リモート四肢虚血プレコンディショニング：げっ歯類における神経保護技術
2015年6月2日
リモート虚血プレコンディショニング（RIP）が損傷ストレスに対するコンディショニング組織の方法です。我々は、5〜10分間血圧計用カフを膨張させることによって、下肢のリモート虚血の方法を確立しました。 RIPの神経保護機能は、げっ歯類における網膜変性のモデルで実証されています。
この手順の全体的な目標は、後肢に虚血を送り込み、その後のストレスに対して遠隔組織を調整することです。たとえば、光損傷に対する網膜。これは、最初に手動のIngleマママメーターを校正することによって達成されます。
次に、動物に麻酔をかけ、加熱パッドの上に置きます。次に、動物の後ろ足を伸ばし、カフを所定の位置に置きます。最後に、遠隔虚血は、ポンプでカフを膨らませ、カフを収縮させ、このプロセスを2回目に繰り返すことによって行われます。
最終的に、光害の前に適用した場合、遠隔虚血は網膜機能とアポトーシスを受ける光受容体の数の改善を示すために使用されます。この方法は、神経科学分野の重要な質問に答えることができます。例えば、遠隔虚血性プレコンディショニングによる自己防衛の誘導方法によるリアルタイムの皮膚温度追跡を実施するためのものです。温度記録ソフトウェアを開き、温度設定を摂氏30〜35度に調整し、サンプリングの頻度を100ミリ秒ごとに調整します 250〜550グラムのラット用のサイズ2の新生児用アームカフを使用して、必要に応じてアダプターを使用してカフをフォムマノメーターに接続します。
次に、エアリリースバルブを緩めるか、アダプターからカフチューブを外して、カフを収縮させます。チューブに圧力が残っていないこと、および圧力計の針が楕円形の長方形の内側でゼロになっていることを確認します。次に、チューブ、圧力計、咳の間の圧力を確認します。
膨張電球の穏やかなポンプを使用して、圧力計が100ミリグラムの水銀を読み取るまでカフを膨らませます。圧力が一定のままであることを確認した後、暗くなってからエアリリースバルブをゆっくりと開いてカフを収縮させ、テキストプロトコルに従って動物を適応させます。後肢の上部をつまんで、十分な筋肉が存在することを確認し、筋肉の緊張が良好であることを確認します。
テキストプロトコルに従って動物を鎮静した後、脚を伸ばし、足の下側の皮膚をつまんで麻酔の深さを確認します。次に、人工涙液を塗布します。ラットを下肢のフットパッドを上に向けて、加熱パッドまたは循環式給湯器チューブのいずれかに腹臥位に置きます。
皮膚温度プローブを適用するには、虚血を起こすラットの脚を伸ばし、皮膚プローブをフットパッドにしっかりと置き、温度プローブと皮膚との接触を最大化するように配置します。次に、紙テープを使用してプローブを貼り付けます。温度記録ソフトウェアで温度を1〜2分間追跡することにより、スキンプローブの配置を確認します。
皮膚の温度が摂氏30〜34度で、安定していることを確認してください。それ以外の場合は、プローブを調整して遠隔虚血を発症します。カフを収縮させて、空気圧バルブが閉じていることを確認します。
脚を伸ばし、後肢上部の袖口をゆるく包み込みます。人差し指と親指を使って脚を伸ばし、下指を使って緩めた袖口を所定の位置に保ちます。次に、カフの圧力を160ミリメートル水銀柱に上げます。
正しい圧力に達したら、タイマーと足の温度の記録を開始します。足の温度は、5分間の一定の圧力の後、摂氏2度低下し、膨張球根を短時間で繰り返しポンプして、目的のカフ圧力を維持し、虚血全体を通じて動物の膝より上のカフの位置を維持する必要があります。遠隔虚血を5分間連続して送達します。
次に、遠隔虚血を繰り返す前に、空気圧バルブを5分間再灌流します。手順が完了したら、空気圧バルブを緩めてカフ圧力を収縮させます。虚血プロトコルの過程で温度変化を確認します。
次に、カフを外します。動物を加熱パッドに置き、歩行可能になるまで監視を続けます。動物が歩いているときは、飼い物に戻します。
最後に軽傷を負い、トンネルアッセイを行います。ここではっきりと見られるように、テキストプロトコルによると、膝の上に配置された血圧カフを水銀160ミリメートル以上に上げると、後肢への血流が停止します。血流の欠如により、足の温度は動物の深部体温よりも低く低下し、カフが収縮した後に上昇し、RIPに必要な条件と一致しました。
この図では、正常な薄暗い飼育ラットの暗順適応網膜電図またはERGは、光損傷の1週間後に明るい閃光に対して大きな光受容体と内側の網膜応答を示しました。ERG記録は、光受容体の喪失を反映して、対照と比較して振幅の大幅な減少を示しましたが、虚血の直前に2分×5分の再灌流プロトコルを使用して後肢を虚血で前処理すると、光受容体が光損傷から保護されました。このパネルは、R-I-P-E-R-Gの振幅が軽傷のみよりも大きく、A波がわずかに減少したことを示しています。
最後に、膝の下に配置されたカフは、ここで見られるERG振幅の減少に反映されているように、光受容体を光損傷から保護するものではありません。遠隔虚血プレコンディショニングのような方法は、内因性神経保護のメカニズムは何か、遠隔虚血をどのように適用して中枢神経系の損傷や変性から機能を改善することができるかなどの追加の質問に答えるために実行できます。
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概要
本記事では、ラットの後肢においてリモート虚血プレコンディショニング（RIP）を誘発するための、制御された低侵襲な手法を実演します。この手順は、短時間で制御された虚血および再還流サイクルを通じて内因性の保護機構をアップレギュレートし、網膜などの遠隔組織をその後の損傷から保護することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 眼科学
- 実験生理学
背景
- 致死量以下の虚血は、内因性の保護経路を活性化させることで、より深刻な虚血イベントから組織を保護することができます。
