マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術
2014年11月27日
ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。
次の実験の全体的な目標は、アゴニストまたはアンタゴニストの添加後の食作用プロセスまたは重合における作用の変化を定量化することです。これは、蛍光標識された粒子を食細胞に添加し、食作用が起こるのに十分な時間を確保することによって達成されます。食作用を止めるための第2のステップとして、細胞をトライアムブルーで処理して非内在化粒子の蛍光を消し、洗浄し、後でパラアルデヒドで固定します。
次に、染色と定量です。細胞や粒子、DPIまたはアクチンで支持された細胞の蛍光検出を容易にするために、結果は、蛍光測定に基づいて緑、赤、蛍光、青の比率で定量化された食作用とアクチン重合に対する治療の効果を示しています。既存の方法に対するフルオロメトリック法の主な利点は、食作用の評価のための高スループットで費用対効果の高い方法であることです。
これにより、サンプル操作を最小限に抑え、細胞あたりの蛍光強度を迅速に定量化できます。この方法は、この病原体のクリアランスがどれほど効果的で、どのくらいの速さであるかなど、免疫学および細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。食作用中に変化する作用重合と、アゴニストまたはアンタゴニストによって貪食または軸索重合がどのように調節されるか。
手順プレートを開始するには、底が透明または黒色の96ウェルプレート内のMurine J 7 74細胞株のマクロファージを、付着細胞を摂氏37度で1〜2時間インキュベートし、プレートにアジオンを可能とします。次いで、所望のアゴニストもしくはアンタゴニストまたはビヒクル制御を、50マイクロリットルのPBSまたは補充培地中の2×濃度で細胞に添加し、所望の時間インキュベートする。このステップでは、処理、洗浄、およびインキュベーション中に、蛍光粒子とラベルが常に光から保護されていることを確認してください。
光退色を防止するために、蛍光標識されたデクストラビーズなどの懸濁液中の粒子を使用するか、ストック溶液を1分間使用します。次に、蛍光粒子に同量のオプソナイジ試薬を添加し、さらに1分間激しくボルテックスします。続いて、インキュベーション遠心分離機に続いて1時間、混合物を摂氏37度でインキュベートし、粒子を5分間インキュベートした。
G.500倍で、過剰なオプソナイジング試薬を含むS上清を取り除きます。その後、粒子を100マイクロリットルのPBSで洗浄します。サンプルをボルテックスしてペレットを再懸濁し、500回から500回Gまで遠心分離します。これらの手順をさらに2回繰り返して、結合していない抗体の適切な最適化と除去を保証します。
イオン化粒子の作業溶液を調製するには、粒子を5ミリリットルの媒体に再懸濁します。その後、さらに使用するまで光を避けて保管してください。次に、粒子の作業溶液を滅菌試薬リザーバーに入れます。
50マイクロリットルのオプソナイズ粒子を、以前に調製した細胞に最終濃度15ナノグラム/ミリリットルまで加え、標準的な細胞培養条件で食作用が起こるようにします。持続食作用法では、蛍光粒子がウェルの底に到達し、細胞と接触するまで30分から1時間待ちます。時間経過実験を行う場合は、異なる時間間隔で細菌を添加し、反応のプレート全体を同時に停止します。
接着細胞のプロセシング速度を向上させるには、センネットを取り外し、希釈したトライアムブルーをPBSで50マイクロリットル追加して、トライアンインキュベーション後の非内在化細菌の蛍光を消滅させます。プレートをPBSで2回洗浄し、残留トライアンを取り除きます。次に、細胞を50マイクロリットルの4%パラアルデヒドで固定し、室温で15分間インキュベートします。
次に、プレートをPBSで洗います。すべての液体を取り除き、50マイクロリットルのDPIを追加します5分間の染色後、プレートをPBSで2回洗います。その後、各ウェルに50マイクロリットルのPBSを加え、パラアルデヒド固定後の食作用を記録します。
プレートをウェルあたり100マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、PBS中の0.1%Triton X 100を50マイクロリットルの細胞に加えて浸透させ、室温で3〜5分間インキュベートします。次に、0.1%Triton XをPBSで2回洗い流します。
その後、細胞を1%BSAで20分間ブロックし、ラベルの非特異的結合を回避します。次に、5ミリリットルのPBSに100マイクロリットルのメタノール原液を添加して、ロッドドミン染色の作業溶液を準備します。ブロッキング後、BSAソリューションをすぐに取り外してください。
50マイクロリットルの反芻フォイドと作業溶液を各ウェルに加え、室温で20分間、暗所で細胞をインキュベートします。食作用を定量化するには、プレートを蛍光プレートリーダーに入れます 波長488ナノメートルの励起フィルターと波長518ナノメートルの蛍光フィルターを使用して緑色蛍光を記録し、波長355ナノメートルの励起フィルターと波長460ナノメートルの蛍光フィルターを使用して青色蛍光を記録します。蛍光プレートリーダーを用いてアクチン重合を定量するには、波長584ナノメートルの励起フィルターと波長620ナノメートルの蛍光フィルターを介して赤色蛍光を記録し、青色蛍光を発します。
355ナノメートルの波長の火と励起フィルターと460ナノメートルの波長の蛍光フィルター。次に、緑色または赤色の蛍光の合計RFUを、粒子ラベルまたは高プレートによる食作用とアクチンの定量に応じて、青色の蛍光読み出しで割ります。分散をプレート化するには、相対インデックスを使用して、観察された傾向を最もよく示し、より信頼性の高い統計分析を容易にします。
この画像は、阻害剤の添加後のアクチン重合の変化を示しています。これらは偽足の形成であり、ここに膜の波立たれの変化があります。この画像では、細胞は、20対1のビーズ対細胞比で、適合した結合Xビーズを60分間内部化することを許可した。
その後、細胞はパラアルデヒドで固定されたトライアンとPBSで洗浄され、アセトンで透過性があり、ロッドドミン、Fロイン、およびdpiを使用してFアクチンを染色すると、オプソナイズ粒子と未酸化粒子の連続的な食作用はかなり同等です。J 7 74細胞がデクストラビーズを内在化しているところ。興味深いことに、食作用後のアクチン重合は後の時点で遅く増加しますが、unop粒子の内在化後のアクチン重合は増加しませんが、dextra粒子を使用した食作用法はいずれも細胞生存率の変化をもたらさず、一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、一度に複数のプレートで1〜2時間で行うことができます。
このビデオを見れば、食作用やその他の細胞プロセスを分析するための効率的で費用対効果の高いハイスループット法として、Fluorメトリック分析をどのように活用するかを十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、蛍光法を用いてマクロファージ細胞株による蛍光粒子の貪食を定量化するプロトコルを紹介します。この手法により、粒子の内部化および関連するアクチン重合の高スループット定量化が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 貪食は免疫応答において重要なプロセスです。
- アクチン重合の理解は、細胞の移動性と貪食を研究する上で不可欠です。
- 蛍光法は従来の方法に比べて利点があります。
- 大規模研究には高スループット法が必要です。
研究目的
- 貪食とアクチン重合の変化を定量化する。
- これらのプロセスに対する様々なアゴニストとアンタゴニストの影響を評価する。
- 費用対効果が高く効率的な定量化方法を開発する。
使用された方法
- 蛍光標識された粒子をマクロファージ細胞に添加しました。
- 指定された時間の間、貪食が起こるようしました。
- 内部化されていない粒子はトリアームブルーを使用して消去しました。
- 細胞を固定し、蛍光の定量化のために染色しました。
主要な結果
- 蛍光法は貪食を効果的に定量化します。
- アクチン重合は蛍光比で評価しました。
- 結果は治療が貪食に与える影響を示しました。
- この方法は高スループットで費用対効果が高いことが証明されました。
結論
- 開発されたプロトコルは貪食の理解を深めます。
- 蛍光分析は細胞生物学研究において貴重なツールです。
