Name: マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶマウスにおける低侵襲心筋梗塞誘発法。ステレオ顕微鏡下での気管挿管と左下行冠動脈結紮により、高い再現性と生存率を確保する。免疫組織学的解析で梗塞サイズを評価し、心血管研究に応用可能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、アーヘン工科大学医学部内のInterdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen(EALのジュニア研究グループ)によって支援されました。原稿の批判的なレビューをしてくださったRusu博士とAshley Christina Vourakis氏、免疫組織化学染色の専門家の助けを提供してくださったRoya Soltan氏に感謝します。

注：本稿の実験はドイツのローにし、ヨーロッパの動物のケアのガイドラインに応じて実行されます。動物は教授R.トルバ博士A.トイブナー（動物福祉官）の監督の下で、実験動物学研究所、Universiy病院アーヘン、ドイツの動物施設で飼育されています。 1.動物ケア<ol><li>食品と専門獣医の制御および治療への適切なアクセスを保証し、専門的な治療室でマウスを保管してください。動物を移動したり、外部から購入している場合は、手順を受ける前1週間の宿泊施設を確保してください。 </li></ol> 2.挿管<ol><li> 8-10週齢麻酔雄C57BL / 6野生型マウスを100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンの腹腔内注射を用いて、25〜27グラ​​ム。つま先ピンチ反射によって麻酔のレベルを監視します。手順の間に乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を置きます。 </li><li&gt;はご自身の機関の動物飼育ガイドラインに従って、外科手術を開始する前にbuprenophine 0.1 mg / kg体重の皮下に疼痛治療を管理します。 </li><li>滅菌材料および機器を使用することにより、手術中に感染症を避けるために無菌状態の維持を保証します。 </li><li>加熱された手術台に仰臥位で麻酔マウスを置きます。小さなカミソリを使用して、腹側頸部と胸部の左半分の両方から髪を削除し、切開の前に70％アルコールで消毒します。 <ol><li>首の中央に手術はさみを用いて0.5センチの小さな正中切開を行います。皮膚の下に、滅菌した湾曲した鉗子で2脂肪体を通過し、カバー筋肉の透明性を通じて実体顕微鏡下で気管を可視化します。 </li></ol></li><li>実体顕微鏡（図1A）を使用して、ビューの下で気管に経口挿管カニューレをご紹介します。のthro金属カニューレを区別する透明組織ぐふ。そして、任意の時点（ 図1B）での動作時の位置と場所を確認してください。 </li><li>小動物人工呼吸器にカニューレを接続し、ガイドライン（毎分100〜150の間に100〜150μlの呼吸速度と一回換気量）を製造するに従って換気設定を調整します。 </li></ol> 3.心筋梗塞誘導<ol><li>剣状突起と左axila間のラインの途中に皮膚切開を0.5cm未満を実行します。基礎となるリブから筋層を分離するために鉗子を使用してください。 </li><li>胸腔は17を開かれるまで、小さなはさみを使って、肋骨の間に小さな切開を行います。慢性梗塞の場合、4 番目の肋間スペース（ 図1D）で、5 番目の肋間スペース（ 図1C）および/ ​​または虚血/再灌流モデルの中の切開を行います。より簡単なアプローチ番号の2 番目と下から3 番目 </suP&gt;肋間スペース、それぞれ）。 </li><li>胸腔を開くには、心臓を視覚化するために切開部に開創器を置きます。 </li><li>慎重に過度の線維化のプロセスを防止するための心膜を除去します。 </li><li>深い位置し、光赤容器として下降冠状動脈（LAD）、左を可視化します。 LADを可視化することができない場合には、再現性を高めるためにいくつかの基準点を考慮する。 <ol><li>慢性心筋梗塞モデルでは、 図1Cに示すように、基準として静脈を有し、（耳介と頂点の間）は、心臓の腹側の中央に合字を配置します。貫​​前部と後部梗塞を得るために0/7シルク縫合糸を用いて、動脈の両方の枝をバインドします。灰色は、結紮糸の位置を示し、（ 図1C）必要に応じて繰り返すことができます。 </li><li>虚血/再灌流モデルでは、LADの本体（ 図1D）の上に、耳介の下で合字を配置します。のらくら過ごしますatureは、血管の完全性を保護するためのシリコンチューブの上に配置されています。グレー色は、梗塞領域を示し、心臓全体（ 図1D）に表示されます。虚血期間中に肋骨に一時的な縫合糸を置き、組織乾燥を避けるために圧縮を使用して湿らせます。虚血後、シリコンチューブを取り外し、再灌流を可視化するために、小さなはさみで縫合糸を切断します。 </li></ol></li><li>手続きの開始時に使用される麻酔薬や鎮痛薬の横（2.1および2.2ステップ）、動物の適正な快適性を確保するか、ご自身の機関の動物保護ガイドラインに従うことを手術中に0.5％イソフルランを使用しています。 </li></ol> 4.縫合と回復<ol><li>暖かい等張塩溶液で充填することによって胸部から残留空気を排除します。 </li><li> （ 図2Aおよび図2Bに示すように）3縫合糸0/6で胸部を閉じます。のように保証するために、90°の角度で内側縫合糸を置き図2に示すように、リブの閉鎖をealed（ 図2A、B）。 </li><li> 2縫合糸（ 図2C）と3-4縫合糸0/6（ 図2D）と皮膚と筋層を閉じます。さらに心エコー測定のための適切なウィンドウを取得するために別々にこれらの縫合糸を実行します。 </li><li>人工呼吸器からの挿管カニューレを外し、自発呼吸を可能にします。後で識別のために、ローカルシステム（ご自身の機関から動物福祉担当者に依頼）を使用して、マウスをマーク。 </li><li>それが目を覚ますまで、赤灯の下で左側にマウスを下にして置きます。それは十分な意識を取り戻したまで無人動物を放置しないでください。完全に回復するまで、手術を受けた動物は他の動物の会社にすることはできません。 </li><li>ご自身の機関の動物保護ガイドラインに従って、次の3日間buprenophine 0.1 mg / kg体重、皮下での疼痛治療を管理します。 </li&gt; </ol>心筋梗塞の5分析<ol><li>駆出率、短縮率、心拍出量、心臓の大きさ：定期的に心エコー検査（ 図3A）を用いた心機能を監視します。 </li><li>を100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンの腹腔内注射を使用して動物を麻酔。反射の欠如によって手術前に適切な麻酔を確認してください。 </li><li>胸腔を開き、心臓を切り出し、広範囲に残った血液の滅菌PBS溶液洗浄に置きます。 </li><li>必要に応じて、胸腔から、梗塞領域の損傷を回避することにより、または心臓を除去した後に心臓から血液を直接採取。 </li><li>洗浄後、飽和KCl溶液中diastola心臓を停止（sterilをPBS中の3MのKClろ過しました）。組織学的分析のために10％ホルマリン中に心臓を修正し、ステップ5.7に進みます。 </li><li>必要であれば、車の生存率を測定しますエバンス·ブルー/トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色によってダイアック細胞。洗浄することなく、最初の場所で合字を再構築した後、大動脈カニューレを使用して、200μlの1％エバンスブルー溶液で心臓を灌流し、-20℃で、小さなビニール袋に心を凍結します。 <ol><li> 2時間後、鋭利なメスを使用して、5横方向のスライドを行い、製造することにより記載されるように、37℃でのTTC溶液中で10〜15分間それらをインキュベートします。 10％ホルマリン中で10分間、スライドを修正し、さらなる分析のために顕微鏡スライドの間に置きます。 </li><li>横断切片を実行するために、先端に心を配置することによって、パラフィンに心臓組織を埋め込みます。 5ミクロンの連続切片を実行します。最初の20のセクションを収集し、次の300ミクロンを捨てます。僧帽弁のレベルに達するまで部分プロトコルを続けた（ 図3A、B）。連続切片は、離れて心臓全体に沿って400ミクロンを収集し、Fを染色することができますまたは定性的および定量的分析。 </li></ol></li><li>ゴモリのワンステップ染色6-8を使用して、梗塞サイズを測定します。 </li><li>血管新生、コラーゲン含有量または通常の免疫組織染色を使用して、シリアルセクション内の炎症細胞の動員を分析します。 </li></ol>

