過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

過ヨウ素酸シッフ染色は、組織の多糖類含有量を可視化する技術です。この記事では、ヒト静脈血から精製された末梢血単核細胞での使用に適した過ヨウ素酸シッフ染色プロトコルを示しています。このようなサンプルは、リンパ球や免疫系の他の白血球に富んでいます。

この手順の全体的な目標は、末梢血単核細胞のグリコーゲン含有量を視覚化することです。これは、まず密度勾配遠心分離法を用いてヒト全血からP BMCを単離することによって達成されます。2番目のステップは、血液細胞を塗抹またはピペッティングしてサンプルスライドを調製し、固定液で処理し、次に洗浄してネガティブコントロールを行うことです。

スライドの半分をアミラーゼ溶液に浸し、グリコーゲンポリマーを溶解した後、洗浄します。次に、サンプルを過ヨウ素酸溶液で染色し、続いて洗浄します。最後のステップは、シフトの試薬を追加し、続いて洗浄することです。

最終的には、光学顕微鏡を使用して、細胞内のグリコーゲン貯蔵を示します。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、全血染色と比較して、スライドあたりの単核細胞数が多いことです。したがって、好中球と赤血球が存在しないため、グリコーゲン含有量とリンパ球を分析する方が効率的です。

バイオセーフティキャビネットでこの手順を開始するには、ヘパリン処理された採血チューブから10〜15ミリリットルの全血を50ミリリットルの滅菌円錐管に慎重に移します。次に、血液をPBS one XでpH 7.4で1対1の比率で希釈し、最大総量が30ミリリットルを超えないようにします。セロロジカルピペットガンを使用して穏やかに混合し、泡が発生しないようにします。

次に、ショ糖、FICOの非イオン性合成ポリマーの13ミリリットルを新しい15ミリリットルの円錐管に移します。続いて、希釈した血液をゆっくりと安定した圧力で加え、FICO層の上に血液層を形成します。すべての血液が移るまで、この手順を数回実行します。

その後、チューブをしっかりとキャップし、室温で400Gで30分間遠心分離します。その後、チューブをゆっくりと取り出し、バイオセーフティキャビネットに戻します。次に、PBSプラズマとpbmcが配置されているFICO層の間のバフィーコートを慎重に収集します。FICO層の収集を避け、赤血球層を乱さないでください。

次に、バフィーコートを新しい50ミリリットルの滅菌円錐管に移します。P BMCを使用してチューブにPBSを追加し、45ミリリットルのマークまで充填します。その後、チューブをしっかりと振ってください。

その後、15分間遠心分離します。277 gsでは、p BMCのパレットが円錐管の底に形成されます。その後、上清を10ミリリットルの漂白剤を入れたプラスチックビーカーに捨てます。

チューブを起伏のある表面にそっと巻き付けて、セルペレットを緩めます。チューブに20ミリリットルの新鮮なPBSを追加します。複数のチューブが処理されている場合は、このステップでペレットを一緒に引っ張ります。

次に、チューブを480 gで12分間遠心分離します。上澄みを漂白剤のスプラッシュでプラスチックビーカーに捨てます。次に、チューブを起伏のある表面にそっとラックします。

その後、25ミリリットルの新鮮なPBSをチューブに追加します。50マイクロリットルの細胞をマイクロ遠心チューブに移します。生存率については、細胞をカウントするためにカウントします。

50マイクロリットルのトライアンブルーを加え、ピペットで上下にやさしく混ぜます。続いて、混合物の10マイクロリットルをヘモサイトメーターに移します。細胞の生存率を確認し、ミリリットルあたりの細胞数を記録するため。

必要な量の細胞を取り、チューブを177 gで12分間遠心分離します。その後、SUPのナタントを漂白剤と一緒にビーカーに捨てます。次に、起伏のある表面に対してチューブをそっとラックし、続いて80マイクロリットルのPBSをチューブに追加します。

PBMCスライドを作成するには、事前にラベル付けされた顕微鏡スライドに80マイクロリットルの細胞を配置し、別のスライドを使用してドロップを塗抹するか、スライドの両端に40マイクロリットルの2滴を置きます。スライドを生物学的安全キャビネットに入れて乾かします。次に、0.5ミリリットルの37%ホルムアルデヒドと4.5ミリリットルの99%エタノールを混合して固定液を調製します。

スライドが乾いたら、作りたての固定液を2ミリリットルスライドに加え、表面全体を覆います。溶液をスライド上に1分間放置してから、水道水でさらに1分間すすぎます。その後、自然乾燥させます。

さあ、解散します。50ミリリットルの蒸留水に25グラムのアミラーゼ粉末をポイントします。溶液を100ミリリットルのビーカーに注ぎます。

次に、スライドの半分をビーカーに浸し、15分間インキュベートします。室温で、アミラーゼ処理を受けている側にメモを取ります。スライドの裏側に、治療とコントロールの境界を示す線を引きます。

その後、スライドを蒸留水で洗浄してアミラーゼ溶液を除去します。次に、スライドを自然乾燥させます このステップでは、スライドを平らな面に置きます。サンプルに2ミリリットルの過ヨウ素酸溶液を塗布し、室温で5分間インキュベートします。

次に、スライドを蒸留水で数回すすぎます。スライドに2ミリリットルのシフト試薬を塗布し、室温で15分間インキュベートします。その後、スライドを蒸留水で5分間洗浄し、自然乾燥させます。

次に、スライドに100マイクロリットルの封入剤を塗布し、大きなカバースリップ1枚で覆うか、または50マイクロリットルを塗布して小さなカバースリップ2枚を使用します。その後、カバースリップの端に透明なマニキュアを塗ります。一晩乾かします。

次に、100 x 対物レンズ PAS を使用して双眼光学顕微鏡で画像を取得します。染色は、健康な被験者の静脈血からのP BMCに対して行われました。PAS染色されたP BMCは、さまざまな染色パターンを示しました。

顆粒を有する小さな細胞が容易に観察された。また、拡散した染色パターンを持つ大きな細胞の割合も観察されました。アミラーゼによるサンプルの処理により、顆粒シグナルが除去され、拡散性PAS陽性が減少しました。

PASおよびHEMATIN染色は、全血スライドで行いました。このPBMCは多くの赤血球に囲まれています。98%PAS陽性のpbmcは小さい細胞で、40%は大きい細胞でした。

アミラーゼ処理により、小細胞のPASシグナルが除去され、大きな細胞のPASシグナルが7%に大幅に減少しましたPAS試薬の使用は非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行する際には、適切な個人用保護具の着用や化学フードの使用などの予防措置を講じる必要があります。