Name: FIMイメージングとFIMtrack：高スループットとコスト効果的な歩行分析を可能に二つの新しいツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶFIMイメージングとFIMtrackを用いたDrosophila幼虫の歩行解析法。高スループットでコスト効果的な行動神経科学研究に最適で、温度勾配応答の定量的評価が可能です。

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私たちは、FIMセットアップの建設に助けをこのプロジェクトを開始したS·トーマス、J.ヘルマンおよびU Burgbacherに感謝しています。この作品は、DFG（SFB 629 B6）によって資金を供給された。

注記：ここでは、FIMの使用は自由移動条件および熱刺激の影響下で、スクリーニングのための幼虫移動の便利なハイスループット解析のために提示されている。そのような圧延や他の行動の嗅覚刺激依存運動や高解像度イメージングの分析など他のアプリケーションは、要求に応じて提供されているプロトコルに微妙な変化が必要になることがあります。 実験1.セットアップ<ol style="margin-left: 40px;"><li>統計的に意味のある値を得るために合計（必要な1時間の時間）に遺伝子型あたり約100の幼虫を使用してください。注：いくつかの遺伝子型を比較し、別の日に記録する必要がある場合には、一日あたりの遺伝子型あたりの幼虫の同じ数を記録。 </li><li>ほとんどのアプリケーションで、パラメータ解析のために10 Hzで記録した。必要に応じて、高解像度イメージングアプリケーションでは、画像形成速度を変化させる。 </li><li> 3齢幼虫の追跡のため、産卵後に120時間程度の実験を行っています。シュールを作る培養は実験期間（4.3を参照）に十分な幼虫をもたらす電子。 </li><li>非刺激のアプリケーションのために、半透明の寒天を含むクロール表面を準備する（セクション2を参照）。熱勾配のアプリケーションのための刺激の範囲に幼虫を含有するように、嫌悪塩寒天関門（セクション3を参照）の視野を囲む。 注：他のアプリケーションは、異なる表面が必要な場合があります。 </li><li>一定の環境条件（温度、光、空気の流れ、空気湿度など ）で部屋を使用してください。 </li></ol> 2.クロール表面準備（半透明寒天） 注：FIMセットアップでは寒天表面が湿ったクロール表面を提供するために添加されている。さらに、それはまた、照明特性を改善する。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>脱イオン超純水に0.8％の食品用寒天を沸騰。スクリーニングアプリケーションの場合は400ミリリットルを用意。 </li><li>独立した33センチメートルX 33センチメートル交流に50℃（手-ホット）に寒天を注ぐrylic-ガラス板。寒天の表面張力、したがって温度が寒天平板の厚さを定義する。 50℃で、厚さ2mmの寒天のスラブが得られる。煮沸した後に攪拌し、気泡を避けるために、常にかけないでください。約4時間のすべての撮像期間のために新鮮な寒天のスラブを準備します。 </li><li>きれいな、ソートして実験前（遺伝子型ごとに1ディッシュ）に幼虫を慣らすために、残りの0.8％寒天溶液で標準の6センチペトリ皿を埋める。 </li><li>嫌悪寒天バリアがアプリケーションのために必要とされる場合には、セクション3に進んでください。 </li><li>記録のために、平面正方形の表面を得るために、寒天、スラブの周囲の約2cmを切り落とす。過剰寒天を削除します。 注：サイズはアプリケーションに依存している。 </li><li>直接優しくアクリルガラス板の端に滑空寒天を押すことで、冷却後FIMセットアップに寒天スラブを転送します。 </li></ol> 3.オプション：クローに嫌悪寒天バリアを追加する玲表面（塩寒天） <ol style="margin-left: 40px;"><li>純水、超純水で3 M NaClを含む2.5％の食品用寒天を沸騰。熱勾配におけるスクリーニングのために200ミリリットルを用意。 注：ボリュームは、アプリケーションに依存します。 </li><li>以前に2cm幅のノッチをカットし、ビュー（22×22センチ）のフィールドを囲むクロール表面を注いだ。 注：異なるバリアフォームとビューのフィールドは、用途に応じて必要とされ得る。 </li><li>トラッキング面より0.1〜0.3センチメートル高い塩寒天でノッチを埋める。 </li></ol> 4.フライの取り扱い<ol style="margin-left: 40px;"><li>リア65％の空気湿度で標準のフライ食品の実験の時間に調整し、12時間の明/暗サイクルで25℃のインキュベーターに飛ぶ。 </li><li>十字架のために、CO 2で30処女雌ハエや8人の男性を麻酔し、35ミリリットル食品と130ミリリットル培養バイアルでそれらを横断する。 