<ol><li>Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+after+myocardial+infarction%2C+between+fantasy+and+reality%3A+the+role+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).</li>
<li>Liehn, E. A., Radu, E., Schuh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+contribution+in+stem+cell+engraftment+into+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemokine contribution in stem cell engraftment into the infarcted myocardium.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 8 (4), 278-283 (2013).</li>
<li>Alexander, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+transplantation+of+different+cell+types+sequentially+improves+heart+function+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Repetitive transplantation of different cell types sequentially improves heart function after infarction.</a> J Cell Mol Med. 16 (7), 1640-1647 (2012).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+protective+and+detrimental+effects+of+endogenous+macrophage+migration-inhibitory+factor+mediated+by+CXCR2+in+a+mouse+model+of+myocardial+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized protective and detrimental effects of endogenous macrophage migration-inhibitory factor mediated by CXCR2 in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (9), 2180-2186 (2013).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ccr1+deficiency+reduces+inflammatory+remodelling+and+preserves+left+ventricular+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ccr1 deficiency reduces inflammatory remodelling and preserves left ventricular function after myocardial infarction.</a> J Cell Mol Med. 12 (2), 496-506 (2008).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+monocyte+chemotactic+protein-1%2Fchemokine+CC+motif+ligand-2+competitor+limiting+neointima+formation+and+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A new monocyte chemotactic protein-1/chemokine CC motif ligand-2 competitor limiting neointima formation and myocardial ischemia/reperfusion injury in mice.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1847-1857 (2010).</li>
<li>Liehn, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+role+of+the+CXCL12%2FCXCR4+axis+in+experimental+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Double-edged role of the CXCL12/CXCR4 axis in experimental myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2415-2423 (2011).</li>
<li>Oral, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+KC+fails+to+induce+neutrophil+infiltration+and+neoangiogenesis+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine KC fails to induce neutrophil infiltration and neoangiogenesis in a mouse model of myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 1-7 (2013).</li>
<li>Projahn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+intramyocardial+release+of+engineered+chemokines+by+biodegradable+hydrogels+as+a+treatment+approach+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Controlled intramyocardial release of engineered chemokines by biodegradable hydrogels as a treatment approach of myocardial infarction.</a> J Cell Mol Med. 18 (5), 790-800 (2014).</li>
<li>Schuh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+mechanism+of+cell-based+therapy+after+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Discoveries%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the mechanism of cell-based therapy after chronic myocardial infarction.</a> Discoveries. 1 (2), e9(2014).</li>
<li>Schuh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+SDF-1+alpha+on+Endogenous+Mobilized+and+Transplanted+Stem+Cells+in+Regeneration+after+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Effect of SDF-1 alpha on Endogenous Mobilized and Transplanted Stem Cells in Regeneration after Myocardial Infarction.</a> Curr Pharm Des. 20 (12), 1964-1970 (2013).</li>
<li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiovascular diseases.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).</li>
<li>Kanzler, I., Liehn, E. A., Koenen, R. R., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+therapeutic+approaches+to+reduce+acute+atherosclerotic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory therapeutic approaches to reduce acute atherosclerotic complications.</a> Curr Pharm Biotechnol. 13 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%3A+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li>
<li>Kolk, M. V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAD-Ligation%3A+A+Murine+Model+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction.</a> J. Vis. Exp. (32), 1438(2009).</li>
<li>Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+bone+marrow+mononuclear+cells+using+injectable+fibrin+matrix+enhances+neovascularization+in+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantation of bone marrow mononuclear cells using injectable fibrin matrix enhances neovascularization in infarcted myocardium.</a> Biomaterials. 26 (3), 319-326 (2005).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, J., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure+in+Rat%3A+Double+Thoracotomy+for+Myocardial+Infarction+and+Epicardial+Implantation+of+Cells+and+Biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix.</a> J. Vis. Exp. (91), e51390(2014).</li>
<li>Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Murine+Model+of+Myocardial+Ischemia-reperfusion+Injury+through+Ligation+of+the+Left+Anterior+Descending+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery.</a> J. Vis. Exp. (86), e51329(2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

