January 18th, 2015
私たちは、筋線維芽細胞の表現型を持つマウスとヒトの食道間質細胞の初代培養物を生成するためのプロトコルを提示します。培養細胞は紡錘形の形態を持ち、α-SMAとビメンチンを発現し、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞表面マーカーを欠いています。特性評価された間質細胞は、上皮-間質相互作用の機能研究に使用することができます。
この手順の全体的な目標は、マウスとヒトの食道から一次筋線維芽細胞を分離することです。これは、最初にドナー新生児マウスから食道全体をヒト組織で採取することによって達成されます。粘膜は固有筋から分離されています。
2番目のステップは、ティッシュをミンチにしてHBSSで数回洗うことです。次に、組織をコラゲナーゼディスで消化し、さらに細かく刻んで、付着した上皮とともに間葉系細胞を放出します。次に、不均一な細胞集団を筋線維芽細胞培地で培養し、筋線維芽細胞が付着する一方で、上皮細胞は生存せず洗い流されます。
最終的には、免疫化学とフローサイトメトリーを使用して、初代培養中の細胞が筋線維芽細胞であることが確認されます。手順を実演するのは、私自身、技術者のMatthew Gargas、そして私の研究室のポスドクであるToriのchow newです。8〜12日齢のマウスを安楽死させた後、動物の背側をピンで固定し、腹側表面を70%エタノールで濡らします。
次に、鉗子を使用して、尿道開口部の前方の皮膚をつかんで持ち上げます。尿道口からあごまでの腹側正中線に沿って切り込みます。皮を切るだけです。
次に、尿道の開口部から膝まで切開し、逆さまのY字を形成します。切開が完了したら、皮膚を慎重に剥がして脇に置きます。次に、腹膜を持ち上げ、横隔膜と胸郭まで切り込みます。
胸腔内および腹部の内容物への損傷を避けるために、はさみを上に向けておいてください。次に、肝臓の左葉をそっと持ち上げて、胸骨と胸郭の正中線に沿って切られた手術用ハサミを使用して、下にある胃、食道胃接合部、および食道の腹部を露出させます。又。これを行うときは、はさみを下にある臓器から遠ざける角度に保ちます。
次に、胸郭を脇に引っ張って、胸腔の内容物を露出させます。次に、心臓と肺の両方の葉をそっと取り除きます。必要に応じて、綿のアプリケーターを使用して出血を吸収します。
胸部食道は、気管の後部と胸椎の前方にある狭くて柔軟な管です。新生児では、食道胃接合部を見つけて、胃から食道を特定します。率直に、脂肪や腸間膜組織を含む食道周囲の血管系を、子宮頸管の食道起始まで解剖します。
次に、食道の全長を切除し、必要に応じて冷やしたHBSSに移します。また、オリエンテーションのために胃の一部を取り出します。このプロトコルは、HBSS中のマウスまたはヒト組織から得られた粘膜断片を、それぞれ1.7ミリリットルのマイクロフュージチューブまたは5ミリリットルのチューブでミンチすることから始めます。
さて、ヒト食道間質細胞を取得するときは、鋭い解剖によって粘膜を下にある固有筋から分離することが重要です。今度はチューブ内で、細いハサミを使用して組織をさらに2〜3ミリメートルの断片にミントします。食道粘膜断片の沈殿物がゆっくりとデカントした後、HBSSは誤って組織を捨てないように注意します。
また、大型のチップピペットを使用して、追加のHBSSを取り外すこともできます。次に、新しいHBSSを追加します。チューブを穏やかに振って混ぜ、組織が落ち着くまで待ちます。
落ち着いたら、HBSSを再度デカントし、この洗浄を繰り返します。全部で8回ステップ。8回の洗浄後、組織をコラゲナーゼ11でインキュベートし、低速で室温で設定したロッキングシェーカーで最大25分間マウス組織をディスインキュベートします。
同じ条件下で、ヒト組織を6時間インキュベートします。消化後、細いハサミでさらに組織を混合し、200Gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレット状にした組織をきれいな1.7ミリリットルのチューブにデカントします。
次に、組織培養フードの下で、DMEMで細胞を2%ソルビトールで5回洗浄し、生存不能な細胞やその他の破片を排除します。洗浄のたびに、細胞が重力によって沈殿するのを待ち、洗浄液からデカンタします。洗浄後、細胞を6の3つのウェルに播種します。
ウェルプレートを作成し、真空ろ過された補充DMEMでそれらを培養します。ヒト組織は、標本培養物、細胞のサイズに応じて、ウェルが80%コンフルエントになるまで、より多くのウェルまたはプレートを必要とする場合があります。次に、接着細胞を最初にT 25フラスコに渡し、EDTA中の0.05%トリプシンを使用して細胞を取り除きます。
次に、反応を中和するためにメディアを追加します。取り除いた細胞を遠心チューブに集めます。次に、細胞を400 Gで回転させて顕微鏡で収集します。