注：35ミリリットル食品の一つの130ミリリットル培養バイアルは、約20〜30リットルが得られます4時間の撮影スパン内の第3齢幼虫を食べた。イメージングと追跡は、すべての幼虫齢段階のために働く。 </li><li>後半三齢幼虫の運動を駆動し、小さな絵筆を使用してバイアル壁から最大の幼虫を収集するために培養バイアルに少量の水をドロップします。 </li><li>録音の前に2-5分、慣らすとそれらをきれいにするために、脱イオン超純水に0.8％食品グレードの寒天を含むペトリ皿に1ビデオの転送の幼虫。 </li></ol> 5.録音のためのFIMイメージングセットアップ（非刺激条件）を調整する<ol style="margin-left: 40px;"><li>必要に応じて、カメラのレンズのフォーカスと絞りを調整します。それぞれのカメラの露光時間を設定します。 注：これらの設定は、実験中に変更する必要はありません。 </li><li> 1幼虫を撮像して良好なコントラストを得るために、照射強度を調整します。 </li><li>録音中に室内を一定の環境条件にしてください。指向性の光で幼虫を邪魔しないように部屋を暗くする。 </li></ol> 6.オプション：録音のためのFIMイメージングセットアップ（漸次温度刺激条件）を調整する注：熱勾配デバイスは、トップサイト上のマットブラック塗装と絶縁材料との42×42のx 0.2センチメートル3アルミ板である。プレートは、両端のcalorifiers /クーラーとポンプに接続された2つの異なる回路（ 図1B参照 ）からの水で灌流される。温度は-5から50℃に調整することができる。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>実験前に熱勾配デバイス1時間の電源を入れ、平衡に所望の温度プロファイルおよびコンポーネントを確立できるように、セットアップの上に置きます。 </li><li>セットアップに塩障壁とクロール表面寒天を転送します。 </li><li>寒天の上に放熱板を置き、2ミリメートル（幼生上記〜1ミリメートル）のプレートとクローリング面との間の間隔を調整。 </li><li>の直線勾配を確立少なくとも0.8℃/ cmで34℃（視野内の障壁から約2センチ）から18℃（視野内の反対サイトでの障壁から約2センチ）に調整することにより、 1°Cと45°Cの水回路の温度。 注：金属板の異なる勾配特性は、実験的に確認される必要がある異なる温度を必要とする。これらの設定は、実験中に変更する必要がない。 </li><li>セクション5で説明されているように設定を調整します。 </li><li>クロール表面は20分間の実験の前に勾配で平衡化することを許可する。高温計と温度勾配をテストします。 </li><li>セクション8に進みます。 </li></ol> 7. FIMイメージング（非刺激条件） <ol style="margin-left: 40px;"><li>静かに慣れペトリ皿から15の幼虫を収集し、トラッキング面の中央部に転送する小さな湿った絵筆を使用してください。食べ物が残っているか、あまり転送しないでください水（7.8を参照）。 </li><li>レコード1 - 22センチメートル×22センチ追尾領域50の幼虫。 （統計的な理由は、遺伝子型あたり少なくとも100の個人を使用するための）ほとんどのスクリーニング用途のためのビデオあたり15匹の動物を使用してください。 </li><li>静かに幼虫を分離し、すべての幼虫が記録する前にまっすぐに移動し始めるまで約10〜20秒間待つ。 </li><li>非刺激条件については毎秒10フレームで2分間幼虫運動を記録します。出力形式として、非圧縮のTIFイメージを使用してください。 </li><li>録音中、それらを慣らすためにバイアルから次のビデオのための幼虫を収集クリティカル：光で記録された幼虫を邪魔しないでください。 </li><li>記録した後、大規模な絵筆で幼虫を削除し、地域の安全や法律規則に従って、それらを捨てる。 </li><li>幼虫を除去した後、超純脱イオン水でクロール表面をきれいにし、潤いを絵筆を使用しています。 </li><li> クリティカル：常に湿った表面を保持しますが、過度のMOを避けるハローまたは録音中に幼虫を取り巻​​く低下し、邪魔追跡として見ることができるisture、。 </li></ol> 8.オプション：FIMイメージング（漸次温度刺激条件） <ol style="margin-left: 40px;"><li>温度勾配が確立された後（セクション6を参照）、クロール表面に幼虫を置いた後20秒以内に記録するインスタントための記録ソフトウェアを準備する（8.2参照） 例えば、ビデオあたりのフレーム数を設定し、保存パスを定義。 </li><li>少し放熱板を持ち上げて、塩障壁から33℃2センチメートルで幼虫を置く。さらに一般的な手順については、6と7を参照してください。再び放熱板を下げて、幼虫がまっすぐに移動を開始した直後に3-4分間記録を開始。 </li><li>記録した後、直接、幼虫を削除し、清潔で、表面に潤いを与える。 NaClをの広がりを避けるために、塩寒天に触れないでください。 </li><li> クリティカル：常に湿った表面を保つが、避けるハローまたは録音中に幼虫を取り巻​​く低下し、邪魔追跡として見ることができる過度の湿気、。 </li><li>画像を保存し、次のビデオの準備をする前に、新しい動物を収集しながら、寒天表面には、1〜2分間の保湿後に再度平衡化することを許可する。すべての5ビデオ高温計を用いて温度勾配を制御し、（水温、高さ、および追跡表面に対してでのxy向き）必要に応じて温度を調整する装置。 </li></ol>幼虫歩行の9トラッキング注：詳細については、FIMTrackために添付のマニュアル（補足）を参照してください。プログラムフロー· ​​チャートについては、図2を参照してください。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>プレビューオプションを使用して、それぞれの実験のためのトラッキングパラメータを調整します。 <ol><li>カメラと視野に応じセンチあたりのピクセルを調整します。 </li><li>カメラの設定に基づいて、秒あたりのフレームを調整します。 </li><li>明るさのしきい値を調整しますので、目すべての動物で（フィードバックがプレビューに与えられている）が正しく検出されている。 </li><li>幼虫の領域サイズのしきい値を調整します。プレビューでのフィードバックオプションに注意してください。シングル動物は赤色で強調表示され、各動物の領域は青色で与えられている幼虫を衝突させる、黄色で強調表示されます。 </li></ol></li><li>右下のボタンを使用して追跡を開始。 注：成功した追跡した後、幼虫のトラックと計算された運動や姿勢の特徴を含むCSVファイルをフィーチャーした画像は、画像ディレクトリに保存されます。 </li><li>追跡結果を確認し、手動で調整するFIM結果ビューアモジュール（編集&gt;結果ビューアを...）を使用します。必要な場合には、付臭剤源に熱勾配または距離に関して配向をクロール、刺激レジーム例えばに対してデータを評価するために、刺激領域を規定する。より詳細な説明については取扱説明書（サプリメント）を使用してください。 </li></ol>データの10.評価<ol style="margin-left: 40px;"><li>エクセル、MATLABにcsvファイルまたはさらなる統計分析のために他のプログラムをインポートします。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない

行動神経科学では定量的に複雑な行動特性を解読することが必須である。したがって、多数の個体は、高分解能で観察する必要があり、自動化された手順は、統計分析のために必要とされる。ここでは、FIM画像化は、動物の広範囲の運動を監視する手段を提供する、新規な、簡単かつ堅牢な画像機構を説明する。 FIM画像機構の有効性は、ショウジョウバエの幼虫、プラナリア扁形動物およびCを用いて試験した虫ワーム 。 FIM技術は、脳、気管、消化管や前胃などの動物のさえ内部構造を、検出するために本質的に高いコントラストを提供します。それらは自動的に動物19の向きを特定するのに役立つことができるように、重要なことに、これらの内部構造が堅牢に識別される。 動画の画質をクロール表面上の水の過剰量によって影響され得る。したがって、非常に重要です寒天の水分を制御します。表面に古すぎる寒天またはあまりにも多くの水がアーティファクトを引き起こす可能性があります。同様に、気泡がクロール表面に含まれていないことを確認してください。一般的には、十分に準備寒天表面には4時間の映画を記録することができます。 により、基礎となる物理的原理にFIMイメージングは​​、優れた画像品質で、その結果、ほとんどノイズのない画像記録を生成します。これは次に、その後のコンピューターベースの画像分析を容易にし、高スループットを可能にする。しかし、方法論は直接寒天表面に連絡し、動物の分析に限定されている。追跡ソフトウェアは、ドーナツ形状を形成した動物によって挑戦されている。バイナリインジケータがドーナツ形状を認識したが、間違った背骨が計算されることがあります。 起因するトラッキングテーブルデュアル、トリプルカラーイメージングのモジュール構造に到達している。また、付加的な刺激（光、臭気物質、電気的または機械的刺激）を容易にすることができるデル上からivered。 FIMイメージングの電力に一致するように設計FIMTrackプログラムが容易にショウジョウバエの幼虫、C.を追跡するために採用することができる虫やプラナリア。こうしてと、その単純かつ安価な構成に（http://FIM.uni-muenster.deを参照）、FIM画像化は、生物医学的用途の幅広い可能であり、特に緊急ハイスループット試験を必要として可能にする。

