縦断のために脊髄商工を移植するための手順インビボイメージング

このビデオでは、我々は生きたマウスの背側脊髄の上に慢性光学イメージング室を移植するための手順を説明します。室、外科的手順、および慢性のイメージングを見直し、実証されている。

この手順の全体的な目標は、マウスの背側脊髄にイメージングチャンバーを埋め込むことで、外科的発作を繰り返すことなく縦方向の光学イメージングを可能にすることです。これは、最初に3つの胸椎を露出させ、脊椎の上の軟部組織を取り除くことによって達成されます。2番目のステップは、チャンバーのサイドピースを使用して露出した椎骨を固定し、背側椎弓切除術を行うことです。

次に、チャンバーのトッププレートを露出した脊髄にしっかりと取り付け、シリコンエラストマーとカバーガラスを使用して密封します。最後のステップは、接着剤を使用してインプラントの周りの皮膚をシールし、動物が回復するのを待つことです。最終的に、多光子蛍光顕微鏡は、脊髄の細胞挙動と組織構造を経時的な細胞内分解能で画像化するために使用されます。

脊髄の外科的開口を繰り返すなどの既存の方法に対する新しい方法論の主な利点は、潜在的な感染、外科的外傷、動物へのストレスなど、繰り返しの手術に関連する合併症なしに、ほぼ任意の数のイメージングタイムポイントを長期間にわたって広げることができることです。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、透明なゼブラフィッシュの脊髄損傷後の縦断的イメージングの以前の成功を検討していたときでした。そこで、このパラダイムを哺乳類モデルに拡大することにしました。

この手順は、イソフッ素を使用して麻酔をかけたマウスの胸部アーチ領域を剃ることから始めます。次に、トリミングされた髪を取り除きます。次に、生理食塩水、ケトプロフェン、デキサメタゾンの混合物をマウスに皮下投与します。

綿棒を使用。ヨウ素と70%エタノールを交互に3回洗浄し、洗浄の合間に1分間待ちます。その後、切開部位の痛みを軽減するために、剃毛パッチの中心に0.125%ブピバカイン100マイクロリットルを皮下投与します。

次に、マウスをカスタムステレオアタックに転送します。直腸体温計を挿入し、顕微鏡下でブピバカインが効果を発揮するまで約10分待ちます。.メスの刃で目的の椎骨の上に5ミリメートルの切開を作成します。

その後、鈍い解剖によって皮膚の開口部のサイズを大きくします。次に、皮膚とその下の筋肉との間の結合筋膜をやさしく解離します。リトラクターで作業領域を広げ、胸部に負担がかかって呼吸を妨げないように注意するために、皮膚を後ろに保持します。

次に、吻側、その上にある筋肉を通して露出するほとんどの椎骨を一対の鉗子でつかみます。背側の突起の両側の組織を3つの椎骨から切り離して切断します。その後、背側ラミネートから上にあるすべての組織を取り除きます。

その後、脊柱の両側の端にある椎骨に付着している腱を慎重に切り取ります。きれいなクランプ面を提供するために、椎骨柱の横方向の縁からできるだけ多くの組織をそっと取り除きます。次に、残っている軟組織の椎骨を優しく創面切除します。

骨スクレーパーと綿棒を使用して、手術用ハサミを使用して不調和な組織を切り取ります。次に、リトラクターを調整して、椎骨柱を囲む組織を抑えます。皮膚と一緒に、インプラントサイドバーをデリバリーポストのプロングに取り付け、ポストホルダーに配置します。

次に、3つの椎骨をクランプします。サイドバーをしっかりと保持するのに十分な圧力を加えて使用します。次に、鉗子を使用して、3つの椎骨を水平に固定します。

椎弓切除術を行う前に、サイドバーが水平で平行であることを確認してください。その後、綿棒を使用して、固定された椎骨の背側表面を注意深く清掃して乾かします。この手順では、Vanaハサミの先端を内側の固定椎骨の硬膜外腔に挿入し、ハンドルを軽く握ります。

