Name: 神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶ神経筋接合部の構造変化を共焦点蛍光顕微鏡で定量的に評価する方法。シナプスサイズ、断片化、タンパク質密度を客観的に測定し、神経筋疾患のメカニズム解明に貢献します。

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この作業は、National Health and Medical Research Council [570930]によって支援されました。イメージングは、ボッシュ研究所の高度顕微鏡施設で実施しました。研究が引用されている研究室の元メンバーは、これらの方法の開発に貢献したことに感謝されています。

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明するプロトコルは、確実に測定し、正常な老化と疾病状態を含む条件の範囲にわたって、NMJの特性の変化を定量化するために私たちを有効にしている。顔NMJ画像専用のために記載された方法は、研究者が前と後シナプスの専門分野の面積とシナプス重なり/位置合わせの面積を比較することができるようになります。前およびシナプス後のタンパク質の相対的強度を比較するために横方向の光学切片を使用する第2のプロトコルは、好ましい。第三のプロトコルは、具体的にはシナプス後膜における性AChRのパッキングの近接の変化をテストします。 特異コントロールは、免疫蛍光顕微鏡で不可欠です。間接的免疫蛍光のために、任意の一次抗体を使用する場合は、最初に、筋肉切片におけるその標的タンパク質に特異的に結合することを保証する必要がある。組織処理および固定異なる種類の差次の特異性を変化させることができる抗体。それは本当に運動終板でのAChRに集中している（たとえばのrapsyn用）その免疫蛍光染色を確認することが重要です。陰性対照セクションはまた、抗体結合が特異的であることを確実にするために検査する必要があります。 <s...

神経筋接合部（NMJ）は、神経系および骨格筋との間の通信を仲介する重要な中継シナプスである。これは、すべての自発的な運動のために必要とされる。蛍光顕微鏡は、長いNMJ 1-3マウスの導入遺伝子の影響を研究するために、またはげっ歯類のNMJ 4-11時の年齢、食事、運動、および疾患の影響を比較するために使用されてきた。このような研究は私たちにNMJの生理学および病態生理学について多くを教えてきましたが、（ 例えば、AChRのエリア、終板面積、周囲長、断片化指数）が報告多様なパラメータは、しばしば、それが難しいこれらの研究の調査結果を比較することにする。前臨床研究者が特に疾患12の齧歯類モデルを用いた研究では、再現性を発揮できるようにするための増加期待があります。ここで説明するプロトコルは、発達生理学的および病態生理学的CHを調査の一連の研究を通して洗練されたNMJにアンジェス。このような研究は、マウスの運動終板と後シナプスの専門分野13-15内のシナプスタンパク質のパッキングの相対密度でシナプスの専門分野の面積の測定を必要とする。 これらの方法の有用性は、重症筋無力症、抗MuSKのマウスモデルにおける最近の研究によって示されている。抗MuSKの陽性重症筋からのIgGの毎日の注射は成体マウスに、患者は彼らが2週間以内に16弱になった原因無力。 （神経端末で）シナプトフィジンのための二重標識された筋肉切片の共焦点最大投影画像とシナプス後性AChRは、一次変化としてのAChR染色の分野で進行性の低下を明らかにした。重要なことには減少率は、同等のシナプス電位の振幅の減少、シナプス伝達の障害及び筋衰弱17,18を説明するのに十分であった。定性的に類似の所見は他の研究グループにより報告された10,19。同じNMJ測定方法ので、このマウスモデル20,21に無力抗MuSKの重症筋を治療するための3種の薬物の影響を評価するために使用されている。 座りがちな高齢化は、神経筋の​​接続の損失につながることができます。マウスは古い時代に進行としてここに記載されているプロトコルは、モータのエンドプレートでの神経終末シナプトフィジンのエリアの加齢に伴う減少を明らかにした。同じ方法は、自発的な運動は、主に他のグループ4による以前の研究と一致して、シナプス前神経末端領域22の低下を防ぐことができることを明らかにした。神経接続の損失はまた、筋萎縮性側索硬化症9,23のSOD1G93Aマウスモデルにおいて発生する。 上記の研究では、健康状態の様々なNMJでの前または後シナプスの専門分野のいずれかの面積の削減につながる可能性があることを示している。これは損なわれ、シナプス楽しいことがありctionまたは神経筋の接続の完全な喪失を告げることがあります。 3つのプロトコルは、シナプスの専門分野の面積と密度の定量化を可能にすることが記載されている。第一のプロトコルの目的は、蛍光顕微鏡を用いて、シナプス前および後の専門および哺乳類のNMJでのその配列の領域の実用的かつ再現可能な測定を提供することにある。二次元の最大投影共焦点画像およびNIH ImageJを用いて画像解析をシナプトフィジン染色（シナプス小胞）、シナプス後性AChRおよびシナプス重なり領域の面積の変化を検出するために使用される。シナプスの専門分野を識別するために使用される視覚情報が最大となるように共焦点撮像パラメータ（ゲイン、オフセット·レベル）は、各NMJのために最適化される。神経筋障害はまた、シナプス後のAChRおよび/または他のシナプスタンパク質の密度の変化に起因することができます。第二のプロトコルは、シナプス後のタンパク質の相対密度の変化を検出するために適用することができるムスク、rapsyn、ジストログリカン、リン酸化されたSrcキナーゼおよびリン酸化のAChR 18,21-として。 重症筋無力症では、シナプス後膜内のAChRの減少密度は、シナプス障害や筋力低下の直接の原因である。第三のプロトコルは、シナプス後膜14,15内の隣接性AChRの近接性の変化を評価するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法が記載されている。この方法は、蛍光αブンガロトキシン（BGT）で標識された隣接性AChRの間のエネルギー移動を検出する。 FRETは、蛍光ドナーとアクセプタープローブが離れて10nm未満である場合にのみ発生します。これは、直接シナプス電位の振幅に関連することができるのAChRパッキングの気密性で（超顕微鏡）の変化を明らかにすることができます。 過去10年間で洗練されたこれらの3つのプロトコルは、一貫して再現可能な方法で、NMJ整合性の補完的な対策を提供する。標準化されたプロトコルを使用してA番目のパラメータは、哺乳類のNMJの際の遺伝子と環境介入の効果の比較を容易にするはずである。

