Name: マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学ぶマウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞を単離する方法。コラゲナーゼ処理と培養により紡錘形細胞を取得し、α-SMAとビメンチン発現で確認できます。この技術は上皮-間質相互作用の研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は何も開示することができません。

動物実験、根拠や研究の目的を実行するためのプロトコルは、南カリフォルニア機関動物実験委員会の大学から提出され、承認された。 デ·同定されたヒト食道切除標本から初代培養を確立するためのプロトコルは、南カリフォルニア大学倫理委員会で承認されました。 1.マウスまたはヒト食道を入手<ol><li> マウス食道を取得します。 <ol><li>頸椎脱臼に続いて2％イソフルラン吸入過剰摂取で8〜12日齢のマウスを安楽死させる。 </li><li>上下に面する腹動物を固定し、70％エタノールで腹側表面を濡らす。鉗子で、つかみ、ピンセットで尿道口に皮膚の前方を持ち上げる。あごに尿道口から腹側正中に沿って切断するための標準的なストレート外科用ハサミを使用してください。皮膚のみをカットするように注意してください。&lt;/ LI&gt; <li> &quot;Y&quot;逆さまを形成する、動物の両側の膝に下向きに開いて尿道から切開を行います。胸郭に沿って動物の両側に別の切開を行います。 </li><li>慎重に根本的な腹膜と胸郭のオフを、両側の皮をはがし、そして両側に横たわっていた。胸腔と腹腔の上にある腹膜の上にある胸郭を調べます。 <ol><li>鉗子で腹膜を持ち上げ、横隔膜と肋骨ケージにそれをカットアップ、腹部の内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを指している。静かに、肝臓の左葉を持ち上げ、基礎となる胃、食道·胃接合部と食道の腹部部分を露出させる。 </li></ol></li><li>子宮頸ガードルまでの正中線に沿って胸骨と肋骨を切断するためにオートクレーブ処理外科用ハサミを使用してください。胸部内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを向け。完全に内容を公開する両側に胸郭を引いて胸腔。 </li><li>静かに心臓や肺の両葉を取り除く。 Q-ヒント過剰な血液を吸収する。胸部食道は胸椎に気管と前の後方に横たわって狭い、フレキシブルチューブです。 NOTE：食道、マウス新生児識別することは困難である。食道·胃接合部のローカライズは、食道の識別は簡単になります。 </li><li>慎重に周囲の血管系、脂肪を解剖、胃から食道をフォローアップし、子宮頸キャビティ内の食道の原点までのすべての方法を腸間膜。鈍い先端を有する外科用ハサミは、この目的のために最適に動作。 </li><li>食道の全長を切除し、以下に説明するさらなる処理のためにハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に置く。必要に応じて、方向付けのために胃の一部を削除します。 注：小さな組織サイズのため、筋肉から固有筋層の分離粘膜は、マウス新生児食道達成できないし、全体の食道は、下記の処理が行われる。 </li></ol></li><li> 人間の食道を取得します。 <ol><li> HBSSで食道切除標本（典型的には、5 cm以下）を洗って接続されているすべての結合組織、脂肪、または血管系を削除します。 </li><li>標本の一部を切除し、必要に応じて将来の組織学的検査のためにホルマリン中に置く。 </li><li>鋭い切開によって、基礎となる固有筋層から残りの粘膜を分離する。 </li><li>サブセンチフラグメントおよび以下に記載されているプロトコルの対象に粘膜をカット。 注：ヒト食道切除は、後述する処理の前に、最大6時間、PBS中で保存することができる。食道標本の供給源は、試料サイズが決まると実験依存することになる。 </li></ol></li></ol> 2.アイソマウスおよびヒト食道間質細胞<ol><li> fは食道の間質細胞を単離する機械的および酵素消化の組み合わせにより、ROMのマウスおよびヒト組織。 <ol><li>機械的にHBSSではさみと複数回の洗浄で組織を切り刻むことでダイジェスト。