Name: 2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ 2D差動ゲル電気泳動によるヒトマクロファージM1およびM2サブセットのプロテオーム解析法。シアン染料標識とISO電気泳動を用いてタンパク質発現差を検出し、疾患治療への応用可能性を示します。

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この作業はInsermによってサポートされました。Marion Bouvetは、フランス研究技術省のフェローです。Annie Turkiehは、欧州連合FP7 HOMAGE(305507)から授与されたフェローです。

プロトコルは、私たちの機関人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。健康なヒトのドナーからのバフィーコートは、地域輸血センター（リール、フランス）から入手した。軟膜から得られた試​​料は、INSERMコレクション（N°DC2010-1209）として宣言されています。 1.材料と文化メディアの準備<ol><li> 1×PBSを取得するために滅菌蒸留水に10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈する。 </li><li>とし、10％のプールしたヒト血清を含まないゲンタマイシン（40μg/ ml）を、およびL-グルタミン（2mM）を補充したRPMI 1640培地を加える。 </li></ol>単球由来マクロファージの2.初代培養（MDM） <ol><li> 1×PBSで軟膜（25ml）で希釈する。慎重に、室温で、20分間1600×gでフィコール/ leucosepチューブと遠心分離機にロードします。 </li><li>新しいチューブに界面での単球を収集します。 10mlで3回洗浄をPB​​S、0.1％のエチレンジアミンを含有する1X入れ、1,000×g、370×gで10分間ごとに、160×gで、かつ一旦1×PBS中で、単独で160×gで10分間での連続遠心分離によって酢酸（EDTA）。 </li><li>血清を含まない5ミリリットルRPMI-1640培地中で細胞ペレットを再懸濁し、皿あたり1×10 6細胞の密度で35mm皿中の細胞を播種する。 </li><li>インキュベーター内で90分間沈降した後、非接着細胞を含む上清を捨てる。 、単球からなる、1mlのPBSで3回接着細胞を洗浄。その後、以前に無血清の細胞の10％を含む新鮮培地1ml（v / v）のヒト血清を加える。 </li><li>培養6日後に、代替的な分化したマクロファージ（M2）を得た組換えヒトIL-4（15 ngの/ ml）を追加し、6日間維持する。その後、M1マクロファージを得るために4時間12日目（100 ng / ml）を、リポ多糖で分化したマクロファージを治療する。 </li></ol> 2D電気泳動用のM1およびM2マクロファージタンパク質の3.抽出<ol><li>ウォッシュmacroph年齢25 mMトリス、30 mMトリスpHが8,4％3を含む緩衝液中でpH7.4で、スクラップで三回 - [（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ] -1-プロパンスルホネート（CHAPS）、2 Mチオ尿素および7 M尿素。 </li><li> -20℃で氷とストア内で5分間1.5ミリリットルマイクロチューブに適しミキサーを使用して細胞を溶解する。 </li><li>商業Bradford試薬を用いてタンパク質濃度を決定する。使用するまで-20℃でタンパク質の100μlのアリコートに保管してください。 </li></ol> 4.等電点電気泳動注：暗闇の中で、すべてのラベリングの手順を実行します。 <ol><li> 37℃で1時間、2 mMのトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を溶解緩衝液で9μlに調整した各サンプル（M1およびM2マクロファージ）を5μgを減らす。 </li><li> 0.8 nMの/μgタンパク質の濃度M1抽出物及びM2のスルフヒドリル反応性染料抽出物、シアニン3（Cy3標識）を加える。 M1にシアニン5（Cy5の）を追加し、M2は0.8 NM /μgタンパク質の濃度で抽出し、インキュベート37℃で30分間インキュベートした。 </li><li> 7 M尿素を含む試料緩衝液の等容量を添加して反応を停止し、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、130mMのジチオスレイトール（DTT）および2％pharmalytes。 </li><li>ミックス片手でCy5標識M2サンプルとM1サンプルをCy3標識は標識し、別の手でCy5標識M1サンプルとM2サンプルをCy3標識は標識。 </li><li> 7 M尿素を含むバッファー中の標識混合試料450μlの、等電点電気泳動（IEF）電池システム上の2 Mチオ尿素、4％CHAPSで固定化pH勾配（IPG）ストリップ（240ミリメートル、pHが3-10直線勾配）を再水和任意の電流を印加せずに24時間。 </li><li> 3時間と3時間最終的に8,000 V 8,000 Vまでの勾配で、6時間1,000 Vまでの勾配で、その後3時間300ボルト（V）でフォーカシングを行う、と。 </li></ol> 5.第二次元注：暗闇の中ですべての電気泳動手順を実行します。 <ol><li>平衡化緩衝液でIPGストリップを含んでインキュベート0.1のTris-HCl（pHは8）る、6 M尿素、2％（w / v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、および10分間、30％（v / v）グリセロール。 </li><li>平衡化したIPGは12.5％PAGEゲル上に二次元（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE））のためにストリップに移し、低融点アガロースでシールする。 </li><li>ブロモフェノールブルーフロントがゲルの底に到達するまで、一晩300 Vに続く70 Vの定電圧を、Ettan-Daltsixシステムを使用して20℃で電気泳動を行う。 </li></ol> 6.画像取得およびバイオインフォマティクス解析<ol><li>スキャンゲルは、100ミクロンの画素サイズを有する画像を生成するためにCy3およびCy5 580分の532 nmのための670分の633の励起/発光波長でDIGEイメージャスキャナつの低蛍光ガラスプレートの間にキャスト。 </li><li>以前に詳細な12などの商用ソフトウェアと画像解析を実行します。 </li><li>各画像にスポットボリュームを計算し、正規化する。小道具として正規化されたスポット·ボリュームを割り当てるゲルで検出された各スポットの合計値のortion。 </li><li>二つのグループ（M1およびM2）の間の正規化されたスポットのボリューム値を比較することにより、マクロファージの各タイプのタンパク質スポット量の違いを分析する。変化は1.5倍に（p &lt;0.05、一方向ANOVA分析）である場合に有意であると、スポットボリュームの差を考慮する。 </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

