Name: 初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶマウス脳微小血管内皮細胞の単離法。機械的ホモジナイゼーション、酵素処理、密度勾遠心分離を用いて高純度の初代細胞を培養します。血脳関門の生理機能と病態メカニズムの研究に応用可能です。

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この作品は、ドイツ学術振興による臨床研究（IZKF）ミュンスターのための学際センター（SEED 03/12、SB）、（DFG）によってサポートされていました、細胞·イン·モーション·エクセレンスのクラスター（EXC 1003 - CIM）、ミュンスター大学（SB及びSGM）とそれ以外クローネ-フレゼニウス-財団（SB及びSGMへ2012_A88）による。私たちは、優れたイラスト平家ブルムに感謝します。

全ての動物実験は、地方当局（ &quot;; Fachbereich 87、Tiergesundheit、Tierschutz、LandesamtfürNatur、環世界ウントVerbraucherschutz NRWレックリングハウゼン、ドイツ&quot;）によって承認されたと動物愛護のドイツの法律に基づいて実施しました。 マウス実験1.一般的なコメント<ol><li>それぞれの施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従ってマウスを使用して、すべての実験を行う。 </li><li>病原体を含まない条件下でマウスを維持し、食物および水を自由にアクセスできるようにすることを可能。 </li><li>生物学的特性は、年齢や性別に応じて変化することができますので、実験群における年齢および性別をマッチさせたマウスを使用してください。 </li><li>可能な限り動物実験を減らす洗練または交換してみてください。 </li></ol>パーコール勾配の調製<ol><li> 1ミリリットル10倍のPBS、1ミリリットルFCSおよび10ミリリットルのパーコールでの1X PBS 19ミリリットルを混ぜる。 </li><li>サントを行うガラス管（：0.2μmのフィルター孔の直径）でろ過をrile。その後、4℃でソリューションを保存します。 </li></ol>内皮細胞培地および細胞培養プレートのコーティングの調製<ol><li>内皮細胞培地。 <ol><li> 500mlの培地の調製：（約20％）を100mlのPDSを400ミリリットルDMEM培地（約80％）のミックスを0.25 mlのbFGF（20μg/ mlの、約0.05％）、0.5 mlのヘパリンを（100μl/ウェルmlであり、約0.1％）、0.5mlのpyrumycin（4 mg / mlの、約0.1％）。唯一の培養の最初の2日間において使用される細胞培養培地のためpyrumycin加える。 </li><li>ガラス管（：0.2μmのフィルター孔の直径）で無菌濾過を行う。その後、4℃でソリューションを保存します。 </li></ol></li><li>細胞培養プレートのコーティング： <ol><li>コーティング液1mlについては、500μlののddH 2 O、400μlのコラーゲンIV（0.4 mg / ml）で100μlのフィブロネクチン（0.1mg / mlの）の溶液を調製する。 </li><li> EACの全面を覆うコー​​ティング溶液を用いて細胞培養プレートの時間十分。 4℃で一晩プレートを保管してください。 </li></ol></li></ol>マウス脳微小血管内皮細胞（MBMEC）の4.絶縁<ol><li>頚椎脱臼により - （12週齢、C57BL / 6〜8）10成体マウスを生け贄に捧げる。その後5mlのPBSでマウスの脳や店舗を隔離（警告：！仕事無菌）。 </li><li>鉗子で脳茎、小脳や視床を削除します。慎重に滅菌吸取紙の上に脳を転がすことによって髄膜を取り外してください。その結果髄膜フリー前脳を収集します。 </li><li> DMEMを13.5ミリリットルで満たされた50ミリリットルファルコンチューブに脳を転送します。 </li><li>メディアが乳白色になるまで、10ミリリットルピペットで、最初の25ミリリットルピペットで、組織をミンチ。 </li><li>そして、軌道上で37℃で1時間インキュベートしたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）0.6 mlコラゲナーゼCLS2た（10mg / mlのDMEM中で）0.2mlのDNアーゼ（PBS中1mg / ml）との混合物で組織を消化振る180 rpmでR。 </li><li> DMEM 10 mlを加え、4℃で10分間、組織懸濁液を遠心1,000×gで細胞を添加した。 </li><li>上澄みを捨てる（警告：ペレットが失うものは簡単です！） </li><li>ミエリンを削除するには、25ミリリットルのBSA-DMEM（約25倍）（20％w / v）の25mlのピペット、および4℃で20分間千×gで遠心分離してペレットを再懸濁します。 </li><li>大径の割れたガラスパスツールピペットを用いて、上側ミエリン層（乳白色）を破棄し、その後、通常のパスツールピペットで、BSA層を捨てる。 </li><li> 9ミリリットルDMEM中でペレットを再懸濁し、1mlのコラゲナーゼ/ディスパーゼを0.1mlをDNA分解酵素（最終濃度を1mg / mlである）を追加します。 180 rpmでオービタルシェーカー上で37℃で1時間のためのソリューションのダイジェスト（警告を：再懸濁するためにピペットを使用していない - 細​​胞が失われる可能性があります）。 </li><li>消化中に、加速度、のWiで、4℃で1時間3000×gで超遠心機を用いた密度勾配を設定するためにパーコール液を遠心ブレーキthout。 </li><li>消化された細胞懸濁液にDMEMを10ミリリットルを追加します。遠心機で4℃で10分間千×gでサスペンション。その後、上清を破棄し、DMEMを2mlにペレットを再懸濁。 </li><li>加速とブレーキなしで4℃で10分間700×gでパーコール勾配遠心の上に慎重に再懸濁した細胞を追加します。注：細胞が間期におけるクラウドとして表示されます。 </li><li>約取る。長い滅菌針で細胞と間期の12ミリリットルのDMEM 5mlで新しい50ミリリットルファルコンに配置します。 </li><li> 4℃で10分間千×gで再び細胞を遠心します。その後（約使用。細胞培養プレートの媒体1単位cm 2面0.2 ml）を内皮細胞培地中でペレットを再懸濁する。 </li><li>コーティングされた細胞培養プレートからコーティング溶液を除去し（ ステップ3.2参照）と、2つの連続した洗浄工程において、滅菌PBSで各ウェルすすぐ。 </li><li>内皮に​​おける細胞培養を維持する細胞を37℃で培地および滅菌インキュベーター内で5％CO 2。 2〜3日ごとに培地を変更してください。 90％コンフルエンスで細胞を分割します。 </li></ol>