酵素的に300 U / mlのコラゲナーゼXIおよび0.1mg / 25分（マウス組織）のために、または最大6時間（ヒト組織）mlのディスパーゼで組織をインキュベートすることにより、ダイジェスト。ミンチに使用する器具はオートクレーブし、滅菌されていることを確認します。 NOTE：コラゲナーゼは、コラーゲン、一緒に動物組織を保持する責任細胞外マトリックスタンパク質を分解する酵素である。コラゲナーゼXIは、高いコラゲナーゼ活性を有しており、この分離プロトコルの成功を見ている。ディスパーゼは、細胞膜活性を保持し、二次酵素としてコラゲナーゼと組み合わせて使用​​される穏やかなタンパク質分解解離活性を有する細菌酵素である。 </li><li> HBSSを含む、それぞれ1.7ミリリットルマイクロ遠心または5 mlチューブでマウスまたはヒト組織から得た粘膜の断片を置きます。さらに組織をみじん切りそれぞれのチューブに収まるオープン先端幅とハサミを使用して2〜3ミリメートル片に。食道粘膜の断片は、チューブの底に沈殿さを可能にするために十分な時間を確保してください。 </li><li>ゆっくりと不注意に組織を破棄しないように注意しながら、HBSSをデカント。穏やかに振とうすることにより、以下の新鮮なHBSSで交換してください。別の方法として、1ミリリットルピペットでHBSSを削除します。 </li><li>穏やかに食道断片は、各洗浄の間に沈降する時間を得るための洗浄の間で振とうしながら、このように8回の合計を組織を洗ってください。 注：ヒト組織は、よりその新生児のマウス組織を刻みが必要になります。 </li></ol></li><li> 300 U / mlのコラゲナーゼXIし、室温で低速でロッキングシェーカーセットで25分間0.1 mg / mlのディスパーゼを有するマウス組織をインキュベートする。 <ol><li>室温で低速に設定したロッキングシェーカー上、最大で6時間300 U / mlの第XIコラゲナーゼ及び0.1 mg / mlのディスパーゼでヒト組織をインキュベートします。 注：人間esophaの可用性GUSは可変である。初代培養の成功した世代で最大6時間の結果のための酵素とインキュベートしたヒト食道粘膜。 </li></ol></li><li>酵素消化した後、10分間200×gではさみや遠心分離機とのさらなるミンチ組織。 </li><li>上清を捨てる。非生存細胞および破片を除去するために、2％ソルビトールを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で5回の5mlチューブに混合細胞懸濁液からなるペレットを移し、洗浄する。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で6ウェルプレートに、培養中の種子細胞、10mg / mlのインスリン、10μg/ mlのトランスフェリン、10μg/ mlのゲンタマイシン、および2 / mlの上皮成長因子（EGF） 。真空フィルター（0.22μm）で濾過した後に添加することができるEGF以外のすべてのコンポーネント。切除サイズに応じて、複数の6ウェルプレートの中で人間の切除標本から得られた細胞を分配する。 </li><li>井戸が80％コンフルエントになったら、T25への通路接着細胞は私たちをフラスコる0.05％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 400×gでメディアやスピンで中和。 <ol><li> 1：1の比率でのT25フラスコ、継代細胞に6ウェル通過のため。 2または1：3の比率コンフルエントT25フラスコ1に継代することができる。 1の比率：T75フラスコにT25フラスコから通路に、1を使用。関係なく、容器の2〜3日おきにメディアを変更します。 </li><li>メディアは、上述の筋線維芽細胞において、加湿5％CO 2インキュベーターと培養液中で37ºCで細胞を増殖させる。 注：上皮細胞はこれらの培養または継代条件下では生存しない。特徴づけのために、以下に記載の研究に用いた細胞は、継代5と15の間である。 </li><li>筋線維芽細胞の培地に10％ジメチルスルホキシドを添加することにより、液体N 2中で細胞を凍結保存する。 </li></ol></li></ol> 3.特徴付けマウスおよびヒト食道間質細胞<ol><li>倒立顕微鏡で細胞の形態を調べます。紡錘形を守って接着性細胞の形態（ 図1）。 </li><li> α-SMA、ビメンチン、デスミン、およびサイトケラチン：以下の細胞骨格のマーカーを評価することによって培養細胞を特徴づける。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞は、α-SMAおよびビメンチン（ 図2）細胞骨格筋線維芽細胞マーカーを発現する。 <ol><li>さらにデスミンための免疫染色筋細胞から培養された間質細胞を区別する。培養細胞での免疫染色を行うために、4ウェルチャンバースライド中で1.5×10 4個の細胞をプレーティングし、24時間、筋線維芽細胞の培地中で成長する。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞が弱いか存在しないデスミンの発現を持つことになります。間質細胞は、上皮マーカーパンサイトケラチンの発現を欠く（データは示さず）。 注：培養物の評価は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学及び細胞表面マーカーによる細胞骨格マーカーの評価を含む。免疫細胞化学は、元のように特性化の主な方法として使用されている細胞骨格タンパク質のPRESSIONプロファイルは、線維芽細胞、筋線維芽細胞や筋細胞のためにユニークです。フローサイトメトリーは、上皮、内皮および造血細胞マーカーの細胞表面発現を評価することにより、培養純度を確立します。 CD90は​​、それがヒト線維芽細胞および筋線維芽細胞の両方で発現されるヒト間質細胞を同定する補助的方法として有用である。それはまた、マウスT細胞によって発現されるCD90は​​、マウス間質細胞の特徴付けに有用ではない。 </li></ol></li><li>細胞が60％コンフルエンスに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドをリンスし、メタノールで固定する。 -20℃で10分間、メタノール中で細胞をインキュベートし、その後、使用するまで4℃でPBS中に保存する。 </li><li>標準の免疫染色プロトコルに従ってください。 </li><li>簡単に言えば、一次抗体を適用する前、PBS中の5％goatserumで固定した細胞をブロックする。同様に、5％ヤギ血清で一次および二次抗体を希釈します。 <ol><li> α-SMAおよびビメンチンの検出のために、使用する以下の抗体および濃度：マウスmAbは、α-SMAを次のように1：500希釈：1でのビメンチンに250希釈し、ウサギたpAB。 </li><li> 1の希釈で200およびCy2とコンジュゲートヤギ抗ウサギ：PBSで3回洗浄し、1の希釈で二次抗体ローダミン結合ヤギ抗マウスを追加し、4℃で一晩室温で一次抗体と共にインキュベートし、1時間1,000室温で。 </li><li>次に、対比の1分間に1μg/ mlの濃度で4核 &#39;、6-ジアミジノ-2Phenylindole（DAPI）およびPBSで洗浄した。倒立顕微鏡でスライドを分析します。 </li></ol></li><li>造血のためのマウスおよびヒトの食道細胞の検査（CD45）およびフローサイトメトリーによる内皮細胞（CD31）の細胞表面マーカー（ 図3）によって、培養物の純度を確立する。間質細胞表面マーカーCD90の発現によって、ヒト細胞を特徴づける。 NOTE：CD90は​​、マウスTセルネズミ間質細胞を同定するために使用することができないLSはまた、CD90を発現する。 <ol><li> 10分間37℃で非酵素的細胞解離溶液で処理することにより培養フラスコから培養マウス食道の間質細胞を切り離し、二回FACS緩衝液で洗浄し、関連するアイソタイプコントロールでFITC-CD45およびAPC-CD31を用いて計数し、染色し、従っ標準染色手順に。 </li><li> FACSキャリバーを用いて細胞を収集し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析する。細胞を染色する前に、抗体を最適化し、アイソタイプ対照、正常マウスの脾臓および骨髄細胞を用いて濃度を滴定する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Helper+2+Cytokines%2C+Transforming+Growth+Factor+beta1%2C+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li>
</ol>

