。 図1Bにアクチンの赤色蛍光、FITCの緑色の268蛍光がHKOP Eをラベルです大腸菌 、核DAPI染色、および3つのすべての269蛍光体の合成画像一緒に。この画像は、効果的な食作用、アクチン重合、および非内在化粒子の効果的なパン270消光を示している。 J774細胞は、デキストランビーズを内部される場合には、それぞれ図2AおよびCに見られるように、オプソニン化および非オプソニン粒子の連続食作用は非常に匹敵する。興味深いことに、アクチン重合以下opsonoph非オプソニン化粒子の内在以下アクチン重合（ <stro...

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

次の実験の全体的な目標は、アゴニストまたはアンタゴニストの添加後の食作用プロセスまたは重合における作用の変化を定量化することです。これは、蛍光標識された粒子を食細胞に添加し、食作用が起こるのに十分な時間を確保することによって達成されます。食作用を止めるための第2のステップとして、細胞をトライアムブルーで処理して非内在化粒子の蛍光を消し、洗浄し、後でパラアルデヒドで固定します。次に、染色と定量です。細胞や粒子、DPIまたはアクチンで支持された細胞の蛍光検出を容易にするために、結果は、蛍光測定に基づいて緑、赤、蛍光、青の比率で定量化された食作用とアクチン重合に対する治療の効果を示しています。既存の方法に対するフルオロメトリック法の主な利点は、食作用の評価のための高スループットで費用対効果の高い方法であることです。これにより、サンプル操作を最小限に抑え、細胞あたりの蛍光強度を迅速に定量化できます。この方法は、この病原体のクリアランスがどれほど効果的で、どのくらいの速さであるかなど、免疫学および細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。食作用中に変化する作用重合と、アゴニストまたはアンタゴニストによって貪食または軸索重合がどのように調節されるか。手順プレートを開始するには、底が透明または黒色の96ウェルプレート内のMurine J 7 74細胞株のマクロファージを、付着細胞を摂氏37度で1〜2時間インキュベートし、プレートにアジオンを可能とします。次いで、所望のアゴニストもしくはアンタゴニストまたはビヒクル制御を、50マイクロリットルのPBSまたは補充培地中の2×濃度で細胞に添加し、所望の時間インキュベートする。このステップでは、処理、洗浄、およびインキュベーション中に、蛍光粒子とラベルが常に光から保護されていることを確認してください。光退色を防止するために、蛍光標識されたデクストラビーズなどの懸濁液中の粒子を使用するか、ストック溶液を1分間使用します。次に、蛍光粒子に同量のオプソナイジ試薬を添加し、さらに1分間激しくボルテックスします。続いて、インキュベーション遠心分離機に続いて1時間、混合物を摂氏37度でインキュベートし、粒子を5分間インキュベートした。G.500倍で、過剰なオプソナイジング試薬を含むS上清を取り除きます。その後、粒子を100マイクロリットルのPBSで洗浄します。サンプルをボルテックスしてペレットを再懸濁し、500回から500回Gまで遠心分離します。これらの手順をさらに2回繰り返して、結合していない抗体の適切な最適化と除去を保証します。イオン化粒子の作業溶液を調製するには、粒子を5ミリリットルの媒体に再懸濁します。その後、さらに使用するまで光を避けて保管してください。次に、粒子の作業溶液を滅菌試薬リザーバーに入れます。50マイクロリットルのオプソナイズ粒子を、以前に調製した細胞に最終濃度15ナノグラム/ミリリットルまで加え、標準的な細胞培養条件で食作用が起こるようにします。持続食作用法では、蛍光粒子がウェルの底に到達し、細胞と接触するまで30分から1時間待ちます。時間経過実験を行う場合は、異なる時間間隔で細菌を添加し、反応のプレート全体を同時に停止します。接着細胞のプロセシング速度を向上させるには、センネットを取り外し、希釈したトライアムブルーをPBSで50マイクロリットル追加して、トライアンインキュベーション後の非内在化細菌の蛍光を消滅させます。プレートをPBSで2回洗浄し、残留トライアンを取り除きます。次に、細胞を50マイクロリットルの4%パラアルデヒドで固定し、室温で15分間インキュベートします。次に、プレートをPBSで洗います。すべての液体を取り除き、50マイクロリットルのDPIを追加します5分間の染色後、プレートをPBSで2回洗います。その後、各ウェルに50マイクロリットルのPBSを加え、パラアルデヒド固定後の食作用を記録します。プレートをウェルあたり100マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、PBS中の0.1%Triton X 100を50マイクロリットルの細胞に加えて浸透させ、室温で3〜5分間インキュベートします。次に、0.1%Triton XをPBSで2回洗い流します。その後、細胞を1%BSAで20分間ブロックし、ラベルの非特異的結合を回避します。次に、5ミリリットルのPBSに100マイクロリットルのメタノール原液を添加して、ロッドドミン染色の作業溶液を準備します。ブロッキング後、BSAソリューションをすぐに取り外してください。50マイクロリットルの反芻フォイドと作業溶液を各ウェルに加え、室温で20分間、暗所で細胞をインキュベートします。食作用を定量化するには、プレートを蛍光プレートリーダーに入れます 波長488ナノメートルの励起フィルターと波長518ナノメートルの蛍光フィルターを使用して緑色蛍光を記録し、波長355ナノメートルの励起フィルターと波長460ナノメートルの蛍光フィルターを使用して青色蛍光を記録します。蛍光プレートリーダーを用いてアクチン重合を定量するには、波長584ナノメートルの励起フィルターと波長620ナノメートルの蛍光フィルターを介して赤色蛍光を記録し、青色蛍光を発します。355ナノメートルの波長の火と励起フィルターと460ナノメートルの波長の蛍光フィルター。次に、緑色または赤色の蛍光の合計RFUを、粒子ラベルまたは高プレートによる食作用とアクチンの定量に応じて、青色の蛍光読み出しで割ります。分散をプレート化するには、相対インデックスを使用して、観察された傾向を最もよく示し、より信頼性の高い統計分析を容易にします。この画像は、阻害剤の添加後のアクチン重合の変化を示しています。これらは偽足の形成であり、ここに膜の波立たれの変化があります。この画像では、細胞は、20対1のビーズ対細胞比で、適合した結合Xビーズを60分間内部化することを許可した。その後、細胞はパラアルデヒドで固定されたトライアンとPBSで洗浄され、アセトンで透過性があり、ロッドドミン、Fロイン、およびdpiを使用してFアクチンを染色すると、オプソナイズ粒子と未酸化粒子の連続的な食作用はかなり同等です。J 7 74細胞がデクストラビーズを内在化しているところ。興味深いことに、食作用後のアクチン重合は後の時点で遅く増加しますが、unop粒子の内在化後のアクチン重合は増加しませんが、dextra粒子を使用した食作用法はいずれも細胞生存率の変化をもたらさず、一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、一度に複数のプレートで1〜2時間で行うことができます。このビデオを見れば、食作用やその他の細胞プロセスを分析するための効率的で費用対効果の高いハイスループット法として、Fluorメトリック分析をどのように活用するかを十分に理解できるはずです。

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