挿管、胸腔とLAD結紮を開く：手順の間に、いくつかの重要な留意すべき点があります。最初の重要なステップはexperiements前に動物の挿管です。多くのグループが気管に直接カニューレを挿入するために、マウスと光の光源を固定するための垂直方向のサポートを使用しています。この方法は、気管にカニューレの正しい挿入に関する不確実性があり、初心者による故障を最も受けやすいです。小切開を作り、カニューレの位置は、このように、デフォルトの速度を低下させる、全体の操作中に制御することができます。また、気管切開は、このような合併症を減少させ、作業の時間を短縮上回ります。 次の重要なステップは、胸腔の開口部です。胸骨正中切開は、動物の回復を遅らせるリスクの高い操作を表します。 2-3リブ15の切断を意味する横方向左側の切開</SUP&gt;、欠損回復および死亡率の増加につながります。我々は最小限の負担を提供するリブ間のモデル、小さな、離散切開に使用されます。動物は、手術後に非常に迅速に回復し、存在する欠陥や乱れ治癒をしません。下間肋骨空間を基準点としました。この、合字慢性のための場所および虚血/再灌流モデルに適切かつ差別のアクセスを考慮すると、深刻な問題が発生しません。 合字自体は最も重要なステップです。左下降冠状動脈を可視化することが困難である、とすることなく、多くの場合、ビューバインドする必要があります。したがって、いくつかの解剖学的基準点は、正確な連結を行うために外科医を助けるために指摘されています。慢性梗塞モデルについては、合字は、主要な前部静脈（ 図2B）の終了の上、耳介と頂点の間、心臓の腹側の中央に配置されています。効率がCONTROすることができます被災地のグレー色の外観を視覚化することによってlled。梗塞領域は前方に表示され、後壁が含まれていない場合、新たな縫合糸は、第1の縫合糸の左側に配置することができます。 LADの主なルートは、耳介18の下に常に表示され、したがって、この部分を検出する際に重大な問題を提示しません。しかし、耳介は出血の主要なリスクを提示し、慎重に処理する必要があります。 手順は、適切な装置の存在によって制限されます。小動物用人工呼吸器と適切な麻酔システムは高価であり、部屋のガスや換気システムへの接続が必要です。また、動物の厳重な管理が可能な臨床を検出するための手順の後の最初の週に必要です。実験中の心臓機能を調べるために、高解像度の超音波、複合ランゲンドルフ灌流システム、または小室内カテーテルの測定が必要とされる、INV高いコストと、追加の専門知識をolving。 心筋梗塞を考慮すると、in vitroでのイベントの複雑さを再現するために利用可能な代替方法はありません。注目点に応じて、ランゲンドルフシステム内の孤立した心臓のex vivo灌流が異なる刺激や薬物に反応して収縮、心機能や心筋生存性についての情報を提供します。しかし、血液成分および免疫系のすべての干渉を除外し、それは、心筋梗塞後のリモデリングおよび治癒の長期研究のために示されていません。 心筋梗塞の手順を実行した後、他のすべての機能解析は、超音波（小動物用超音波システム）、脳室内の圧力測定と同様に行うことができ、または単離された心臓ランゲンドルフ灌流。また、すべての生物学的および分子分析は、細胞、タンパク質、mRNAを、マイクロRNA、GEを同定することができますNEまたは心筋梗塞の新たな治療戦略を開発するための治療標的として用いることができる他のバイオマーカー。