- この方法はマクロファージを含む様々な研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This high-throughput fluorometric technique enables rapid, cost-effective quantification of macrophage phagocytosis and actin polymerization, supporting early discovery workflows where predictive confidence in target modulation is critical. By providing quantitative fluorescence readouts amenable to plate-reader analysis, the method facilitates screening of agonists and antagonists that influence pathogen clearance mechanisms. Its compatibility with 96-well formats and minimal sample handling positions it as a scalable tool for de-risking immunology and inflammation targets prior to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in phagocytic activity and actin dynamics following agonist or antagonist treatment.
- Operational Value: Supports functional target validation in murine macrophage models (e.g., J774A.1) with minimal manipulation and rapid readout.
- Predictive Value: Generates dose-responsive fluorescence ratios (green/red:blue) that inform mechanistic de-risking of immunomodulatory compounds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible phagocytic and actin polymerization signals using fluorescently labeled opsonized particles and trypan blue quenching.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and multichannel pipetting, enabling screening of compound libraries in under 45 minutes per plate.
- Quantitative Output: Delivers relative fluorescence unit (RFU) ratios suitable for statistical analysis and hit selection in primary screens.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models macrophage-mediated phagocytosis, a key mechanism in infectious disease, inflammation, and therapeutic clearance.
- Translational Continuity: Links early target engagement (e.g., receptor modulation) to functional cellular outputs like phagocytosis and cytoskeletal remodeling.
- Preclinical Utility: Enables evaluation of compound effects on actin polymerization, a process tied to cell motility and phagocytic efficiency in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where functional confirmation of immunomodulatory activity is required before advancing to preclinical efficacy models.
- Discovery Biology: Tests whether agonists or antagonists modulate phagocytosis and actin polymerization, providing mechanistic insight into immune cell function.
- Screening: Delivers high-throughput, quantitative fluorescence data enabling rapid assessment of compound effects across multiple conditions.
- Analytics: Generates normalized fluorescence ratios (e.g., green:blue or red:blue) that allow inter-well comparison and trend visualization despite plate variance.
- Translational Research: Connects molecular perturbations to cellular phenotypes relevant to macrophage function in tissue environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fluorometric platform applicable to various fluorescent probes and cellular processes beyond phagocytosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by decoupling internalized particle signal from surface-bound fluorescence via trypan blue quenching.
- Operational Value: Enables standardization across laboratories through fixed protocols for particle opsonization, washing, fixation, and staining.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional data on immunomodulatory candidates with minimal reagent cost.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on validated effects in phagocytic flux and cytoskeletal dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and plate-based fluorometry.
- Dependent on access to fluorescent plate readers with appropriate filter sets (e.g., 488/518 nm for green, 355/460 nm for blue, 584/620 nm for red).
- Necessitates standardization of opsonization protocols and particle preparation to ensure batch-to-batch consistency.
- Must account for photobleaching protection during handling of fluorescent probes.
- Limited to relative quantification; absolute particle counts require calibration with bead standards.