この作品は、NIH / NCI K08CA153036-01A1（AS）、健康のAGA-ゼネラル·ミルズベル研究所ガット生理学と健康で栄養研究員賞（AS）とライト財団パイロット賞（AS）によってサポートされています。

組織のサイズに適合さミンチ消化時間で、マウスまたはヒト組織を使用するときに初代培養生成のための技術は、一般的に類似している。マウス組織での経験は、上記の方法を使用して一貫して一次培養物の確立に成功をもたらすことを示唆している。プロトコル内の重要なステップは、手術器具の滅菌を含む組織培養の標準的な滅菌技術に従って。マウスの年齢も重要なステップです。 8から12日齢の新生児は、一貫して成功した初代培養をもたらす。若い新生児から単離された間質細胞は正常に生成されていないされていない。古いマウスから筋線維芽細胞のような間質細胞を確立するための試みは継続中である。その他は、4〜8週齢のマウス8から食道線維芽細胞の正常な生成を報告している。 結腸筋線維芽細胞の確立とは異なり、汚染がE中のまれな問題である抗生物質を培地に含まれているマウスの筋線維芽細胞の培養物のstablishment。培養物を、新生児マウスから確立されているため、制限要因は、小さな組織サイズおよび固有筋層の剥離が容易に実現可能ではないです。一方、人間の食道に、固有筋層は、容易に識別し、粘膜筋板から分離され...

上皮-間質相互作用は、粘膜の再生、修復、線維症、および発癌1,2-含む胃腸管の様々な機能の調節に関与する。これらの相互作用は、最高の小腸および結腸において研究されており、同様に食道粘膜障害3において役割を果たし得る。腸および結腸の間質細胞と呼ばれる筋線維芽細胞の亜集団は、組織損傷、炎症の媒介に関与し、4,5を修復することが実証されている。遠位の胃腸管では、これらの紡錘形細胞が上皮及び固有層の間の界面での基底膜に隣接して配置されており、α-SMAおよびビメンチン陽性の、汎サイトケラチン陰性、及び弱陽性またはデスミン陰性5として定義される。 食道ストロマ厳密セルラーまたは分子レベルで特徴付けられていない。ネズミの食道における私たちの仕事は、デを持って扁平上皮6に時折下にある、食道間質におけるα-SMAおよびビメンチン細胞monstrated。上皮-間質相互作用は、そのような胃食道仲介傷害6と好酸球性食道炎3として食道粘膜障害に関係している。線維性狭窄はまた、胃腸線維症の病因に関与していた食道の傷害および間質細胞の既知の合併症である。これらの細胞の単離は、錯乱シグナル伝達経路を調査するために必要な研究を達成するの​​に役立ちます。 この投稿は、これらの相互作用を媒介するシグナル伝達経路に関する知識の既存のギャップに対処することができるように、α-SMA陽性の、ビメンチン陽性の筋線維芽細胞の初代培養を確立するために必要な技術を提供する。記載された技術が正常初代マウス結腸筋線維芽細胞7及びfurtheを確立するために、著者らによって使用されているRは、マウス6と人間の筋線維芽細胞のような食道間質細胞の確立のために適合した。 】ここで我々は、将来の機能研究に使用する前に、マウスまたはヒト食道から確立これらの培養を確立し、特徴づけるために必要な条件について説明します。培養物を増殖させ、最大で15継代のために利用することができる。以下に概説する方法を経由して一次培養物の単離と確立は、筋線維芽細胞表現型を有する間質細胞を生成します。 、正のビメンチン-SMA、α、および​​デスミン弱陽性または陰性、及びサイトケラチン陰性であった。この表現型は3負または粘膜筋板6のα-SMA陽性の、ビメンチン陰性表現型α-SMA、主にビメンチン陽性である食道線維芽細胞の表現型とは区別される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">組織培養試薬</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>マウス mAB to &α;-SMA&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Vおよび7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>BD BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネットおよびインキュベーター</td><td>Nuaire</td><td></td><td><a href="http://www.nuaire.com/products/" target="_blank">http://www.nuaire.com/products/</a</td></tr><tr><td>>4ウェルチャンバースライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 真空駆動フィルターシステム</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルチップ Qチップ</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ソフトウェア</td></tr><tr><td>メタモルフソフトウェア(分子デバイス)</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