心筋梗塞は、先進国における死亡の主な原因の一つです。診断および治療アプローチの紛れもない進歩にもかかわらず、心血管疾患は、依然として死亡の主な原因です。改善された平均寿命や生活関連のリスクを考えると、心血管疾患の発生率の継続的な増加は、将来的に期待されています。したがって、心臓血管疾患の治療のための新規なアプローチを確立し、検証する強い必要性があります。ヒト試験の情報が制限を受ける、これらの研究は、一般的に説明し、これらの主要な健康問題の解決策を提供することができない、分子レベルでのメカニズムを理解するには不十分です。 また、基本的な研究は、実験室における心血管疾患のメカニズムを再現するために複雑かつ困難のために制限されてきました。したがって、有酸素運動の病態生理に関する知識を高めるために血管疾患は、動物モデル1,2を検証することが不可欠です。しかし、心筋梗塞後の治癒に関与する分子事象の全カスケードを同定するために、異なる時点での分析は、動物実験の大多数を引き起こす必要があります。 心筋梗塞の実験は、多くの場合、動物モデルを使用して実行されます。小動物3-11に心筋梗塞を誘発すると、大きな動物モデルよりも細胞および分子事象を調査するために使用される最も適切かつ効率的なモデルです。しかも、他の種は、マウス12のようなトランスジェニックまたはノックアウト株の利用可能性を提示しません。これらのマウスモデルは、13,14（ステント再狭窄で、アテローム性動脈硬化症のような）は、心血管の病変を含む他の疾患において非常に有用です。また、低妊娠期間と子孫の数が多いと、心筋INFAの分子メカニズムを研究するために最も魅力的なシステムとして、マウスモデルを修飾しますrction 12。 それにもかかわらず、マウスにおける心臓の大きさは、マイクロサージェリーの間に、操作の高精度を期待しています。このような資格と熟練した手術の担当者を教えることは、時間がかかり、作業集約的なプロセスです。したがって、我々は、ここにあっても、このようなマウスでは、複雑な心筋梗塞モデルを実行するには、学生や技術者としての平均の資格、と協力者を導くためのヒントやトリックを含む詳細な顕微手順を提示します。 最初に、挿管が気管切開を使用せずに短いカニューレを用いて行われます。胸部切開は肋骨および/または周囲の組織の損傷を回避し、肋間エリアに位置しています。このサブステップでは、高速回復と癒し15を確実にするために非常に適切です。まだかなりの梗塞の大きさを維持しながら、結紮は、高い生存率のために、慢性的虚血および虚血/再灌流モデルに対する微分とします。我々の経験は、股関節を示しています絹縫合糸を用いて、tが凍結傷害16に比べて高い再現性を保証します。 結論として、ここに記載された方法は、小動物の両方の慢性虚血及び虚血/再灌流モデルに適用可能です。この手順で提示ヒントやトリックは、小さな動物モデルでそれを適用することさえ低いか平均の資格を持つ人材を有効にすることを意味します。