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<li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

血液脳関門の機能障害は、多発性硬化症におけるBBBの破壊など広範囲に自己反応性免疫細胞によるCNS浸潤を促進し、オリゴデンドロサイトの出会いや破壊を可能にする様々な有害なCNS疾患の顕著な特徴である。虚血性脳卒中では、BBBの破壊および脳浮腫のその後の形成は、二次梗塞の成長と患者6の全生存期間に影響を与える重要な要因である。さらに、遠隔地BBBの変化によって焦点虚血性病変は、脳の広範な機能的変化を誘導することができる。しかし、根本的な分子メカニズムは不明な点が多い5。これとは対照的に、機能的BMECs高密度かつ排出トランスポーターの多様性は、そのような感染症のための脳の悪性腫瘍または抗生物質のための化学療法剤として有益な薬剤の濃度を低減します。そのため、血液脳バーをより深く理解生理学的および病態生理学的条件下でRIER機能は特に好ま方向21にバリア機能を調節することができる薬理学的薬剤の開発が求められている。 BBBのin vitroモデルにおける信頼性の高いは、BBBでの調節機構を研究するための不可欠なツールです。 多くの不死化された脳内皮細胞株を確立し、インビトロ BBBモデル22として用いられてきた。彼らはより速く成長し、いくつかの継代にわたって一定のBBB特性を保つように、これらの細胞株は、プライマリBMECsにわたって特定の利点を提供します。しかし、内皮細胞株は完全にin vivoの状況に実験結果の転写混ざりなどの重要なプロパティが変更された初代細胞を代替することはできません。例えば、マウス脳内皮細胞株bEnd.5高paracにつながる不連続に分布するタイトジャンクショ​​ンタンパク質の低いレベルのみを発現するellular透磁率23。のbEnd、別の頻繁に使用されるマウス脳内皮細胞株は、緻密で連続的に分布し、タイトジャンクショ​​ン、高内皮性、いくつかの排出トランスポーターと低傍細胞透過性を示している。しかし、のbEnd細胞層の主BMECsに比べ、一定の経と傍細胞基質24の浸透に関して本当の差別を欠いている。 初代細胞培養の調製では、混入細胞が有意に実験結果の妥当性を妨げる可能性があります。記載されたプロトコルでは、pyrumicin高純度を達成するために、内皮細胞のための選択剤として使用される。それにもかかわらず、細胞培養物の定期的な品質管理は、必然的に信頼性のある実験のために保証するために必要とされる。内皮細胞の典型的な形態学的特性（ 図1Aを参照）、transendothelia以外の品質管理のためのいくつかの方法があり、lの抵抗を測定する場合や、そのようなCD31内皮細胞マーカーの発現（ 図1Bを参照）、またはフォンウィルブランド因子（vWF）が評価されるかもしれない。 一匹のマウスの脳から単離された脳内皮細胞の数が比較的低く、複数の実験のための適切な細胞培養を設定することで、いくつかのマウスの脳をプールしなければならない。我々の経験では、少なくとも10匹のマウスは、それぞれの動物施設のリソースに応じて制限する要因かもしれない一つの実験のために使用される必要がある。バイアスや交絡因子を避けるために、同一の遺伝的および環境的背景を持つマウスのみをプールする必要があります。対照的に、ウシおよびブタの脳内皮細胞調製物は、一脳内の利用可能な脳内皮細胞の大多数を提供する。しかし、合併症のない飼育や住宅、利用可能なトランスジェニックマウスの広範かつ増え続けるレパートリーに加えて初代マウスBMECsは理想としてレンダリング血液脳関門の機能を研究するためのモデル。 BBB基礎となる分子機構の機能に関するいくつかの重要な知見は、二次元組織培養系における研究から来ている。最近では、三次元培養系は、内皮細胞が管腔と管状ネットワークを形成できるようにすることコラーゲンマトリックス内に配置されている図25に示すように、開発されてきた。これらの新規な細胞培養系は、 インビボで無傷の生物における血管のプロセスのより正確な再現を可能にする。このような周皮細胞およびアストロサイトなどNVU 3Dで細胞培養系のさらなる細胞の関与は、血液脳関門の機能を研究するin vitroでの革命をもたらすかもしれない。最初のモデルは、最近26を開発されてきた。 トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項があります。すべての無菌作業の最初は、内皮細胞培養物の品質に必須である。第二に、pyrumycinはセルのみのために追加する必要があります培養の最初の2日間に使用される培地は、長いアプリケーションが増加MBMEC細胞死および低品質のバリア機能につながるかもしれない。第三に、このプロトコルに適用される酵素は、製造業者の指示に従って使用して保存されるべきである。そうでなければそれらの適切な機能が損なわれる可能性があります。内皮細胞が付着しない場合はさらに、細胞培養プレートのコーティングが改正される可能性があります。フィブロネクチンおよびコラーゲンの濃度は、変更される場合があり、または他のマトリックスタンパク質は、コーティング溶液に添加してもよい。最後に、年齢、性別、季節および動物施設内の環境条件がMBMEC分離実験の比較可能性の品質に影響を与える可能性のある重要な要因である。これは、条件が独立した実験の間で同等であることを保証されるべきである。 記載されたプロトコルは、マウスBMECsを分離するための基本的な神経免疫法として考慮されるべきである。単離された細胞は、Uかもしれませんそのような移動アッセイ、遺伝子およびタンパク質発現の研究​​、電気生理学的評価または透過性実験としてBBB機能へのさらなる洞察を得るために、さまざまなアプリケーションのためのsed。上述したように、BMECsの三次元細胞培養系は、NVUの文脈におけるBBBの調節に関与する複雑な機構を研究するための新たな機会を提供するかもしれない。したがって、一次内皮細胞の単離は、将来的にBBB研究の分野で非常に貴重な技術のままである。

