マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

次の実験の全体的な目標は、アゴニストまたはアンタゴニストの添加後の食作用プロセスまたは重合における作用の変化を定量化することです。これは、蛍光標識された粒子を食細胞に添加し、食作用が起こるのに十分な時間を確保することによって達成されます。食作用を止めるための第2のステップとして、細胞をトライアムブルーで処理して非内在化粒子の蛍光を消し、洗浄し、後でパラアルデヒドで固定します。

次に、染色と定量です。細胞や粒子、DPIまたはアクチンで支持された細胞の蛍光検出を容易にするために、結果は、蛍光測定に基づいて緑、赤、蛍光、青の比率で定量化された食作用とアクチン重合に対する治療の効果を示しています。既存の方法に対するフルオロメトリック法の主な利点は、食作用の評価のための高スループットで費用対効果の高い方法であることです。

これにより、サンプル操作を最小限に抑え、細胞あたりの蛍光強度を迅速に定量化できます。この方法は、この病原体のクリアランスがどれほど効果的で、どのくらいの速さであるかなど、免疫学および細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。食作用中に変化する作用重合と、アゴニストまたはアンタゴニストによって貪食または軸索重合がどのように調節されるか。

手順プレートを開始するには、底が透明または黒色の96ウェルプレート内のMurine J 7 74細胞株のマクロファージを、付着細胞を摂氏37度で1〜2時間インキュベートし、プレートにアジオンを可能とします。次いで、所望のアゴニストもしくはアンタゴニストまたはビヒクル制御を、50マイクロリットルのPBSまたは補充培地中の2×濃度で細胞に添加し、所望の時間インキュベートする。このステップでは、処理、洗浄、およびインキュベーション中に、蛍光粒子とラベルが常に光から保護されていることを確認してください。

光退色を防止するために、蛍光標識されたデクストラビーズなどの懸濁液中の粒子を使用するか、ストック溶液を1分間使用します。次に、蛍光粒子に同量のオプソナイジ試薬を添加し、さらに1分間激しくボルテックスします。続いて、インキュベーション遠心分離機に続いて1時間、混合物を摂氏37度でインキュベートし、粒子を5分間インキュベートした。

G.500倍で、過剰なオプソナイジング試薬を含むS上清を取り除きます。その後、粒子を100マイクロリットルのPBSで洗浄します。サンプルをボルテックスしてペレットを再懸濁し、500回から500回Gまで遠心分離します。これらの手順をさらに2回繰り返して、結合していない抗体の適切な最適化と除去を保証します。

イオン化粒子の作業溶液を調製するには、粒子を5ミリリットルの媒体に再懸濁します。その後、さらに使用するまで光を避けて保管してください。次に、粒子の作業溶液を滅菌試薬リザーバーに入れます。

50マイクロリットルのオプソナイズ粒子を、以前に調製した細胞に最終濃度15ナノグラム/ミリリットルまで加え、標準的な細胞培養条件で食作用が起こるようにします。持続食作用法では、蛍光粒子がウェルの底に到達し、細胞と接触するまで30分から1時間待ちます。時間経過実験を行う場合は、異なる時間間隔で細菌を添加し、反応のプレート全体を同時に停止します。

接着細胞のプロセシング速度を向上させるには、センネットを取り外し、希釈したトライアムブルーをPBSで50マイクロリットル追加して、トライアンインキュベーション後の非内在化細菌の蛍光を消滅させます。プレートをPBSで2回洗浄し、残留トライアンを取り除きます。次に、細胞を50マイクロリットルの4%パラアルデヒドで固定し、室温で15分間インキュベートします。

次に、プレートをPBSで洗います。すべての液体を取り除き、50マイクロリットルのDPIを追加します5分間の染色後、プレートをPBSで2回洗います。その後、各ウェルに50マイクロリットルのPBSを加え、パラアルデヒド固定後の食作用を記録します。

プレートをウェルあたり100マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、PBS中の0.1%Triton X 100を50マイクロリットルの細胞に加えて浸透させ、室温で3〜5分間インキュベートします。次に、0.1%Triton XをPBSで2回洗い流します。

その後、細胞を1%BSAで20分間ブロックし、ラベルの非特異的結合を回避します。次に、5ミリリットルのPBSに100マイクロリットルのメタノール原液を添加して、ロッドドミン染色の作業溶液を準備します。ブロッキング後、BSAソリューションをすぐに取り外してください。

50マイクロリットルの反芻フォイドと作業溶液を各ウェルに加え、室温で20分間、暗所で細胞をインキュベートします。食作用を定量化するには、プレートを蛍光プレートリーダーに入れます 波長488ナノメートルの励起フィルターと波長518ナノメートルの蛍光フィルターを使用して緑色蛍光を記録し、波長355ナノメートルの励起フィルターと波長460ナノメートルの蛍光フィルターを使用して青色蛍光を記録します。蛍光プレートリーダーを用いてアクチン重合を定量するには、波長584ナノメートルの励起フィルターと波長620ナノメートルの蛍光フィルターを介して赤色蛍光を記録し、青色蛍光を発します。

355ナノメートルの波長の火と励起フィルターと460ナノメートルの波長の蛍光フィルター。次に、緑色または赤色の蛍光の合計RFUを、粒子ラベルまたは高プレートによる食作用とアクチンの定量に応じて、青色の蛍光読み出しで割ります。分散をプレート化するには、相対インデックスを使用して、観察された傾向を最もよく示し、より信頼性の高い統計分析を容易にします。

この画像は、阻害剤の添加後のアクチン重合の変化を示しています。これらは偽足の形成であり、ここに膜の波立たれの変化があります。この画像では、細胞は、20対1のビーズ対細胞比で、適合した結合Xビーズを60分間内部化することを許可した。

その後、細胞はパラアルデヒドで固定されたトライアンとPBSで洗浄され、アセトンで透過性があり、ロッドドミン、Fロイン、およびdpiを使用してFアクチンを染色すると、オプソナイズ粒子と未酸化粒子の連続的な食作用はかなり同等です。J 7 74細胞がデクストラビーズを内在化しているところ。興味深いことに、食作用後のアクチン重合は後の時点で遅く増加しますが、unop粒子の内在化後のアクチン重合は増加しませんが、dextra粒子を使用した食作用法はいずれも細胞生存率の変化をもたらさず、一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、一度に複数のプレートで1〜2時間で行うことができます。

このビデオを見れば、食作用やその他の細胞プロセスを分析するための効率的で費用対効果の高いハイスループット法として、Fluorメトリック分析をどのように活用するかを十分に理解できるはずです。