<table><tbody><tr><td>実体顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>マウスベンチレーター</td><td>ハーバード装置730043</td><td></td><td>モデルMinient 845</td></tr><tr><td>デュアル麻酔システム(卓上バージョン)</td><td>ハーバード装置</td><td></td>実験室<td>のテーブルで使用するための自己完結型イソフルランベースの麻酔ユニット、コンパクトな8インチ×11インチのフットプリント。</td></tr><tr><td>挿管カニューレ</td><td>ハーバード装置</td><td>732737</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST, ドイツ</td><td>9119700</td><td>標準先端湾曲 0.17 mm x 0.1 mm</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>FST, ドイツ</td><td>9146011</td><td>ストレート</td></tr><tr><td>Vannas はさみ</td><td>Aesculap, ドイツ</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>リトラクター</td><td>FST, ドイツ</td><td></td><td>1820010 2.5mm 幅</td></tr><tr><td>リトラクター</td><td>FST、ドイツ</td><td>1820011</td><td>5 mm幅</td></tr><tr><td>ワイヤーハンドル</td><td>FST、ドイツ</td><td>1820005</td><td>&nbsp;10 cm</td></tr><tr><td>ワイヤーハンドル</td><td>FST、ドイツ</td><td>1820006</td><td>&nbsp;14 cm</td></tr><tr><td>ケタミン10%</td><td>CEVA、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン2%</td><td>Medistar、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene目と鼻のクリーム</td><td>バイエル、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>IFK Isofluor、ドイツ</td><td>カスタムメイド&nbsp;製品</td><td>直径500&マイクロ;m</td></tr><tr><td>セクションの厚さ100&micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエチレンカテーテル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROLENE 縫合糸 6/0&nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>ポリプロピレンモノフィラメント縫合糸、吸収不能、針CC1、13 mm、3/8</td></tr>サークル<tr><td>7/0シルク</td><td>セラフレックス</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>超音波&nbsp;</td><td>Vevo, Canada</td><td>770 ヴェボ</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

心筋梗塞は、まだ最後の数十年で、ステントの開発エリアにかなりの進歩にもかかわらず、欧米諸国における死亡の主な原因です。根底にあるメカニズムの解明や新たな治療戦略の開発のために、有効な動物モデルの可用性が必須です。我々は、心筋梗塞に対抗するために、インビボ条件下で 、心血管疾患の発症機序に新たな洞察を必要とするので、動物モデルの妥当性は重要な側面です。しかし、動物の保護は、このコンテキストでは非常に関連しています。したがって、我々は、高い再現性および動物の生存率を保証するマウスにおける心筋梗塞の低侵襲性と単純なモデルを確立します。したがって、このモデルは、動物実験のための3R原則（交換、洗練縮小）の要件を満たし、cardiovため治療戦略のさらなる開発のために必要な科学的知見を保証しますascular疾患。

