2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

この手順の全体的な目標は、ゲル電気泳動における2D差分により、ヒトの炎症誘発性M1および抗炎症性M 2マクロファージサブセットの表現型を分析することです。これは、最初に一次M1およびM 2マクロファージ培養物から抽出したタンパク質を正弦色素で標識することによって達成されます。第2ステップでは、タンパク質を混合し、再水和によるISOエレクトロフォーカシングをサンプルに行います。

次の 2 次元では、動員された pH グラジエントまたは IPG ストリップを暗所で使用して電気泳動を行い、次にゲル電気泳動スキャナーの差でゲルをスキャンします。最終的に、数値化された画像の分析が行われ、M1とMの2つのマクロファージサブセット間のポリープ消化スポットの違いが検出されます。古典的なトーディゲル電気泳動のような既存の方法の中でこの技術の主な利点は、この技術がより感度が高く、必要なタンパク質がわずか5マイクログラムであることであり、これは人間の患者から得られるサンプルにとって非常に重要です。

手順を実演するのは、博士課程の学生であるMario Bove、私の研究室のOlivia Beza、およびMagac技術者です単球由来マクロファージの初代培養を準備するには、25ミリリットルのBuffyコートを25ミリリットルのPBSに希釈することから始まります。次に、希釈した血液を分離勾配に慎重にロードし、細胞の回転が終了したら、細胞を1600Gおよび室温で20分間遠心分離します。界面層で単球を採取し、続いて、3回目の洗浄後に0.1%EDTAを含むPBSの10ミリリットルで回収した細胞を3回連続して洗浄します。

PBSのみで細胞をもう1回スピンダウンし、次にペレットを血清種子を含まない5ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。35ミリメートル皿中の細胞を、皿ごとに10の10倍の密度で皿6個にし、インキュベーター内で90分間沈殿した後、上清を捨て、付着性単球を1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。次に培養する細胞を、37°Cおよび5%二酸化炭素で6日間、ヒト血清の体積当たり10%の容量を含む新鮮な培地の10ミリリットルで調製する。

次に、抗炎症性のM 2マクロファージを生成するために、培養6日目にIL 4の1ミリリットルあたり15ナノグラムを一部の培養物に添加して、12日目に炎症誘発性マクロファージを生成します。分化したマクロファージの他の培養物をLPSの1ミリリットルあたり100ナノグラムで4時間処理し、2D電気泳動用のマクロファージサブセットを単離します。次に、目的の培養物を25ミリモルトリスで3回洗浄し、次にチャップ抽出バッファーでプレートの底から細胞を放出します。

次に、細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度でひもで紐でつなぎます。5分後、100マイクロリットルのアリコートで細胞をマイナス20°Cの貯蔵に移し、マクロファージサブセットのISOエレクトロフォーカシングのためのタンパク質濃度分析を行います。まず、サンプルを9マイクロリットルのアリコートに調整し、次に37°Cで2ミリモルのTCEPを添加した溶解バッファーで細胞溶液を還元します。

1時間後、抽出物をS SI 3およびS SI 5と摂氏37度でインキュベートし、30分後に等量のサンプルバッファーを添加して反応を停止します。次に、等量のS SI 3標識M1タンパク質とSCI 5標識M2タンパク質の2つの別々の混合物を作成します。次に、IPGストリップを450マイクロリットルの標識混合サンプルで、等電点電気セルシステム上のchaps抽出バッファーに入れ、電流を流さずに24時間再水和します。

翌日、300ボルトで3時間フォーカシングを開始し、次に1000ボルトで6時間グラジエントを設定し、続いて2つの8,000ボルトグラジエントをそれぞれ3時間ずつ設定して、平衡緩衝液中でIPGストリップをインキュベートする二次次元電気泳動を行います。10分後、ストリップを12.5%ページのゲルに移し、低融点のarosで密封します。次に、70ボルトの定電圧でedin dsicシステムを使用して、摂氏20度で一晩電気泳動を行い、続いてブロモフェノールブルーフロントがゲルの底に達するまで300ボルトを実行し、ゲルの画像を取得します。

それらを差動およびゲル電気泳動イメージャースキャナーの2つの低蛍光ガラスプレートの間に置き、励起発光波長5 32、5 80ナノメートル(3)および6 33 6 70ナノメートル(5)でゲルをスキャンして、100マイクロメートルのピクセルサイズの画像を生成します。適切なソフトウェアで解析し、各画像のスポット体積を計算して正規化し、正規化されたスポット体積をゲルで検出された各スポットの合計値の割合として割り当てます。2つのマクロファージグループ間の正規化されたスポット体積値を比較することにより、マクロファージの各タイプのタンパク質スポット体積の違いを分析し、変化が1.5倍の場合、スポット体積間の差は有意であると考えてください。

この実験では。マクロファージの2つのサブタイプであるM1 pro-inflammatory と M two anti-inflammatory の 2D タンパク質パターンは、2D differential によって決定されました。ゲル電気泳動では、使用したシアン色素とは無関係に、M1またはM 2のいずれかで同じパターンのタンパク質が観察されました。

興味深いことに、ゲルのバイオインフォマティクス分析により、スポットを含む20の領域が明らかになり、黄色、青、および緑の着色スポットによって視覚化されるように、スポットボリューム間の増加と減少は、正規化されたスポットボリュームの倍率変化が1.5より大きく、P値が0.05未満の場合、有意な差次的発現を有すると考えられていました。このCHEに続いて、定量、質量分析、追加のプロテオミクス分析などの方法を実行して、さまざまな刺激に応答して2つのマクロファージサブセット間でどのタイプのタンパク質が差次的に発現するかなどの追加の質問に答えることができます。