<html>高度に専門化血液脳関門（BBB）の一部である脳微小血管内皮細胞（BMEC）フォームの単層。 BMECsは基底膜に付着し、接合部タンパク質によって相互接続されている。一緒に周皮細胞、平滑筋細胞、星状細胞エンドフィート、それらは、いわゆる神経血管単位（NVU）1を構築循環する血液細胞と混合する。血液および中枢神経--系（CNS）との間に不透過性バリアの以前の概念に対して、NVUは脳血管およびCNS 2の間の流体、分子および細胞の転移を制御し、動的な非常に特異的で、安定化インタフェースです。 NVUの機能不全または調節不全は、開始および/ ​​または虚血性脳卒中、HIV-脳症、多発性硬化症、アルツハイマー病またはパーキンソン病など3-6 CNSの神経血管、感染性、炎症性または変性疾患、種々のに寄与し得る。 _content &quot;&gt; BMEC単層が緊密に接合部複合体により封止されているタイト（TJ）から構成され、接合（AJ）をアドヘレン7。高い電気抵抗とBBBの低い傍細胞透過性は、主にTJ蛋白質8に基づいています。のTJであるこのようzonulaoccludens（ZO）タンパク質などのアダプター分子によって内皮細胞の細胞骨格に連結されているクローディンとオクルディンファミリーの膜貫通タンパク質によって形成された複合体ZO1-3 4アドヘレン接合は、主に内在性膜タンパク質によって組み立てられる。カテニン8を介して細胞骨格にリンクされている血管内皮（VE）カドヘリン、。 BBBの密封は、血液およびCSFの間で基板および細胞の自由な交換を防ぐことができます。この規則の例外は、脂質媒介拡散9によってBBBを横切ることができる分子量&lt;400 Daの、親油性、小分子である。より大きいおよび/または通路例えば、グルコース、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、および多くの薬剤のような親水性分子は、5つの主要なカテゴリーに分類することができる、高度に制御された経細胞輸送システム10に限定される：担体輸送、イオン輸送、能動排出輸送、受容体媒介輸送、およびカベオラ媒介輸送4。これらの輸送​​体系は、正確な信号の生成、形質導入および統合のために必要とされるCNSの恒常性を維持するのに役立ちます。また、BMECsも積極ectoenzymes、様々の発現により明確な分子の遷移を制御することができる。これらの酵素は阻害しまたはBBB 11の移行を可能にする特定の内因性および外因性の基質を細胞表面に局在し、変更されている。 CNSは、長い時間のための免疫特権臓器と考えられたのに対し、最近の知見は、免疫survのではなく、ダイナミックで厳密に調節システムを提案CNSのeillance。 BMECsは決定的に免疫細胞の遊走の調節に関与する。その表面リンパ球上のセレクチンの発現によって選択的に緩く内皮に付着するように誘導される。白血球上の特異的受容体との遭遇ケモカインの分泌は、式またはそのようなLFA-1などの白血球インテグリンのコンホメーション変化をもたらす（リンパ球機能関連抗原-1）およびVLA-4（非常に遅く抗原4）。インテグリンは、間に、またはBBB 12-14のBMECsを通して脳実質内への遊出を可能にするそれらの内皮counterreceptors、 例えば VCAM-I（血管細胞接着分子）、ICAM-I（細胞間接着分子）を結合することにより、強固な接着を媒介する。これらおよび他の知見は、免疫細胞の遊走の調節における内皮細胞自体の積極的な役割を強調する。 さらに、BMECs NVUの一部が脳血流liの調節に関与しているよう地元のニューロンの代謝要求にnked。星状細胞の刺激内皮細胞に血管平滑筋細胞の弛緩15に至る酸化窒素などの血管作動性物質を産生する。 開発において、ならびに成体の脳を示し平行パターニングおよび開発における規制1,4の多くの特性を共有し、血管新生および神経発生。内皮細胞は、これらのプロセス16,17に決定的に関与している。 要約すると、BMECsは、CNSの適切な発達と機能を保証するために不可欠な機能を提供する。 BBBの機能不全は、多くの重篤な神経疾患にリンクされています。しかし、ごく少数の標的は、特異的かつ効率的な治療の18脳血管系界面において同定されている。 in vitroモデルは、簡略化のために見よ機能と複雑な生理的システムの調節に関与するメカニズムを理解するために使用されているngの時間。分離は、この原稿と特定のマウスノックアウト-株の様々な特定のネズミBMECs のin vitro研究により記載されるように、新たな治療の道を開く生理学的および病態生理学的条件下で、BBB機能および調節のさらなる理解を提供するかもしれない。