心筋梗塞手順は25~30分以内に発生し、10％の死亡率を示しています。手術後、マウスは、次の15分以内に麻酔から回復します。物理的な障害は、操作マウスに観察されませんでした。修復プロセスは、炎症期中に乱れている場合は、一週間後の慢性心筋梗塞後の心臓破裂のリスクが高いが、そこにあります。心臓がポンプの間に大幅にその寸法を変更することができるので、収集されたすべての心はdiastolaで、例えば、同じ位置に停止させるために、それは重要です。これは、飽和KCl溶液で心臓を灌流することによって達成することができます。細胞外K +濃度のブロックにイオンポンプの増加、心臓活動の拡張期停止をもたらす、心筋細胞の膜静止電位が低下します。 梗塞領域は、超音波分析（ 図3A、下のパネル）に見ることができます。と比較して正常心筋は、虚血性領域が薄く、運動低下（ 図3A、上部パネル）が表示されます。使用モデルに応じて、梗塞サイズが異なります。虚血/再灌流は、薄い、中間壁を誘導し、すべての心臓（ 図3C）を通じてながら慢性心筋梗塞モデルは、頂点（ 図3B）の円形経壁梗塞を誘導します。梗塞サイズを決定するための多くの方法があります。目的は、心臓の生存能力に直接影響を分析する場合、18染色エバンスブルー/ TTCは、心筋内の任意の変化を見ることができるように、少なくとも2時間の再灌流後に行うことが示されています。切片を染色した後（ 図3B、中央パネル）直ちに分析することができ、または2-3日（ 図3C、中央のパネル）のためにホルマリン中のガラススライドの間に保つことができます。青色の部分は、虚血の影響を受けていない、健康な心筋を表します。赤のエリアには目の内側に生存心筋を表します電子虚血領域（リスク心筋）、および白色領域は、死んだ組織を表します。通常は、梗塞サイズが危険領域からのパーセントとして表されます。 プロセスを改造した後、得られた成熟した瘢痕は、簡単にゴモリのワンステップ染色を用いてimmunohistolgyて測定することができます。ブルー染色梗塞及び赤色に染色された健康な脳室領域（ 図3BおよびC、右側パネル）は、僧帽弁までの各レベルからの最初のセクションで決定されます。により異なるレベルでLADの結合に変化を避けるために、すべてのセクションから梗塞を考慮し、総左心室容積のパーセンテージとして表されます。虚血/再灌流モデルの後の慢性心筋梗塞モデルにおいて10〜15％で15〜20％の梗塞容積を達成することができます。また、慢性梗塞モデルが強調さ拡張を誘導する、虚血性/再灌流モデルでは観察されなかった（ 図3BおよびC RIGHTパネル）。 筋線維芽細胞（緑色、 図4B）を決定する（赤色、 図4A）または平滑筋アクチン染色の血管形成を明らかにするために使用されるCD31染色：従来の染色手順のような、使用することができます。二重蛍光染色も、心筋細胞の欠如には、自動免疫蛍光（ 図4C）を与えないので、梗塞領域内の異なる標的分子を同定するために適用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg"> 図1： 挿管のカニューレの内側切開および挿入（A）。組織（B）の透明介して金属カニューレの実体顕微鏡視覚化。気管リング（青矢印）とカニューレ（黒い矢印）が指摘されています。慢性梗塞MO用肋間切開デルとLADの結紮糸（C）。結紮を基準として静脈（青の模式的、下のパネル）の終わりを取って、（下のパネルの黒耳介と頂点の間、）心の真ん中に位置しています。動脈の両方のブランチは（下のパネルで赤）バインドする必要があります。グレー色は、梗塞領域を示し、それが心臓（右下のパネル）の下半部に表示されます。虚血/再灌流モデルの合字は、シリコンチューブ（右側）（D）を介してLADの本体（下のパネルで、赤）に結合、耳介の下で行われます。グレー色は心臓全体（右下のパネル）上に存在する梗塞領域を、示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg"> 図2： （C、左パネルのオング&gt;リブ縫合シール胸部切開内側縫合糸は、慢性（A）の両方で90°の角度及び虚血/再灌流モデル（B、左パネル）に位置している場合。in vivoイメージング）、筋縫合糸（C、中央パネル）および皮膚縫合糸（C、右パネル）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg"> 図3：心エコー画像 。 （A、上パネル）正常および梗塞領域（A、下のパネル）の画像は、長軸（縦、左パネル）または短軸（横方向、右パネル）で取得している..梗塞慢性リガチャーによって誘発されます（B）および再灌流（C）に続く1時間の虚血による。エバンスブルー/ TTC染色は、灌流（青）/非灌流領域だけでなく、実行可能な（赤）/デッド（白）心筋（B、C、中央のパネル）の同定を可能にします。ゴモリのワンステップ染色は梗塞領域（青）の同定を可能にし、正常領域（赤）（B、C、右パネル）からそれらを区別しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg"> 図4：異なる染色を説明新血管新生（A、赤、単純な矢印）、このようなCD31のように、梗塞領域で行うことができ、または筋線維芽細胞のための平滑筋アクチン（B、GREEN、単純な矢印）、ならびに二重染色（C、CD31-赤/平滑筋アクチン緑）、核（青）のためにDAPIで対比。筋線維芽細胞は、常に内皮層（C、矢印）を伴う小規模または大動脈からの平滑筋細胞から容易に区別することができます。二重矢印は赤血球の自家蛍光を指します。スケールは50μmでバー。

最小限の侵襲操作によるマウスの心筋梗塞の再現性の高いモデルが記述されています。モデル化が容易に行えるため、高い再現性と生存率を実現しています。したがって、記載されているモデルは、3Rの原則(Replacement(置換)、Refinement(改良)、Reduction(リペアメント)、Refinement(リファインメント)、Reduction(リダクション)の要求に応じて、必要な動物の数を減らします。