マウスおよびヒト食道筋線維芽細胞は、酵素消化を介して生成されます。新生児（8-12日齢）マウス食道は、収穫みじん切り、洗浄し、そして25分間、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる酵素消化に供される。人間の食道切除標本は、固有筋層と外膜を剥奪され、残りの粘膜はミンチされ、最大6時間、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素消化にかけた。培養した細胞は、α-SMAおよびビメンチンを発現させ、全く弱いかデスミンを発現する。培養条件は、上皮、造血、または内皮細胞の成長に貢献しない。培養物の純度は、さらに潜在的な汚染造血および内皮細胞の細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー評価によって確認される。記載された技術は、簡単であり、非hematopoieitc、非内皮間質細胞の一貫した生成をもたらす。この技術の制限事項の使用に固有のものである分子生物学の研究で初代培養、 すなわち 、避けられないばらつきが異なるマウスまたはヒトを越えて確立の文化の中で発生しました。初代培養は、しかし細胞株に比べて、生体内の状態をより代表反映している。これらの方法はまた、群間の比較を可能にする、研究者に異なる臨床および実験条件からストロマ細胞を単離し、培養する能力を提供する。特徴付け食道間質細胞はまた、食道疾患における上皮 - 間質相互作用を調査する機能的研究に用いることができる。

機械的および酵素消化を用いて単離し食道間質細胞は、最初に6ウェルプレートに播種し、培養する。めっき時間以内に倒立顕微鏡を用いた細胞の検査は、プレート底部（ 図1A）に緩く付着混合細胞懸濁液を実証する。次の24時間にわたり、プレート底部にしっかりと付着した紡錘状の細胞は、細胞がウェル内の5日間の全領域をカバーし、形態を維持し、正常に継代することができる。これらの出芽混合細胞懸濁液（ 図1B）から撮影観察される少なくとも15継代のために。紡錘型接着細胞を低密度（ 図1C）とするときほぼコンフルエント（ 図1D）で観測されている。 チャンバースライドで生育させ、食道間質細胞の初代培養物の免疫染色（ 図 α-SMAおよびビメンチン筋線維芽細胞の細胞骨格マーカーの豊富な発現を示すURE 2）、デスミンの弱い発現、および不在サイトケラチン。 食道筋線維芽細胞の初代培養物は...

私たちは、筋線維芽細胞の表現型を持つマウスとヒトの食道間質細胞の初代培養物を生成するためのプロトコルを提示します。培養細胞は紡錘形の形態を持ち、α-SMAとビメンチンを発現し、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞表面マーカーを欠いています。特性評価された間質細胞は、上皮-間質相互作用の機能研究に使用することができます。