骨が乾燥していると、背側椎弓板に沿ってひび割れるはずです。反対側でこの手順を繰り返して、緩い椎弓板をつかみながら椎弓板を解放します鉗子で背側突起によって優しく、椎吻側と椎吻側の端にある結合組織を慎重に切り取ります。次に、0.9%生理食塩水または人工脳脊髄が綿棒で余分な水分を吸収して、脊髄を覆う血液を完全に洗い流します。

その後、骨の横方向のエッジを切り取り、インプラントのサイドバーに進みます。その後、綿棒と生理食塩水を使用して出血を制御します。骨膜の一部が剥離して脊髄を覆っている場合は、綿棒と29〜30ゲージの針を使用して組織をそっと取り除きます。

脊髄を傷つけないように注意し、緩んだ骨膜をしっかりと包まれたダトルと混同しないように注意してください。結局。骨の残りの露出したエッジを歯科、アクリル、シアノアクリレートでシールします。

接着剤が露出した脊髄に付着しないように特に注意してください。次に、4つのスロットがサイドバーの4つの穴と一直線に並び、開口部が露出した脊髄の上に来るように、トッププレートを動物に慎重に配置します。宝石商のドライバーを使用して、最初のネジから慎重に開始し、別の鉗子でドライバーのシャフトを安定させます。

この段階ではネジを締めず、最初の数本のネジ山がかみ合うように挿入します。他の 3 本のネジについても、このプロセスを繰り返します。4 本のネジをすべて所定の位置に付けた状態で、すべてのネジがしっかりと固定されるまで、各ネジを同じ小さな増分で交互に締めます。

次に、クイックシルブランドのシリコーンエラストマーを使用して、脊髄とガラス窓の間のスペースを埋め、露出した脊髄に塗布します。塗布する前に、ミキシングチップから気泡を含むシリコーンを必ず取り除いてください。次に、5mmのカバースリップをトッププレートのインサートにすばやく配置します。

液体エラストマーを徐々に圧迫して脊髄を囲むのに十分な圧力をかけますが、脊髄の圧迫には至りません。その後、滲出したエラストマーの端を歯科、アクリル、シアノアクリレートで覆い、接着剤を使用してエラストマーを周囲の骨にできるだけ接着し、エラストマーが脊髄の表面上を移動するのを防ぎます。次に、リトラクターを取り外し、インプラントの端の周りで皮膚を引き上げます。

シアノアクリレートを使用して、皮膚をインプラントの端に接着します。その後、ネジをトッププレートの翼に挿入します。その後、動物をケージに戻して回復する前に、歯科用アクリルを使用してトッププレートのネジスロットの隙間を塞

イメージングセッションの前に、マウスに再度麻酔をかけ、インプラントの露出したネジをネジ付きポストに取り付けて安定化します。この図は、慢性脊髄腔が数週間にわたって光学的に透明なままであることを示しています。これらは、手術後数分から3週間までの脊髄の白色から明るい画像です。

血管のランドマークは、すべての時点で識別できます。術後1日ではほとんど変化が見られません。高密度の線維性の異常増殖は、早ければ3日でウィンドウの一部に存在し、イメージング領域の部分的な難読化をもたらします。

軽度の血管新生も存在しますが、白色光または2つのPEFイメージングで元の血管系を覆い隠すことはありません。慢性脊椎腔は、繰り返しの手術を必要とせずに、繰り返しの多光子イメージングを可能にします。これは、脊髄の背側fiiのDRG軸索のサブセットでYFPを発現するトランスジェニックマウスの画像です。

血管系は、赤で示された血管内色素注射によって標識されました。ミクログリアの活性は、大腿部1、YFP、CX、3、CR、1、GFPダブルトランスジェニックマウスでも、軸索とミクログリアが見えるままで、経時的に追跡することができます。コントラストと解像度は、時間の経過とともに緩やかに低下します。

一度マスターしたら。この手法は、開発後に適切に実行すれば、約1時間で実行できます。この技術は、脊髄損傷後の軸索の立ち枯れの時間的および空間的な不均一性を探求する道を開きました。

そしてネズミ。