神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

この手順の全体的な目標は、シナプスのサイズ、断片化、シナプス後膜のタンパク質の相対密度など、シナプスパラメータを客観的に定量化することです。これは、まず実験動物から目的の筋肉を解剖することによって達成されます。次に、解剖した筋肉を凍結切片にし、切片を蛍光顕微鏡用の免疫染色します。

次に、phosでは、さまざまな治療群からの神経筋接合部の画像を客観的にサンプリングし、シナプス特殊化の染色の相対強度を定量化します。最終的に、治療または遺伝子改変が神経筋接合部の構造組織に及ぼす影響の再現性のある定量的測定値は、共焦点顕微鏡法によって得られます。この方法は、重症筋無力症や運動ニューロン疾患などの疾患のマウスモデルにおける神経筋接合部の構造の変化を評価するために、共焦点顕微鏡を用いた標準化された客観的なプロトコルを提供します。

一般に、この方法を試みる人は、偏りのない客観的な方法で共焦点顕微鏡でNPLSをサンプリングするには、NPLSのサンプリング分析を一貫した再現性のある方法で実施する必要があるため、NPLSの動物間の変動がこれを困難にする可能性があるため、難しいと感じるかもしれません。クライオ切片を単離し、免疫蛍光染色を行った後、テキストプロトコルに従って、マウス神経筋接合部またはnjsは、NMJパラメータの定量が完了するまで、第2の研究者のみが知っている乱数で各スライドを標識することにより、スライドを盲検化します。顕微鏡ステージにスライドを置き、トリットCフィルターセットを使用して広視野照明下でスライドを表示します。

フィールドを左から右へ、そして後方に徐々に移動して、共焦点ピンホールを1.0エアリーユニットに設定したエンドプレートがフィールドに現れるまで、低レーザー出力を使用して、イメージングするエンドプレートのtrit C赤色BGTのゲインとオフセットレベルを最適化します。次に、488ナノメートルのレーザーを使用して、シナプトフィジンを表すフィットC蛍光を最適化し、各光学スライス間に0.7ミクロン間隔でエンドプレートのZスタックを収集します。イメージングセッションの日付、スライドのコード名、エンドプレートの番号を含むファイル名で画像を保存します。

スライドまたはサンプルから20枚のエンドプレートが収集されるまで、先ほど示したサンプリングとイメージングの手順を繰り返します。次に、同じ共焦点設定で残りのコード化されたスライドに対してこのプロセスを繰り返します。コントロールスライドからいくつかの画像を撮ります。

画像Jフリーウェアを使用してZackを開き、1つの蛍光チャンネルで最大投影画像を準備します。投影をTIFファイルとして保存し、画像セッションの日付、サンプルコード、エンドプレート番号、蛍光チャネルなどのファイル名を付けます。次に、画像Jを使用してZ投影を開きます。

アセチルコリン受容体またはA CHR画像チャネルを選択し、画像タイプ8ビットを選択して、ポリゴンツールを使用して画面上で24ビットRGBカラー画像を1つの8ビットグレースケール画像に変換します。赤色のBGT染色チャネルで、目的のエンドプレートに由来しない染色を除外して、目的のエンドプレートの周囲に大まかな輪郭を描きます。画像に最小強度のしきい値を適用するには、画像調整しきい値を選択します。

閾値レベルを調整して、A CHR染色部分を分離し、周囲の背景信号をサブ閾値として除外します。次に、比較のために元のフルトーン画像で2番目のウィンドウを開きます。ポリゴンのアウトラインが残っている状態でしきい値の設定を確認するには、ポップアップメニューで[分析]、[パーティクルの分析]を選択します。

ピクセル数のサイズの範囲を 50 から無限大に指定し、電気ノイズから生じる小さなアーティファクトの選択を排除します。フォトマルチプライヤーで、粒子の解析をクリックすると、離散的なスープラ閾値領域のリストと、バイナリ画像に表示される蛍光強度値に番号が付けられたウィンドウが生成されます。このデータをラベル付きスプレッドシートにコピーして、エンドプレートの総面積を測定します。

多角形内で [測定の分析] を選択し、A CHR の面積と強度のデータをコピーして、列にラベルが付けられたスプレッドシートに貼り付けます。シナプトフィジンチャネルに切り替えます。最大の投影画像を準備します。