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

この手順の全体的な目標は、マウスとヒトの食道から一次筋線維芽細胞を分離することです。これは、最初にドナー新生児マウスから食道全体をヒト組織で採取することによって達成されます。粘膜は固有筋から分離されています。2番目のステップは、ティッシュをミンチにしてHBSSで数回洗うことです。次に、組織をコラゲナーゼディスで消化し、さらに細かく刻んで、付着した上皮とともに間葉系細胞を放出します。次に、不均一な細胞集団を筋線維芽細胞培地で培養し、筋線維芽細胞が付着する一方で、上皮細胞は生存せず洗い流されます。最終的には、免疫化学とフローサイトメトリーを使用して、初代培養中の細胞が筋線維芽細胞であることが確認されます。手順を実演するのは、私自身、技術者のMatthew Gargas、そして私の研究室のポスドクであるToriのchow newです。8〜12日齢のマウスを安楽死させた後、動物の背側をピンで固定し、腹側表面を70%エタノールで濡らします。次に、鉗子を使用して、尿道開口部の前方の皮膚をつかんで持ち上げます。尿道口からあごまでの腹側正中線に沿って切り込みます。皮を切るだけです。次に、尿道の開口部から膝まで切開し、逆さまのY字を形成します。切開が完了したら、皮膚を慎重に剥がして脇に置きます。次に、腹膜を持ち上げ、横隔膜と胸郭まで切り込みます。胸腔内および腹部の内容物への損傷を避けるために、はさみを上に向けておいてください。次に、肝臓の左葉をそっと持ち上げて、胸骨と胸郭の正中線に沿って切られた手術用ハサミを使用して、下にある胃、食道胃接合部、および食道の腹部を露出させます。又。これを行うときは、はさみを下にある臓器から遠ざける角度に保ちます。次に、胸郭を脇に引っ張って、胸腔の内容物を露出させます。次に、心臓と肺の両方の葉をそっと取り除きます。必要に応じて、綿のアプリケーターを使用して出血を吸収します。胸部食道は、気管の後部と胸椎の前方にある狭くて柔軟な管です。新生児では、食道胃接合部を見つけて、胃から食道を特定します。率直に、脂肪や腸間膜組織を含む食道周囲の血管系を、子宮頸管の食道起始まで解剖します。次に、食道の全長を切除し、必要に応じて冷やしたHBSSに移します。また、オリエンテーションのために胃の一部を取り出します。このプロトコルは、HBSS中のマウスまたはヒト組織から得られた粘膜断片を、それぞれ1.7ミリリットルのマイクロフュージチューブまたは5ミリリットルのチューブでミンチすることから始めます。さて、ヒト食道間質細胞を取得するときは、鋭い解剖によって粘膜を下にある固有筋から分離することが重要です。今度はチューブ内で、細いハサミを使用して組織をさらに2〜3ミリメートルの断片にミントします。食道粘膜断片の沈殿物がゆっくりとデカントした後、HBSSは誤って組織を捨てないよ

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、採取したマウス伸筋長伸筋(EDL)からの単一筋繊維の分離を示しています。単離された筋線維は、筋線維関連筋幹細胞の活動を研究するために培養することができます。...

筋線維の単離:採取したマウス伸筋長指筋(EDL)から単一の筋線維を取得する技術

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

筋線維芽細胞は、正常および疾患状態の両方において重要な生理学的プロセスを調節、胃腸管の有力な間質細胞である。我々は、マウスおよびインビトロ実験のために利用することができるヒト結腸組織の両方からの一次筋線維芽細胞の単離を可能にする技術が記載されている。...

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。...

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

ここでは、凍結胃、小腸、および結腸組織産生細胞から初代線維芽細胞/筋線維芽細胞(MF)培養を分離し、確立するためのプロトコルが提示されます。これは、MF表現型を持つ細胞です。これらの細胞はCD90、α-SMA、ビメンチンを発現します。MFは、酵素活性やサイトカイン産生など、さまざまな機能アッセイに使用できます。...

人間の冷凍消化管標本からCD 90 +線維芽細胞/筋線維芽細胞の単離

線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。...

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。...

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

ここでは、テロサイトを含むマウス腸間葉系を単離するためのプロトコルを提示します。これらは、マウスまたはヒト由来のオルガノイドとの共培養など、いくつかの用途に使用して、成長をサポートし、元の組織の状況をよりよく反映することができます。...

マウス腸間葉系の単離により、テロサイトの高収率が得られます

オルガノイド-線維芽細胞共培養は、 in vivo...

オルガノイド共培養を用いた食道線維芽細胞の機能特性評価と可視化

ここでは、ヒト食道オルガノイドの培養と気液界面培養のプロトコールを提供します。食道オルガノイドの気液界面培養は、サイトカインが食道上皮バリアに及ぼす影響を研究するために使用できます。...

好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル 

学ぶマウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞を単離する方法。コラゲナーゼ処理と培養により紡錘形細胞を取得し、α-SMAとビメンチン発現で確認できます。この技術は上皮-間質相互作用の研究に有用です。

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

さらに動画を探す