利益相反の宣言はありません。

本明細書中に記載されるプロトコルは、マクロファージ、M1（炎症誘発性）およびM2（抗炎症性）の2つのサブタイプの種々の刺激の影響を分析するための方法を詳述する。以前に公開され7 M1及びM2マクロファージの初代培養物は、単球の分化から得た。 2D DIGEゲル電気泳動の手順は、Cy3およびCy5の励起/発光波長で2回ゲルを走査するために、SDS-PAGEのために、低蛍光プレート等電点電気泳動のためのIEFセル、蛍光スキャナーなどの特殊な材料や設備を必要とおよび2Dソフトウェア。この方法は、いくつかの練習や手先の器用さを必要とします。 1）タンパク質の抽出は、例えば、アルブミンやケラチンなどのあらゆる汚染のない環境において重要であり、2）暗所においてラベリングと電気泳動を実施：成功した2Dゲル電気泳動のためのいくつかの重要なステップがあります。避ける技術として、溶解緩衝液中のタンパク質の減少のためにDTTの使用は、反応性シアニン色素で標識する前に、タンパク質中のペプチドのスルフィド結合を低減するためのT...

マクロファージは、異なる機能の表現型を獲得することができる異種の、プラスチック細胞である。 インビボでの、これらの細胞は、微生物産物、サイトカインなど 1とマイクロ環境signalssuch多種多様に応答する。 インビトロ 、炎症誘発性表現型（M1）マクロファージのリポ多糖（LPS）およびインターロイキン4（IL-4）などのいくつかのサイトカインによる抗炎症性表現型（M2）によって誘導することができる。また、マクロファージは特定の信号2時には逆にM2表現型に活性化したM1から切り替え、することができます。 表現型に依存して、マクロファージは、異なる機能を有することになる。 M1マクロファージは、微生物または腫瘍細胞3を殺すために、例えば、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症誘発性サイトカインを産生する細胞である。対照的に、M2マクロファージは、抗inflammatorを生成することによって創傷治癒および線維症のように、これらの炎症性反応を防ぐそのようなTGF-β-3,4-としてyの要因。 以前Boyum 6から適合技術を使用して5に記載のように、健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞を、Ficoll密度勾配遠心分離によって単離した。培養中のマクロファージは、初代培養7の6日後、M1またはM2表現型に分化させることができる。 タンパク質発現またはそのような宿主または病原微生物毒素などの様々な制御された刺激の下でマクロファージ2つのサブタイプ間のタンパク質の変化の分析は、プロ - および抗炎症性マクロファージの機能を解読するために役立つであろう。 プロテオミクスは、具体的に上方または様々な刺激の下でヒト培養マクロファージにおけるダウンレギュレートされたタンパク質の直接監視のためのユニークなツールです。蛍光色素は、低感度画像解析8 &lt;ように、2Dゲル電気泳動の制限のいくつかを解決した<html> / SUP&gt;。システイン残基と反応染料は、リジン残基9との反応に比べ、検出感度が増加している。以前の研究では、古典的な銀染色した2D電気泳動11に比べて少ない試料10の分析のためのDIGE飽和標識化の有用性を実証した。この技術は、急速にマクロファージの2サブタイプ間または同じサブタイプからの未処理および処理マクロファージ間のタンパク質修飾を分析するのに役立ちます。 このプロテオミクス手法の利点は、2Dゲル12を分析することによって、タンパク質のサイズおよび翻訳後修飾の情報へのアクセスを行っている。これは分析することができるサンプルの数を制限し、高スループット技術ではないことを考慮すべきである。最近13日のように、質量分析に基づくハイスループットアッセイの開発は、これを改善することができる。 _contentは &quot;&gt;ここでは、等電点電気泳動、電気泳動の過程を経て培養されたマクロファージのタンパク質抽出から2D DIGE解析を実行する方法を提示し、SDS-PAGE、ならびに適切な2Dソフトウェアの有用性に関する情報。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>ロイコセップ</td>・<td>ダッチャー</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;6ウェルプレート PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Fluka</td><td></td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp;</td><td>3.00E + 01</td><td></td></tr><tr><td>フィルター0.22&micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml シリンダー</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-反応性染料</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>IPG ストリップ 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>プロティアンIEF 細胞</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Ettan-Daltsix システム</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Imager scanner</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Non linear dynamics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>15ミリリットルのチューブ</td><td>任意の</td><td>サプライヤーn / a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>ur&eacute;e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute;e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>2D clean Up</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>薄暗い&eacute;チルホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>電極ウィック</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