対象領域を選択し、示したように最小強度の閾値を設定します。オーバーラップの領域を測定するには、次の手順に従います。2 つのチャンネル画像を含む元のファイルを開き、画像スタックを選択します。

画像にスタックして、2 つの別々の画像に分割します。image J colocalization プラグインを使用して、プラグインの共ローカリゼーションを選択し、A CHR チャネルと神経チャネルに対して以前に記録したしきい値をそれぞれのチャネル クエリ ボックスに入力します。その結果、白いピクセルで画像が重なり合います。

新しく作成したオーバーラップ画像をグレースケール形式に変換し、最大値にしきい値を適用すると、前の2つのチャンネルのオーバーラップ領域に対応する白いピクセルのみが選択されます。コローカライゼーションの結果の面積値(ピクセル単位のオーバーラップ領域を表す)をスプレッドシートに記録し、データのスプレッドシートを準備します。サンプル平均は、標準偏差と標準誤差を計算し、ヒストグラムまたは散布図としてプロットします。

A CHR領域を散布図または度数ヒストグラムとしてプロットおよびプレート化し、統計的検定の前にデータが正規分布しているかどうかを判断します。テキストプロトコルに概説されているように、横筋線維切片の免疫蛍光染色およびイメージングを準備した後、元の画像ファイルを開き、A CHRチャネルを表示しながら、チャネルを分割する画像スタック画像を選択し、画像タイプ8ビットを選択して8ビットグレースケール形式を画面に変換します。これを両方の蛍光チャンネルに対して行います。

Select image stacks images to stacksは、以前に分離された2つの8ビット画像から新しいスタックを開き、ポリゴンツールを使用して1つのウィンドウ内で2つの蛍光チャネルを切り替えることができます。A CHR染色の境界の周りにしっかりと線を引き、分析測定を選択して、囲まれた領域内のA CHRの平均強度を測定します。この値をラベル付きスプレッドシートにコピーし、ポリゴンのアウトラインを保持します。

2 番目の蛍光チャンネルに切り替えて、分析メジャーを選択します。これにより、A CHR染色によって定義されるシナプス領域内の目的のタンパク質の平均染色が得られます。目に見えるエンドプレートの汚れから離れた領域を選択します。

次に、[measure の分析] を選択して、平均バックグラウンド蛍光強度を測定します。他の蛍光チャンネルについても測定を繰り返し、バックグラウンド値を蛍光値のスプレッドシートにコピーします。エンドプレートの値から平均バックグラウンド値を差し引いて、各エンドプレートのA CHRと対象タンパク質の補正強度を求めます。

最後に、目的のタンパク質の補正されたnplate強度値を補正されたBGT蛍光強度で割って、ここに示すように蛍光強度比を求めます。A CHRとシナプトフィジンの蛍光強度は、モーターエンドプレートのPERSシナプス部分とシナプス部分の境界で急激に上昇します。このような画像の場合、最小閾値は、エンドプレートのA CHRに富む領域またはシナプトフィジンに富む領域を容易に分離する。

この図で老齢マウスや一部の疾患状態で示されているように、シナプトフィジンの終板染色はそれほど強くない可能性があります。CHRクラスターのエッジはぼやけて見える場合があり、余分なシナプス自家蛍光散布図のより高いレベルが存在する可能性があり、個々のマウスの脛骨前筋の末端板間のA CHRが豊富な領域にかなりの範囲が明らかになります。それにもかかわらず、顔端板画像上の15〜20に基づく平均A CHR面積は、7つのサンプルマウス間で類似していた 横断断面では、終板achrは通常、三日月形として現れるが、この形状は、ここに示すようにしばしば不規則である。

ここでシナプトフィジンチャネルに示されているような低強度のバックグラウンド蛍光は、通常、A CHR染色のパッチが単一のエンドプレートを表しているのか、隣接する筋線維上にある2つの別々のエンドプレートを表しているのかを明らかにします。さらに、rapson、musk、β disro glycanなどの多くのシナプスタンパク質は、nplateでCHRと共局在しています。この手順を試みる間、実験者はnplate画像のサンプリングと分析中に治療と遺伝子型グループに盲目であることが重要です。

このビデオを見れば、神経筋接合部の共焦点蛍光画像の収集、サンプリング、分析の方法について十分に理解できるはずです。最終的に、研究者は、さまざまな治療グループや遺伝子型間でnplateのさまざまな構造パラメーターを一貫して客観的に比較できる必要があります。