ほとんどの動物は、高度に洗練された制御された様式で移動する能力を有している。遺伝的基礎基盤となる歩行制御を解読するためには、定量的に異なる行動パターンを評価するために必須です。この点において、ショウジョウバエの理想的なモデルとして役立つことができる。自由にショウジョウバエ1-4そそるが、ショウジョウバエの幼虫のクロールされる飛行の追跡は、比較的低速で二次元的に発生し、容易に監視することができる。適切な照明と組み合わせたカメラベースのセットアップは、画像5を取得するために使用されている。入射光または透過光の両方が行動実験6,7で使用される。しかし、幼虫と幼虫の動きをクロール表面忠実な記録の可能性光反射の半透明の体に挑戦することができます。このような問題を克服するために、いくつかの複雑な方法が考案されている。最近では、暗視野照明は、前景/背景続きを強化するために導入されたRAST 8。カメラベースの記録に代わるものとして、レンズレス光イメージングおよび画像センサレスオンチップの取得技術は9-11導入されている。 いくつかのトラッキングプログラムが市販のソフトウェア12とカスタムソリューションを含む、最近導入された。ハイスループット追跡プログラムの例としては、マルチワームトラッカー（MWT）13とMultianimal歩行とトラック（MAGAT）8である。どちらも、衝突動物が複数の新しい動物のアイデンティティにつながるように、複数の動物は、単一のオープンフィールドアリーナで追跡できることを、共通している。この制限を克服するために、マルチウェルセットアップは個々のウェル14内に12匹の分離を導入した。単一の個人の運動の正確な定量化は、顕微鏡15と組み合わせて可動追跡ステージを使用することによって達成することができる。しかし、すべてのこれらのアプローチのいずれか費用非効率的であり、欠如、十分な再溶液またはハイスループット表現型のために時間がかかりすぎる。 フラ全反射（FTIR）16（ 図1）に基づいて、上述の限界を克服するために、我々が開発したFIM（FTIRベースのイメージング法）。この新しいイメージング手法は、前例のない高コントラストを提供し、さらには動物16クローリングのマルチカラー記録を可能にする。この便利で効果的な方法の基本原理は簡単です。アクリルガラス板は、光（赤外線例えば、875 nm）とが殺到している。によるアクリルガラスと空気の屈折率が異なるために、光は全ガラス/空気界面で反射される。アクリルガラスの加熱なしには16に注目されていない。より高い屈折率を持つオブジェクトは、日当たりのテーブルに触れた場合のみ、これらのオブジェクトを入力する点灯することができます。動物が表面に触れた場合は、光が反射され（ 図1）の下方から撮像することができる。結果は、唯一の接触動物の面積は、全体的な黒の背景に詳細なイメージングを可能に明るいスポット、として表示されます。このように、FIM-イメージングは​​コンピュータビジョンアルゴリズムのための完全な映画を記録することができます。 FIMのシンプルかつ堅牢な使用が今手に複雑な動物の行動の詳細な高スループット分析をもたらし情報処理研究するために使用することができます。 例えば、嗅覚8、16、。ビジョン17または熱感覚18。 <img alt="図1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650"> 熱刺激の統合基盤となる物理的原理1. FIMセットアップ図。 （A）FIMセットアップ。照度は、フロントパネルで調整することができる。（B）熱刺激を送達するために、ブラック、アルミニウム板を塗装両側に温水と冷水で灌流し、寒天表面上に2mmの置かれているそれ自体は、2mmの厚さである。勾配は、放熱板との温度差により寒天上で確立される（C）減衰全反射の物理的原理：アクリルガラス板が赤外光によって照明される。 θ1、θ2、θ3は、光の反射角度を示している。 N A、N 1、N 2およびn 3はそれぞれ空気、アクリルガラス、寒天と幼虫の屈折率を表し、不平等N A &lt;N 1 &lt;N 2 &lt;N 3を果たす。屈折による、反射角は、移行中に変化する。角が臨界角以下であれば、光はもはや反映されていない、層を通過することができ、下からキャプチャすることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> SPFIMによって分析することができるプロセスのectrumが広い。さらなる調整なしで、FIM画像化は、ショウジョウバエのすべての幼虫（ 図5B）を監視するために使用することができ、またはショウジョウバエ成虫19のフットプリントを追跡するために使用することができる。 C.の同様に、軌跡エレガンスまたはプラナリア扁形動物の移動が容易に（ 図5C）を記録することができる。真菌菌糸または根毛成長のさえ解析が実現可能な19表示されます。我々の現在のFIMのセットアップでは、4×16赤外線発光ダイオード（IR-LED）は（ 図1）トラッキングテーブルと呼ばれる、32×32 cm 2のアクリルガラス板に組み込まれている。 IR-LEDの強度を容易にパルス幅変調（PWM）を介して回路に接続されたマイクロコントローラによって行うことができるトラッキングテーブル上の対象物の重量に応じて調整される。 FIMは、照明強度の広い範囲にわたって非常に高いコントラストの画像が得られる。重要なことは、それGENすでに低い全体赤外線irridationで優れた結果をerates。 