2d電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

ここで述べられている二次元(2D)電気泳動プロトコルの目標は、ヒト培養マクロファージの表現型をどのように分析するかを示すことです。マクロファージの重要な役割は、炎症性疾患、免疫疾患、感染症などのさまざまな病理学的疾患で示されています。このプロトコルでは、M1(炎症誘発性)またはM2(抗炎症性)表現型に区別できるヒト単球由来マクロファージの初代培養物を使用します。このin vitroモデルは、M1およびM2マクロファージの生物学的活性の研究やプロテオミクスアプローチにおいて信頼性があります。プロテオミクス技術は、宿主病原性におけるM1マクロファージとM2マクロファージの表現型と挙動を比較するのに有用です。2Dゲル電気泳動は、多数のタンパク質またはポリペプチドを同時にマッピングするための強力なプロテオミクス技術です。蛍光色素を使用した2D電気泳動のプロトコル、2D Differential Gel Electrophoresis(DIGE)について説明します。M1およびM2マクロファージタンパク質は、等電点泳動による分離前に、1次元目の等電点と2次元目の分子量に応じて、シアニン色素で標識されます。次に、分離されたタンパク質またはポリペプチドのスポットを使用して、タンパク質またはポリペプチドの発現レベルの違いを検出します。ここで説明するプロテオミクスアプローチにより、宿主の病原性や微生物毒素などのさまざまな障害に関連するマクロファージタンパク質の変化を調べることができます。

適切な差動プロテオーム解析を実行するために、分析される試料の処理は、検証されるべきである。 示した例では、マクロファージの細胞培養物の品質は、以前に公開された5として形態学的および分子の側面に必要とされる。マクロファージ培養物の均質性への単球の分化は、位相顕微鏡検査を行った。 図1は、M1とM2マクロファージの一次培養物の一例を示した。図示のように、我々は、低（ 図1A、C）および高（ 図1B、Dでの位相顕微鏡により培養の12日目にマクロファージのM1（ 図1A、B）及びM2（ 図1C、D）サブタイプの均質性を検証）拡大。明らかに、我々は、初代培養の12日後に、マクロファージM1およびM2の異なる形態を観察した。以前に公開されたように、我々は、RT-PCRにより、TNFおよびIL1をコードするmRNAの存在を検証するM2マクロファージにおけるM1マクロファージにおけるとMRC1</em...

マクロファージは、宿主の病原性に関与する重要な細胞です。マクロファージは、プロテオミクス解析によって分析および検出できる表現型および機能的多様性を示します。この記事では、M1またはM2表現型に分化したヒトマクロファージの初代培養物の2D電気泳動を行う方法について説明します。