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

この手順の全体的な目標は、低侵襲操作でマウスに再現性の高い心筋梗塞を誘発することです。これは、実体顕微鏡下で挿管することで、手術中の挿管カニューレの位置を制御することで達成されます。2番目のステップでは、肋骨の間に目立たない横方向の左切開が行われ、胸腔が開き、迅速な治癒が容易になります。次に、左下行冠状動脈の結紮糸を、適切な下流の操作に従って配置します。最終的に、梗塞の大きさと形状は、標準的な免疫組織形態分析によって評価できます。この手法は、既存の手法の主な利点として、低侵襲で再現性が高く、実行が容易であるため、経験の少ない研究者でも小動物モデルに適用できる点が挙げられます。一般に、この方法に不慣れな個体は、マウスの心臓のサイズが高精度の操作を必要とするため、苦労します。マイクロサージェリー中。麻酔をかけた8〜10週齢のオス、C 57 BL 6野生型マウスを加熱された手術台の仰臥位に置くことから始めます。つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認した後、動物に眼軟膏を塗布し、小さなカミソリを使用して腹側頸部の毛を取り除き、胸部の左半分を70%エタノールとひなの皮膚で皮膚を消毒します。次に、首の中央に0.5センチの小さな中央切開を行います。皮膚の下に入りたら、一対の滅菌湾曲した鉗子を2つの脂肪体に通して、覆う筋肉を通して気管の視覚化を容易にします。実体顕微鏡を使用して、挿管カニューレを気管に経口導入します。カニューレは透明な組織を通して観察する必要があります。器具の適切な配置を確認した後、カニューレを小動物の人工呼吸器に接続し、換気設定を一回換気量100〜150マイクロリットル、呼吸数を毎分100〜150回の吸引に調整して、心筋梗塞を誘発します。次に、剣状突起と左Xiの間の皮膚に0.5センチメートル未満の長さの切開を行います.次に、鉗子を使用して、慢性梗塞のために筋肉層を下の肋骨から分離します。虚血再灌流モデルのために、5 番目の肋間腔を切開します。4番目の肋間腔を切開します。次に、切開部にリトラクターを配置して胸腔を開き、心臓を視覚化します。次に、心膜を慎重に取り除いて過度の線維化プロセスを防ぎ、左の下行冠状動脈を深く位置した明るい赤い血管として視覚化します。慢性梗塞モデルの場合は、左下行冠状動脈を基準として、心臓の腹側の中央に甲骨と頂点の間に結紮糸を配置します。次に、経壁の前後梗塞を取得するには、ゼロセブンシルク縫合糸を使用して動脈の両方の枝を結合します。虚血再灌流モデルの場合、結紮糸を甲骨の下とシリコンチューブと左下行冠状動脈の本体の上に置きます。虚血期間中は、肋骨に側頭縫合糸を留置し、組織の乾燥を避けるために湿布で縫合糸を湿らせます。その後、虚血後、シリコンチューブを取り外し、小さなハサミで縫合糸を切断して再灌流を視覚化します。梗塞を誘発した後、胸部を温かい等張塩溶液で満たし、残留空気を排除します。次に、3 0 6縫合糸で胸部を閉じ、内側縫合糸を90度の角度に配置して、肋骨が密閉された閉鎖を確保します。2つの縫合糸で筋肉層を閉じ、続いて必要に応じて3〜4本の縫合糸で皮膚を閉じます。次に、挿管カニューレを人工呼吸器から外して、後で識別できるようにマウスに自発的な呼吸のマーキングを行わせ、動物が目覚めるまで赤いランプの下に置きます。心筋梗塞のデータを解析するためには、駆出率フラクショナル短縮心拍出量と心エコーによる心拍出量寸法を定期的にモニタリングします。実験の終点で、胸腔を開き、心臓を切除します。ティッシュを滅菌PBSに入れて、広範囲に洗浄します。次に、すべての血液が除去されたら、飽和塩化カリウム溶液で心臓を拡張し期に停止し、組織を10%ホルマリンで一晩固定します。心臓組織の薄い部分をパラフィンに埋め込み、心臓の先端を取り付けブロックの下部に配置して、組織の横断切片を可能にします。次に、5ミクロンのシリアルセクションを20個収集し、次の300ミクロンを破棄します。僧帽弁レベルに達するまで、300ミクロンごとに25ミクロンの切片を収集し続けます。その後、moriのワンステップ染色を用いて組織の梗塞サイズを測定し、TTC染色を行います。結紮糸を再構築し、大動脈カニューレを使用して200マイクロリットルの1%エバンスブルー溶液で心臓を灌流し、心臓を洗わずにマイナス20°Cの小さなビニール袋で凍結します。2時間後、鋭利なメスを使用して組織から5つの横断切片を採取し、切片を10〜15分間インキュベートします。製造元の指示に従って摂氏37度のTTC溶液で。さらに10%ホルマリンで10分間固定した後、切片をガラス顕微鏡スライドに移します。組織学的解析のため。使用するモデルによって、梗塞の大きさは異なります。慢性梗塞モデルは、心尖の円形経壁梗塞を誘発し、虚血再灌流モデルは、心臓全体に薄い中間壁を誘導します。梗塞が心臓の生存率に直接及ぼす影響を分析するために、Evans blue TTC 染色を使用して、虚血の影響を受けない健康な心筋を青色で、虚血領域内の生存リスクのある心筋を赤色で、死んだ組織を白色で明らかにすることができます。通常、梗塞の大きさは、リスクエリアのパーセンテージとして表されます。ワンステップ染色では、リモデリングプロセスから生じる成熟した瘢痕を測定することができ、僧帽弁の前に取得した心臓組織の各レベルから、最初のセクションで分析された青色の染色された梗塞性および赤色に染色された健康な心室領域が測定されます。次に、すべてのセクションからの梗塞は、総左心室容積のパーセンテージとして表されます。従来の染色手順も、例えば、これらの画像で行うことができます。CD 31および平滑筋アクチンの染色を用いて、梗塞組織における血管新生および筋線維芽細胞の存在をそれぞれ明らかにした。心筋細胞の非存在下では自家蛍光が観察されないため、梗塞領域のさまざまな標的分子を同定するために二重蛍光染色を使用します。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば25分、30分で完了することができます。この手順に続いて、高い再現性を確保するためには、十分な疼痛管理が必要です。脳室内、圧力測定、超音波、または孤立した心肺などの他の機能分析を実施することができる。灌流の終了。