赤外線フィルタ付きカメラは、セットアップへの追加的な刺激の統合を可能にするトラッキングテーブル、下に配置されている。熱刺激は容易に放熱板によって適用することができ、光刺激は、LCDプロジェクターによって適用される。また、臭気物質は、簡単な蓋8によって勾配に含有させることができる。熱勾配の実験のために、放熱板がそれぞれ両側に冷温水で灌流し、幼虫（ 図1B）2mm上方に配置される。 高コントラスト、高品質ムービーの生成は、このように、我々は画像から特徴の大きなセット（ 図2）を抽出するFIMTrackソフトウェアを実装し、洗練されたコンピュータベースの画像解析のための可能性を開く。まず6主な機能は、動物（ 図3A）の輪郭から定義された。これらの機能は、ベースラインを提供与えられた時点（ 図3B）での動物の形状と特 ​​定の刺激でその位置を記述6二次の機能の更なる計算のために。現在、9三次特徴は時間的側面 ​​を統合するため、プライマリとセカンダリの機能（ 図3C）と一緒に動物の運動を特徴付けるされているように計算されます。 <img alt="図2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650"> 図2. FIMTrackの概要、アルゴリズム的なワークフローと幼虫の表現。 （A）どのようFIMTrackを使用します。画像がロードされます。グレー値のしきい値および単一の幼虫を定義する幼虫のサイズのしきい値を設定する必要があります。幼虫のエリアは[分サイズ、最大サイズ]でなければなりません。トラッキングがハイライトされたボタンによって開始されます。（B）のトラッキングのワークフローを。スタートボタンがクリックされた後、背景画像caがあるlculated（時間をかけて、最小限の強度）。限り左フレームがあるように、幼虫はグレーのしきい値と最小値と最大サイズのしきい値に基づいてセグメント化されている。幼虫の表現が計算されるすべてのセグメント化のための（（C）と比較）。有効トラックが利用可能である場合、それぞれの新しいモデルは、所与の軌跡に関連している。最後のフレームに達した場合、後処理を確定する出力生成に続いて行われる。（C）幼虫の表現。動物は、頭と尾のポイント（HとT）から構成されています。これらの点の間に脊椎点sの任意の奇数iは 、半径r iを設定することができる。また、質量mと角γを曲げ本体の中心が計算される。いくつかの運動関連パラメータは、紫色の線で描かれている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> FIMTrackで計算3.特長図。動物の輪郭に基づいて、（A）主な機能。（B）二次機能は、主要な機能に基づいて。（C）第三の特徴、連続したフレームと追加入力の主な特徴に基づいて、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。</a>

<table><tbody><tr><td>FIMセットアップ</td><td>カスタム&nbsp;</td><td></td><td>セットアップの建設または購入の詳細は、ご要望に応じてご利用いただけます</td></tr><tr><td>アクリルガラスプレート</td><td>カスタム&nbsp;</td><td></td><td>寒天</td></tr>注ぐための追加ヒート<tr><td>ラジエータープレート</td><td>カスタム&nbsp;</td><td></td><td>アルミプレート(マットブラックの塗装)調整可能な取り付けで対向するサイトに灌流可能</td></tr><tr><td>水熱量計/冷却ポンプとホース</td><td>カスタム&nbsp;</td><td></td><td>GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) と Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td></tr> <tr><td>に基づく標準カメラ (4 MP)</td><td>Basler</td><td>acA2040-25gm</td><td>カメラ FIM セットアップにデフォルトで使用される</td></tr><tr><td>テストカメラ (1.4 MP)</td><td>QImaging</td><td>&nbsp;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td><td>比較用</td></tr><tr><td>カメラ テストカメラ (0.8 MP)</td><td>Point Grey</td><td>Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td><td>比較用</td></tr><tr><td>カメラ テストカメラ (0.3 MP)</td><td>Sony</td><td>PS Eye USB2.0 カメラ</td><td>比較用カメラ</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Custom&nbsp;</td><td></td><td>i5 