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>塩基性線維芽細胞増殖因子</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>ウシ血清アルブミン</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>プロテアーゼ活性の相対的レベル</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ-ディスパーゼ</td><td>ロシュ</td><td>10269638001</td><td>V. alginolyticusからのコラゲナーゼ、Bからのディスパーゼ。polymyxa</td></tr><tr><td>コラーゲン IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫基底膜</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>37°C;Cウォーターバス使用前に</td></tr><tr><td>DNAse</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>D4513</td>デ<td>オキシリボヌクレアーゼIウシ膵臓FCS</td></tr><tr><td></td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F6178</td><td>胎児子牛血清(別名胎児ウシ血清)</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3393</td>抗<td>凝固剤</td></tr><tr><td>PDS</td><td>ファーストリンクUK株式会社</td><td>60-00-850</td><td>血漿由来血清</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>使用前に室温まで温め</td></tr>てください <tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>培養の最初の2日間のみ使用してください</td></tr></tbody></table>

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

血液脳関門は、脳微小血管内皮細胞(BMEC)の単層によって超構造的に組み立てられ、タイトで接着性の接合部複合体によって相互接続されています。アストロサイトやペリサイトなどの他の細胞タイプとともに、末梢血と中枢神経系との間の体液、分子、細胞の交換を特異的に制御する神経血管単位(NVU)を形成します。この複雑でダイナミックなシステムを通じて、BMECはCNSの恒常性を維持するさまざまなプロセスに関与しています。BBBの機能不全は、多くの重篤なCNS疾患の病因における重要なステップとして観察されます。しかし、特異的な標的療法は非常に限られており、その根底にあるメカニズムはまだ解明されていません。
動物モデルとin vitroモデルは、複雑な生理学的および病態生理学的プロセスを深く理解するために広く使用されてきました。削減と単純化により、関心のある主題に調査を集中させ、さまざまな交絡因子を除外することができます。ただし、モデルシステムでは比較可能性と移転可能性も低下するため、評価のために考慮する必要があります。最も一般的な動物モデルはマウスに基づいていますが、これは主に方法論の可能性が絶えず高まっているためです。単離されたマウスBMECのin vitro研究により、生理学的および病態生理学的条件下でのBMECの特性と血液脳関門の詳細な分析が可能になる可能性があります。BBBの複雑なメカニズムに関するさらなる洞察は、新しい治療戦略の基礎を提供する可能性があります。
このプロトコルは、一連の物理的および化学的精製ステップによって初代マウス微小血管内皮細胞を単離する方法を説明しています。MBMECの純度と培養、品質管理、潜在的な用途、および制限に関する特別な考慮事項について説明します。

単離直後、マウスBMECsと混入細胞は、細胞培養培地（ 図1A、0日目）に浮遊集塊を形成する。彼らはそのような毒素の相対抵抗をもたらすP-糖タンパク質のような排出トランスポーターの高レベルで発現するのでpyrumycinによる治療は、マウスBMECsの選択につながる。混入細胞媒介性細胞傷害19 pyrumycinはるかに受けやすい。 MBMECsはコラーゲンIV /フィブロネクチンコーティングした細胞培養プレート（ 図1A、1日目と2日目）にアタッチし始めるのに対し、pyrumicin選択の過程で、混入細胞は、アポトーシスまたは壊死性細胞死を入力してください。 5日目までは、MBMECsはおよその密度に増殖する。 80から90パーセント。これらは、典型的な紡錘状の外観によって特徴付けられる。合流で、彼らは密集し、長手方向に整列し、非重複接触禁止細胞（ 図1A、5日目）の単層を形成する。バイ（; 図1B PECAM1）は、内皮細胞マーカーCD31によって実証されるようにpyrumicin選択、最大99％までMBMECの高純度が達成される。 MBMECsはしっかりとタイトジャンクショ​​ンタンパク質によって相互接続された密封された単分子層を形成する。培養8日後、内皮細胞層は、電気抵抗のための安定した値を構築する（20の間の典型的な値に到達する- - 30Ωのxセンチ2）7の後に、キャパシタンス（ 図1C）は、無細胞のような、この時点では機能的アッセイ。エバンスブルーまたはデキストランで例えば遊走実験3、20,21および透過性テストは、実施すべきである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500"> 図1.形態学的およびネズミBMECsの機能特性。送信光マイクロによって見培養BMECsの（A）代表経時変化5日間のSCOPY。スケールバーはすべての画像に適用される。内皮細胞マーカーCD31のための（B）免疫蛍光染色を5日目にCD31（緑色）及びDAPI（青色）で、（C）細胞を5日間前培養した後のための自動化システムに移した生物物理学的特性（抵抗と容量）の分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