minimal-invasive-surgical-procedure-inducing-myocardial-infarction

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

多数の遺伝子操作及び/または遺伝子、タンパク質、細胞、および/または生体物質の心筋内注射は、急性虚血/再灌流傷害およびマウスにおける慢性的リモデリングの研究に時間の次元に重ね合わされている。このビデオでは、虚血/再灌流、恒久的な冠動脈結紮、および心筋内注入の研究のための顕微手順を示しています。...

心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

マウスにおける実験的心筋梗塞を誘発するために用いる外科手術は、心臓や肺の左前方の表面を可視化するために、3番目と4番目のリブの間に左開胸で始まります。左冠動脈を結紮され、胸が閉じているとマウスが自発的に回復させる。...

マウスにおける冠動脈結紮のために修飾されたテクニック

このビデオでは、左前下行冠動脈を永久結紮することにより、心筋梗塞のマウスモデルを生成する外科的処置について説明します。...

心筋梗塞のマウスモデルの生成:マウスモデルにおける左前下行冠動脈の永久結紮術の外科的手技

我々は、再現性を高めるために左前下行枝（LAD）に結紮の位置決めにおいてより明確にするために可能にするマウスモデルにおける心筋梗塞（MI）をシミュレートするための実験的虚血/再灌流（I / R）傷害を誘導するための外科的方法を紹介マウスでのMIの実験の。...

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

マウスモデルにおける左前下行動脈(LAD)結紮のための信頼性の高い方法を提供します。この方法は、気管内挿管、左側開胸術、胸腔穿刺術など、他の方法に比べて侵襲性が低いです。この方法は、急性心筋梗塞と慢性心筋梗塞(MI)の両方のモデルとして使用できます。...

マウス左前方降順（LAD）冠動脈結紮：心筋梗塞のための改善と簡略化されたモデル

本明細書では、マウスにおける左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを達成する方法を示す外科的処置について説明する。このモデルは、心筋梗塞の病態生理学とそれに付着した生物学的プロセスを調べるために高い関連性がある。...

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

本稿では、低侵襲アプローチを用いてラットの心筋虚血とその後の慢性再灌流を行う効率的な方法を提示する。さらに、ラットの左心室血力学的機能は、心エコー検査および単離された作業心臓法によって評価される。...

ラットの心筋梗塞を誘導する半最小侵襲法と、単離した働く心臓システムによる心機能の評価

適切な麻酔下で、マウスの心臓を肋間腔から外在化し、ほとんどの検査室で容易に入手できる材料を使用して左前下行動脈(LAD)を結紮することにより、心筋梗塞の誘発に成功しました。...

マウスにおける心筋梗塞の誘導のための改良簡便法

ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、マウスの心筋梗塞または心筋虚血再灌流障害を誘発できる簡便で再現性のある方法について述べる。...

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

ここに提示されるのは、マウスの左冠状動脈の永久結紮のための外科的処置である。このモデルは、心筋梗塞後の病態生理学および関連する炎症反応を調査するために使用できます。...

左冠動脈結紮術:心筋梗塞の外科用マウスモデル

学ぶマウスにおける低侵襲心筋梗塞誘発法。ステレオ顕微鏡下での気管挿管と左下行冠動脈結紮により、高い再現性と生存率を確保する。免疫組織学的解析で梗塞サイズを評価し、心血管研究に応用可能。

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

さらに動画を探す