Intelプロセッサ以上、16 GBのRAM、十分なHDDストレージスペース[>1TB]</td></tr><tr><td>Standard Fly food</td><td>Custom&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタンダードフライバイアル135mlSarstedt</td><td>AG&Co、N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>78,895</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 9 cm</td><td>Sarstedt AG&Co、N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>821,473</td><td></td></tr><tr><td>超純脱イオン水</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>Synergy&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth GmbH、カールスルーエ、ドイツ</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>食品グレードの寒天</td><td>AppliChem GmbH、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>A0917,5000</td><td></td></tr><tr><td>絵筆(小および大)</td><td>ミラノ</td><td>Aquarell 310 サイズ0および2</td><td></td></tr><tr><td>パイロメーター</td><td>Trotec</td><td>BP20</td><td></td></tr></tbody></table>

fimイメージングとfimtrack：高スループットとコスト効果的な歩行分析を可能に二つの新しいツール

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

神経細胞のネットワーク機能の解析は、行動特性の信頼性の高い測定が必要です。自由に動く動物の行動はある程度可変であるため、多くの動物は、統計的に有意なデータを得るために、分析されなければならない。これは次に歩行パターンのコンピュータ支援自動化された定量化が必要です。ほぼ半透明と小さな移動物体の高コントラスト画像を得るために、FIMと呼ばれる減衰全反射に基づく新規なイメージング技術を開発した。このセットアップでは、動物は、基礎となるだけクローリング面と接触の非常に特定の位置に赤外光で照明される。この方法は、非常に高いコントラストの画像が得られる。続いて、これらの高コントラスト画像は、確立された輪郭追跡アルゴリズムを使用して処理される。これに基づいて、我々は、定量的運動の多種多様を記述するために必要な機能の数を抽出するのに役立つFIMTrackソフトウェアを開発特性。このソフトウェアパッケージの開発中に、我々はさらにモジュールを簡単に追加できるように、オープンソースのアーキテクチャ上の私たちの努力を集中した。プログラムは、プラットフォームに依存しないで動作し、データ解析を介してユーザを案内する直感的なGUIを伴う。すべての運動パラメータ値は、更なるデータ分析許可のcsvファイルの形式で与えられている。また、追跡ソフトウェアに統合結果ビューアは、対話的に見直し、刺激の統合の際に必要になる可能性があるとして、出力を調整する機会を提供する。 FIMとFIMTrackの電力がショウジョウバエ幼虫の運動を研究することによって実証される。

異なる解像度特性を有するいくつかの異なるカメラを撮像する（図4）を試験した。適切なIRフィルターを備えたすべてのカメラ。この試験で最も低価格カメラの低解像度に応じて、視野は10センチメートル×10cmのに限定される。最良の結果は、4メガピクセル（MP）のカメラを用いて得た。これは三齢幼虫の長さ当り100ピクセルの解像度につながり、簡単に内部構造を認識することができました。さらに、動物の蠕動が容易（ 図4A）を抽出することができる。しかしながら、依然としてさらにFIMTrackによって分析することができる安価なカメラを使用して、高コントラストの動画を取得することができる。 8ビットの深さと1392 X 1040ピクセルの解像度で1.4 MPカメラを使用すると、約半分の価格で、視野内の三齢幼虫の長さ当たり45ピクセルの解像度を可能にします。頭部それ以外の内部構造を認識することができない（ 図4B）。蠕動のトラッキングおよび検出が可能ですが、精度は（ 図4B）が低減される。 1.4 MPカメラに匹敵する空間分解能でさえ安価な0.8 MPカメラでは、幼虫の頭が（ 図4C）もはや忠実に認識することができない。トラッキングと蠕動分析が可能であるが、ノイズの増加に基づいて、よりジッタを含む。