脳微小血管内皮細胞(BMEC)は、血液と中枢神経系(CNS)を分離する高度に制御された障壁を形成する特定の接合タンパク質によって相互接続されています。このプロトコルで述べられているように、初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離により、BBBの詳細なin vitro研究が可能になります。

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

この手順の全体的な目標は、初代マウス、脳微小血管内皮細胞、または MBX を取得することです。これは、最初に成体マウスの髄膜遊離前脳を単離し、次に均質化することによって達成されます。第2ステップでは、組織ホモジネートは酵素消化によってさらに処理されます。次に、最終ステップでは、内皮細胞を密度、勾配、遠心分離によって分離し、細胞培養のためにプレーティングします。最終的には、CD31発現のための単離細胞の免疫蛍光染色を使用して、MBメカ培養の純度を確認することができます。不死化脳、内皮細胞株の使用など、既存の方法のこの技術の主な利点は、初代細胞で得られた結果がin vivoの状況により優れた伝達性を提供することです。この方法は、血液脳関門探索の分野における重要な問題、例えば、免疫細胞の思考にどの経路が関与しているかなどに答えるのに役立ちます。この技術の意味は、中枢神経系の神経血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、または変性疾患の治療にまで及びます。血液脳関門機能障害は、このような疾患の病原体に大きく関与しています。この手順は、私たちの研究室の大学院生であるLisa Eepingによってデモンストレーションされます。10週齢、8週齢、12週齢のC 57 BLの脳を分離した後、6匹のマウスが組織を5ミリリットルの滅菌PBSに保存します。次に、鉗子を使用して脳幹、小脳、視床を切除し、滅菌済みのあぶらとり紙で各脳を慎重に転がします。髄膜を除去するには、50ミリリットルのファルコンチューブに脳をプールし、13.5ミリリットルのDMエムを追加し、次に25ミリリットルのピペットで組織をミンチし、次に10ミリリットルのピペットで培地が乳白色になるまでミンチします。コラゲナーゼとDNAの組織を摂氏37度で、180 RPMのオービタルシェーカーで消化します。1時間後、10ミリリットルのDM emを組織懸濁液に加え、細胞を1000Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。上清は、ゆるいペレットを乱さないように注意して捨て、25ミリリットルのピペットで25ミリリットルのB-S-A-D-M-E-Mで約25回トライします。細胞を再びスピンダウンした後、大径の割れたガラスピペットを使用して、乳白色の上部ミエリン層を取り除きます。次に、通常のPEまたはピペットでBSA層を取り除きます。ペレットを9ミリリットルのDM emに再懸濁し、次に1ミリリットルのコラゲナーゼ椎間板スペースと0.1ミリリットルのDNAを細胞に加えます。180 RPMのオービタルシェーカーで摂氏37度で溶液を消化します。消化中に、超遠心分離機でperca密度勾配を設定します。1時間後、消化した細胞懸濁液に10ミリリットルのDM E emを加えて反応を停止し、次に細胞をスピンダウンしてペレットを再懸濁します DM E emの2ミリリットルで、細胞懸濁液をコールごとの勾配の上に慎重に追加し、次に遠心分離によって細胞を分離します。分離後、細胞は曇ったインターフェースとして見える場合があります。滅菌針に沿って30度の角度で界面に慎重に浸し、約12ミリリットルの溶液を収集します。界面は、できるだけ汚染を抑えてできるだけ多くの細胞を得るために、目に見えないことがよくあります。インターフェイスの少量を吸引する必要があります。それに加えて、滅菌針の先端は、界面のあらゆる部分に慎重かつ連続的に移動し、細胞を5ミリリットルのDM emを含む新しい50ミリリットルのファルコンに移し、その後、細胞を再度スピンダウンした後、細胞培養プレートの1平方センチメートルの表面あたり0.2ミリリットルの内皮細胞培地で口蓋を懸濁させる必要があります。次に、コーティングされた細胞培養プレートからコーティング溶液を取り出し、2つの連続した洗浄ステップですべてのウェルを滅菌PBSですすいでください。最後に、内皮細胞培地の細胞培養物を37°C、5%二酸化炭素の滅菌インキュベーターに維持します。隔離直後は2〜3日ごとに培地を交換します。マウスBM eと汚染細胞は、細胞培養中に浮遊しているのが観察できるコングロマリットを形成します。マイシンによる中型治療は、汚染細胞がpurマイシン媒介性細胞毒性にはるかに敏感であり、影響を受けていないBM Eが5日目までコラーゲン4フィブロネクチン被覆細胞培養プレートに付着し始めるため、マウスBMAXの選択につながります。BMEは約80〜90%の密度に増殖し、密集した単層を形成します。 縦方向に整列し、非重なり合う接触阻害細胞は、プラムマイシン選択によるそれらの典型的な紡錘形の外観を特徴とする、内皮細胞マーカーCD31によって確認されたように、最大99%マウスBMAXの高純度に達する。BM Eは、タイトジャンクションタンパク質によって相互接続された密封された単分子膜を形成します。培養の7〜8日後、これらの細胞層は、平方センチメートルで20〜30オームの電気抵抗のための安定した値を蓄積し、この時点では、細胞遊走実験またはエバンスブルーまたはデキストランによる透過性試験などの機能アッセイを一度習得することができる。この手法は、この手順の4〜5時間で実行できます。遊走アッセイ、透過性実験、電気生理学的測定などの他の方法を実行して、たとえば、特定の実験条件下で免疫細胞の輸送がどのように変化するかという先見の明のある問題に対処することができます。あるいは、鉄チャネルは血液脳関門の調節にどのように関与しているのでしょうか?このビデオを見れば、機械的な均質化、酵素、消化、密度勾配遠心分離によって尿、脳微小血管内皮細胞を分離する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。...