接着細胞の紡錘形の形態を観察して、培養した間質細胞と筋肉細胞を区別し、デズモンドの免疫染色を行います。標準的なプロトコルを使用して、4つのウェルチャンバースライドで15,000個の細胞を短時間プレートし、筋線維芽細胞培地中で24時間増殖させます。翌日、細胞を固定し、一次抗体を適用する前に、固定した細胞をPBS中の5%ヤギ血清でブロックし、一次抗体と二次抗体の両方を5%ヤギ血清で希釈する必要があります。
一次抗体と室温で、または摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、洗浄後に細胞をPBSで3回すすぎます。二次抗体を添加し、細胞を1時間インキュベートします。
室温でPBSで3回洗浄し、二次抗体を除去します。その後、染色された細胞を洗浄後に分析できます。封入剤とカバースリップでDPIを塗布し、食道細胞の純度を確認します。
造血細胞および内皮細胞表面マーカーがないか確認してください。フローサイトメトリーを使用。彼らが集める準備ができるまで、培養フラスコで十分な数を増やします。
次に、培養したマウス食道間質細胞を、非酵素的細胞解離溶液を用いて摂氏37度で10分間剥離します。彼らのコレクションをフォローしています。セルをファックスバッファで2回洗浄し、セルをカウントします。
現在、標準的な染色手順を使用して、免疫細胞を同定するためにCD 45で染色し、内皮細胞を同定するためにCD 31で染色し、細胞をフローサイトメーターに通します。食道間質細胞は、機械的消化および酵素消化を使用して単離し、プレーティングから数時間以内に6つのウェルプレートで培養しました。細胞は、プレートに緩く接着した混合懸濁液中にありました。
次の24時間で、紡錘形の細胞が細胞懸濁液から発芽し、プレートの底にしっかりと付着しました。これらの細胞は5日以内に全井戸を覆い、ここで見られる少なくとも15継代の間、その形態を首尾よく保持した継代であったが、細胞は低密度である。これらは、食道間質細胞の初代培養物の共流暢さ、免疫染色に近い紡錘形細胞です。
チャンバースライドで成長させたところ、筋線維芽細胞の細胞骨格マーカーが豊富に発現していることが示されました。Alpha、SMA、およびmentonの培養純度をフローサイトメトリーで評価しました。一次murn食道間質細胞の前方散乱と側方散乱を確立した後、細胞表面タンパク質の生細胞のゲーティングと分析を行いました。
初代マーン食道間質細胞は、造血CD45の発現を欠いており、内皮CD31細胞表面マーカーの発現を欠いていました。このビデオを見れば、マウスとヒトの食道から筋線維芽細胞の初代培養を確立する方法についてよく理解できるはずです。はい。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
このプロトコルは、マウスおよびヒトの食道から一次マイオフィブロブラストを分離することについて概説しています。培養された細胞は、紡錘形の形態と特定のマーカー発現によって特徴付けられるマイオフィブロブラストの表現型を示します。
Reliable isolation and characterization of primary esophageal myofibroblasts enables disease-relevant modeling of stromal-epithelial interactions, a critical inflection point for target validation in fibrosis and tissue remodeling research. This protocol supports predictive confidence in early discovery by providing primary cell systems that closely reflect in vivo biology, reducing mechanistic ambiguity compared to immortalized lines. Consistent generation of pure stromal cultures facilitates cross-study and cross-condition comparisons, enhancing translational continuity across the R&D pipeline.
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing a foundation for target validation, assay development, and translational studies in esophageal disease models.