驚くべきことに、たとえ低解像度のUSBウェブカメラ（20€、 図4Dの下に、0.3 MPカメラ）幼虫の軌道を計算するのに十分な品質の映画を提供します。蠕動は、面積から計算することができますが、測定は非常にうるさいです。 私たちのセットアップでは、日常的に4 MPカメラを使用しています。スクリーニングのために、このカメラは、明らかに、ハイスループット分析が可能になるように同時に多数の動物を分析する機会を提供し22センチメートル×22センチアリーナを監視可能にする。この設定を使用すると、幼虫の長さIまだ蠕動の記録と分析を可能にする40ピクセルで表さね。熱勾配で15幼虫の軌跡の画像例を図5（a）に示されている。また、マクロレンズの使用は、多くの内臓が見えるようになり、ヘッド認識がさらに改善されて非常に高い解像度（ 図5B）で画像の幼虫することができます。さらに、これらは、広範囲20の動作のさらなる詳細な分析のために使用することができる。同じセットアップを簡単にイメージがCをクロールに使用することができますelegansのワーム （ 図5C）。 <img alt="図4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650"> 別のカメラ用図4. FIMイメージングおよび追跡結果。左（A）：10のfpsで4 MPカメラで撮影し10センチメートル×10cmの追跡段階でのクロール3幼虫のFIM画像化。ミッド：クリッピングし、単一の幼虫の大量軌道の中心。動物の領域が示されている。右：幼虫の面積は100フレームの上にプロットした。 （A）に相当しなく0.8 MPのカメラで撮影し、赤の矢印は、切り出し画像の時点を示す。（A）に相当しますが1.4 MPカメラを用いて捕捉（B）（C）（D）に相当し（ A）が、0.3 MPカメラを使用してキャプチャ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650"> 図5.熱刺激、及び高分解能アプリケーション。 （A）熱刺激アプリケーション（ 図1を比較）。 Fi経由で計算された軌道MTrack。（B）マクロレンズを使用して、第三、第2および第1齢幼虫の高解像度アプリケーションイメージ。三齢幼虫の長さは2.5×2.5cm 2の視野内のピクセル400によって表されている。（C）C. elegansのワームは、FIMイメージングを使用してキャプチャ。スケールバーが示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

FIMは、Cなどの小さな移動物体を追跡するために設計された新規、費用効果的なイメージングシステムである虫、プラナリアやショウジョウバエの幼虫。添付FIMTrackプログラムが高速で効率的なデータ分析を提供するように設計されている。一緒に、これらのツールは、行動特性の高スループット分析を可能にする。

FIMイメージングとFIMtrack：高スループットとコスト効果的な歩行分析を可能に二つの新しいツール

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

以下の方法論の全体的な目標は、ショウジョウバエMelan Gasterの幼虫の移動を視覚化および定量化し、自由移動条件でのハイスループットスクリーニングを可能にすることです。これは、FIM セットアップでトラッキング サーフェスを作成し、間接照明にフラストレーション全反射を使用することで実現されます。次に、異なる遺伝子型の幼虫を表面に配置し、熱勾配に応じた這う行動を記録します。その後、ビデオはFIMトラックによって分析されます。得られたソフトウェアとデータを使用して、幼虫、移動パターンの違いを説明するプロットを生成します。その結果、幼虫の定量が正確で、ハイスループットで、柔軟性があり、使いやすいことが示されています。ロコモーションは、FIMイメージング技術と関連するFIMトラックプログラムに基づいて行うことができます。入射光や透過光を使用するなどの既存の方法のこのイメージング技術の主な利点は、表面に触れている動物のみが見えることであり、その結果、邪魔なアーティファクトのない優れた前景背景コントラストが得られますが、この方法はoph溶岩の生物学への洞察を提供することができます。また、シーエレガンス、プレナリー、さらには植物の根の成長など、他の単一生物の歩行行動、ハエ、移動運動の研究にも適用できます。この手法を視覚的に示すことは、複雑なテクノロジーが使いやすいことを他の人に納得させるために重要です。最初のステップは、FITRベースのイメージング法またはFIM用の湿った這う表面を作成することです。これを沸騰させるには、脱イオン超純水で0.8%食品グレードのオーガーを沸騰させます。ホットオーガーをアクリルガラスプレートに注ぎます。沸騰させた後、オーガーを攪拌せず、絶えず注ぎます。この温度での気泡を避けるために、厚さ2ミリメートルのスラブを作成する必要があります。残りのオーガー溶液を使用して、標準の6センチメートルのペトリ皿を満たします。これらは、実験の前に幼虫を清潔で慣れさせるために使用されます。