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

この手順の全体的な目標は、ゲル電気泳動における2D差分により、ヒトの炎症誘発性M1および抗炎症性M 2マクロファージサブセットの表現型を分析することです。これは、最初に一次M1およびM 2マクロファージ培養物から抽出したタンパク質を正弦色素で標識することによって達成されます。第2ステップでは、タンパク質を混合し、再水和によるISOエレクトロフォーカシングをサンプルに行います。次の 2 次元では、動員された pH グラジエントまたは IPG ストリップを暗所で使用して電気泳動を行い、次にゲル電気泳動スキャナーの差でゲルをスキャンします。最終的に、数値化された画像の分析が行われ、M1とMの2つのマクロファージサブセット間のポリープ消化スポットの違いが検出されます。古典的なトーディゲル電気泳動のような既存の方法の中でこの技術の主な利点は、この技術がより感度が高く、必要なタンパク質がわずか5マイクログラムであることであり、これは人間の患者から得られるサンプルにとって非常に重要です。手順を実演するのは、博士課程の学生であるMario Bove、私の研究室のOlivia Beza、およびMagac技術者です単球由来マクロファージの初代培養を準備するには、25ミリリットルのBuffyコートを25ミリリットルのPBSに希釈することから始まります。次に、希釈した血液を分離勾配に慎重にロードし、細胞の回転が終了したら、細胞を1600Gおよび室温で20分間遠心分離します。界面層で単球を採取し、続いて、3回目の洗浄後に0.1%EDTAを含むPBSの10ミリリットルで回収した細胞を3回連続して洗浄します。PBSのみで細胞をもう1回スピンダウンし、次にペレットを血清種子を含まない5ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。35ミリメートル皿中の細胞を、皿ごとに10の10倍の密度で皿6個にし、インキュベーター内で90分間沈殿した後、上清を捨て、付着性単球を1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。次に培養する細胞を、37°Cおよび5%二酸化炭素で6日間、ヒト血清の体積当たり10%の容量を含む新鮮な培地の10ミリリットルで調製する。次に、抗炎症性のM 2マクロファージを生成するために、培養6日目にIL 4の1ミリリットルあたり15ナノグラムを一部の培養物に添加して、12日目に炎症誘発性マクロファージを生成します。分化したマクロファージの他の培養物をLPSの1ミリリットルあたり100ナノグラムで4時間処理し、2D電気泳動用のマクロファージサブセットを単離します。次に、目的の培養物を25ミリモルトリスで3回洗浄し、次にチャップ抽出バッファーでプレートの底から細胞を放出します。次に、細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度でひもで紐でつなぎます。5分後、100マイクロリットルのアリコートで細胞をマイナス20°Cの貯蔵に移し、マクロファージサブセットのISOエレクトロフォーカシングのためのタンパク質濃度分析を行います。まず、サンプルを9マイクロリットルのアリコートに調整し、次に37°Cで2ミリモルのTCEPを添加した溶解バッファーで細胞溶液を還元します。1時間後、抽出物をS SI 3およびS SI 5と摂氏37度でインキュベートし、30分後に等量のサンプルバッファーを添加して反応を停止します。次に、等量のS SI 3標識M1タンパク質とSCI 5標識M2タンパク質の2つの別々の混合物を作成します。次に、IPGストリップを450マイクロリットルの標識混合サンプルで、等電点電気セルシステム上のchaps抽出バッファーに入れ、電流を流さずに24時間再水和します。翌日、300ボルトで3時間フォーカシングを開始し、次に1000ボルトで6時間グラジエントを設定し、続いて2つの8,000ボルトグラジエントをそれぞれ3時間ずつ設定して、平衡緩衝液中でIPGストリップをインキュベートする二次次元電気泳動を行います。10分後、ストリップを12.5%ページのゲルに移し、低融点のarosで密封します。次に、70ボルトの定電圧でedin dsicシステムを使用して、摂氏20度で一晩電気泳動を行い、続いてブロモフェノールブルーフロントがゲルの底に達するまで300ボルトを実行し、ゲルの画像を取得します。それらを差動およびゲル電気泳動イメージャースキャナーの2つの低蛍光ガラスプレートの間に置き、励起発光波長5 32、5 80ナノメートル(3)および6 33 6 70ナノメートル(5)でゲルをスキャンして、100マイクロメートルのピクセルサイズの画像を生成します。適切なソフトウェアで解析し、各画像のスポット体積を計算して正規化し、正規化されたスポット体積をゲルで検出された各スポットの合計値の割合として割り当てます。2つのマクロファージグループ間の正規化されたスポット体積値を比較することにより、マクロファージの各タイプのタンパク質スポット体積の違いを分析し、変化が1.5倍の場合、スポット体積間の差は有意であると考えてください。この実験では。マクロファージの2つのサブタイプであるM1 pro-inflammatory と M two anti-inflammatory の 2D タンパク質パターンは、2D differential によって決定されました。ゲル電気泳動では、使用したシアン色素とは無関係に、M1またはM 2のいずれかで同じパターンのタンパク質が観察されました。興味深いことに、ゲルのバイオインフォマティクス分析により、スポットを含む20の領域が明らかになり、黄色、青、および緑の着色スポットによって視覚化されるように、スポットボリューム間の増加と減少は、正規化されたスポットボリュームの倍率変化が1.5より大きく、P値が0.05未満の場合、有意な差次的発現を有すると考えられていました。このCHEに続いて、定量、質量分析、追加のプロテオミクス分析などの方法を実行して、さまざまな刺激に応答して2つのマクロファージサブセット間でどのタイプのタンパク質が差次的に発現するかなどの追加の質問に答えることができます。

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Research

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