- 遠隔虚血プレコンディショニング（RIP）は、ある組織（例：後肢）に短時間の虚血を誘導することで、脳、心臓、肺、網膜などの遠隔臓器に保護効果を付与する手法です。
- RIPは、重要臓器を損傷から保護する可能性について臨床研究が進められています。
- 先行研究により、RIPが光誘導性の損傷から網膜を保護できることが示されています。
研究目的
- ラットにおける後肢虚血を誘導するための、再現性があり侵襲性を最小限に抑えた手法を確立すること。
- 光誘発性損傷から網膜を保護する上で、本手法が有効であることを検証すること。
- 内因性神経保護のメカニズムに関するさらなる研究を可能にするプロトコルを提供すること。
使用された手法
- ラット後肢に使用するための手動血圧計および新生児用血圧カフの校正。
- ラットの麻酔および準備（ヒーティングパッドへの配置および人工涙液の投与を含む）。
- 後肢上部にカフを装着し、皮膚温度プローブでモニターしながら160 mmHgまで加圧して虚血を誘発させる。
- 虚血および再灌流サイクル：5分間の虚血に続き5分間の再灌流を行い、これを2回繰り返す。
- 足部の皮膚温度の低下、およびその後の再灌流時の温度上昇を確認することで虚血を検証する。
- 光損傷後の網膜電図（ERG）記録およびトンネルアッセイを用いた網膜保護能の評価。
主要な結果
- 膝上に装着したカフによる虚血は足部の温度を効果的に低下させ、動脈閉塞が確認された。
- 後肢虚血によるプレコンディショニングを施したラットでは、光損傷後の網膜機能が改善し、ERG振幅の測定により光受容細胞のアポトーシスが減少していることが示された。
- カフを膝下に装着しても網膜保護効果は認められず、カフの装着位置が重要であることが示唆された。
- 本プロトコルは、リモート虚血プレコンディショニングおよび神経保護の研究における信頼性の高いモデルを提供する。
結論
- 後肢虚血の制御による遠隔虚血プレコンディショニングは、光誘発性損傷からラットの網膜を保護するのに有効である。
- 本手法は低侵襲かつ再現性があり、内因性の神経保護メカニズムに関するさらなる研究に適している。
- このアプローチは、中枢神経系およびその他の臓器を損傷から保護するための治療戦略に寄与する可能性がある。
よくある質問
産業界における重要性
遠隔肢虚血プレコンディショニング（RIP）は、前臨床システムにおいて内因性の神経保護メカニズムを調査するための、再現性が高く低侵襲なモデルを提供します。このアプローチにより、中枢神経系（CNS）および網膜損傷を標的とした神経保護戦略におけるメカニズムのリスク低減と予測精度の向上が可能になります。そのトランスレーショナルな有用性は、虚血性および変性疾患を対象とした治療法の早期発見および前臨床パイプラインにおける意思決定をサポートします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 遠隔虚血刺激によって活性化される神経保護経路の解析を可能にします。
- 中枢神経系（CNS）および網膜における内因性保護メカニズムの機能的なターゲット検証をサポートします。
- 神経保護ポートフォリオにおける候補経路の予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- in vivoでの保護的な介入を評価するための、検証済みの定量的なモデルを提供します。
- 研究間で再現可能な比較を行うために、虚血再灌流プロトコルを標準化します。
- 化合物の評価に向けた定量的な読み取り値（例：ERG振幅、アポトーシスアッセイ）を算出します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー開発に向け、CNS（中枢神経系）および網膜損傷の疾患関連モデルと整合しています。
- メカニズムの解明から神経保護戦略の前臨床検証まで、一貫したフローを可能にします。
- in vivo で有効性が実証された候補物質の、リスク調整に基づいた推進を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このRIPプロトコルは、初期探索から前臨床検証までを統合しており、神経保護プログラムにおける仮説検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。
- 探索生物学：中枢神経系（CNS）および網膜における遠隔虚血保護の帰無仮説検定を容易にします。
- スクリーニング：条件間の比較に不可欠な、再現性と定量性のある出力を提供します。
- アナリティクス：ERGおよびアポトーシスデータの統計解析を可能にし、意思決定（go/no-go decision）に活用できます。
- トランスレーショナル研究：メカニズム的な知見を、疾患に関連する前臨床エンドポイントへと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：反復的な神経保護研究に向けた、標準化され拡張可能なモデルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 神経保護研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値： R&Dチーム間での再現性と標準化を向上させる。
- 戦略的価値： 神経保護候補物質に関するリスク調整後のポートフォリオ決定および資本配分に情報を供する。
- ポートフォリオへの影響： in vivoでの有効性が検証された候補物質の優先順位付けと推進を支援する。
実施上の検討事項
- げっ歯類の麻酔、虚血再灌流プロトコル、および定量的網膜アッセイに関する専門知識が必要です。
- 校正済みの血圧計、新生児用血圧カフ、および温度モニタリング設備が必要です。
- 虚血パラメータおよびデータ解析ワークフローのチーム間での標準化が求められます。
- 他の器官系や種へ適応させる場合は、プロトコルの最適化が必要になることがあります。
- 制限事項として、本モデルは急性虚血および光誘発性損傷のコンテキストに特化しています。