次に、オーガースラブの周囲から約2センチメートルトリミングして、記録用のプレーンな正方形の表面を取得します。冷却後、オーガースラブをFIMセットアップに直接移します。オーガーをアクリルガラスプレートの端にそっと押し込むことにより、オーガーは所定の位置に滑り込むはずです。これで、クロール面に嫌悪性オーガーバリアを含めるためのイメージング準備の準備が整いました。2.5%食品グレードのオーガーを3モルのNACLで脱イオン超純水で沸騰させます。次に、前に注いだ這う面に視野を囲む幅2センチのノッチを切り取ります。準備ができたら、トラッキング面より0.1〜0.3センチメートル高いソルトオーガーでノッチを埋めます。次に、熱勾配装置を準備します。この装置は、断熱面で覆われ、両端にポンプからの水が灌流されたアルミニウム板です。温度制御を可能にするには、使用の1時間前にヒートグラジエントデバイスの電源を入れ、セットアップの上に置き、目的の温度に達するようにします。この時間は、さらなる準備に使用できます。準備ができたら、塩バリアを備えたクロールサーフェスオーガーをセットアップに移します。ラジエータープレートをオーガーの上に置き、プレートとクロール面の間隔を2ミリメートルに調整します。この装置に適した水回路の温度を摂氏1度と摂氏45度に調整することにより、摂氏34度から摂氏18度までの線形勾配を確立します。這う表面を勾配で20分間平衡化させます。先に進む前に、TERで温度勾配をテストしてハエを準備し、摂氏25度のインキュベーターからハエを取り出し、培養バイアルに少量の水を落として、スター幼虫の移動の後半3分の1を駆動します。次に、小さな絵筆を使用してバイアルの壁から最大の幼虫を収集し、録画の2〜5分前に準備したペトリ皿に1つのビデオに十分な幼虫を移します。温度勾配が確立されたら、録音ソフトウェアをセットアップします。ビデオあたりのフレーム数を指定します。保存パスを定義し、20秒以内に即時録音するように設定します。幼虫を這う面に置いた後、幼虫の1つを画像化し、照明強度を調整して良好なコントラストを得る。準備ができたら、ラジエータープレートを少し持ち上げて、幼虫を塩バリアから2センチの摂氏34度に置きます。ラジエータープレートを再度下げて、動物に邪魔されないように暗闇で録音を開始します。録音後、幼虫をきれいに取り出し、表面に潤いを与えます。NACLの拡散を防ぐために、作業中はソルトオーガーに触れないでください、表面は常に湿った状態に保つ必要がありますが、幼虫を取り巻くハローや水滴として見られる可能性のある過度の湿気を避けてください。録音や妨害されたトラッキングでは、オーガーの表面を1〜2分間平衡化させてから続行します。この間に、収集した画像を保存し、新しい動物を集めます。次のビデオの準備として、5 本のビデオごとに TER を使用して温度勾配を制御し、必要に応じて温度デバイスを調整します。ロコモーションのトラッキングを開始するには、プレビューオプションを使用してトラッキングパラメータを調整します。カメラと視野に応じてピクセルあたりのミリメートルを調整します。次に、カメラの設定に基づいてフレーム/秒を調整し、プレビューウィンドウで提供されるフィードバックを使用して、すべての動物が正しく検出されるように明るさのしきい値を調整します。次に、幼虫の面積サイズのしきい値を調整し、単一の動物は衝突する幼虫を黄色の円で強調表示し、各動物の領域を青で強調表示します。トラッキングセッション終了後、右下のボタンでトラッキングを開始すると、幼虫の足跡をフィーチャーした画像と、計算された移動と姿勢の特徴を含むCSVファイルが画像ディレクトリに保存されます。最後に、FIM 結果ビューア モジュールを使用して、トラッキング結果を確認し、手動で調整します。熱勾配に対するクロールの向きを定義して、この刺激に基づいてデータを評価します。ここに示す幼虫の表現では、頭と尾のポイントがこれらのポイントの間にマークされています。半径を使用して、任意の奇数のスパインポイントを設定できます。また、重心と本体の曲げ角度を算出します。ここに示されているのは、さまざまなカメラからのFIイメージングとトラッキングの結果です。左の画像は、10 cm x 10 cm の追跡ステージを這う 3 匹の幼虫を捉えています。1匹の幼虫の質量軌道と面積を右側に示します。赤い矢印は、適用によってクリップされた画像の時点を示しています。ここでは、熱刺激をFトラックで計算された異なる色の軌跡として示しています。これらの高解像度のアプリケーション画像は、星の幼虫の3番目、2番目、および最初の画像でマクロレンズで取得されました。海のような他の生物も簡単に画像化できます。習得すると、各トラッキングセットアップごとに1時間あたり約100のラボを分析できます。この手順を試行する際は、この手順に従って常に同じ条件下で記録することを覚えておくことが重要です。光遺伝学的刺激や神経活動のin vivo検出などの他の方法もセットアップに含めることができます。このビデオを見た後、尿路運動を効率的に分析することがいかに簡単であるかを十分に理解しているはずです。

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