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

このビデオでは、内皮細胞の汚染なしにウシの脳毛細血管から周皮細胞を分離して培養する手順を示しています。...

初代脳周皮細胞の単離と培養:内皮細胞汚染なしにウシ脳毛細血管から周皮細胞を単離および培養する手順

このビデオは、ニューロンやグリア細胞とともに血液脳関門(BBB)を構成するマウスの脳から無傷の血管が分離される様子を示しています。単離された血管は、脳の恒常性を維持する役割を研究するためのin...

マウス脳血管の単離:マウス脳サンプルから無傷の血管を単離するためのプロトコル

このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単​​で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。...

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

血管内皮細胞は、多くの重要な心血管疾患において重要な役割を果たしています。この記事では、特別な機器を使用せずにマウス大動脈から内皮細胞を分離および増殖する簡単な方法について説明します。私たちのプロトコルは、内皮細胞の生理病理学におけるメカニズムを特定する効果的な手段を提供します。...

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

マウスの脳の血管コンパートメントの浄化を可能にするプロトコルを記述します。単離された脳血管には、タイトジャンクションによってリンクされ、連続した基底層、周皮細胞、血管平滑筋細胞、および血管周囲星膠膜に囲まれた内皮細胞が含まれます。...

マウス脳血管の精製

血液脳関門のカバレッジを維持することは、中枢神経系の恒常性にとって重要である。このプロトコルは、血液脳関門のカバレッジを調節する基本的および病理学的プロセスを描写するためのインビトロ技術を記載する 。...

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。...

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

新生児のマウス脳組織から脳微血管内皮細胞(BMECs)を単離し一次培養し、生理学的および病理学的条件下での血液脳関門機能を研究するための堅牢な in...

マウス脳の微小血管内皮細胞の単離と培養

学ぶマウス脳微小血管内皮細胞の単離法。機械的ホモジナイゼーション、酵素処理、密度勾遠心分離を用いて高純度の初代細胞を培養します。血脳関門の生理機能と病態メカニズムの研究に応用可能です。

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

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