<table><tbody><tr><td>走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM 2000 &nbsp;TCS SP2システム</td><td>ほとんどの走査型共焦点顕微鏡が適しているはずです。&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>ツァイス</td><td>LSM 510 メタ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ライカ</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-ブンガロトキシン (赤-BGT)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>B35451</td><td>AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-バンガロトキシン (遠赤-BGT)</td><td>の</td>ラベリングに使用 <td>ライフサイエンス B35450</td><td>遠赤色蛍光:接眼レンズを通してかろうじて見える&nbsp;</td></tr><tr><td>ウサギ抗シナプトフィジン</td><td>ライフサイエンス技術</td><td>18-0130</td><td>一次抗体の異なるバッチは、有効な作業希釈が異なる</td></tr><tr><td>FITC-抗ラプシンmab1234</td><td>ミリポア</td><td>FCMAB134F</td><td>FITCに結合したモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>FITC-ロバ抗ウサギ IgG</td><td>ジャクソン</td><td>711-095-152</td><td>ポリクローナル二次抗体は、ソースとバッチ</td></tr><tr><td>によって品質が異なる場合があります最適切削温度コンパウンド(OTC)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>凍結用クライオスタット埋め込みマトリックス&nbsp; 筋肉</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>蛍光色素の光退色を遅らせる封入剤</td></tr></tbody></table>

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部（NMJ）は、哺乳動物、運動ニューロンは、自発的な筋収縮を制御を通じて大、コリン作動性シナプスのリレーです。 NMJでの構造変化は、弱さ、萎縮と筋線維の死で、その結果、神経伝達障害が発生することができます。多くの研究は、遺伝子改変または疾患マウスNMJの構造を変化させることができる方法を検討した。残念ながら、それは直接、彼らはしばしば、異なるパラメータおよび分析方法を採用しているため、これらの研究からの知見を比較することは困難であることができる。 3つのプロトコルは、ここで説明されている。最初は、アセチルコリン受容体（AChRの）の面積を測定するために最大値投影共焦点画像を使用して終板とその上のシナプス前神経終末におけるシナプス小胞の染色の領域におけるリッチシナプス後膜ドメイン。第二のプロトコルは、シナプス後膜におけるシナプス蛋白質の免疫染色の相対強度を比較します。第三のPRotocolはエンドプレートでのシナプス後性AChRのパッキングの変化を検出するために蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を使用します。プロトコルが開発され、一連の研究の上に洗練されてきた。品質と結果の一貫性に影響を与える要因を議論すると基準データは健康な若い成体マウスのNMJで提供される。

NMJでのシナプス面積の測定 エリアの任意の推定値は、シナプスの専門分野の範囲を定義するために、境界の描画に依存している。健康な若い成人の筋肉のNMJの画像がのAChRとシナプトフィジン染色（ 図2AおよびB）の両方のために明確に定義された境界線を表示する必要があります。 AChRの及びシナプトフィジンの両方の蛍光強度は、運動終板（ 図5A '及びB'）のペリシナプスシナプス部分との境界で急激に上昇する。そのようなイメージの場合（単にシナプスバックグラウンド蛍光以上）最小しきい値は、容易にエンドプレート（（ 図5（a） 'とB'）の水平の破線）のAChRの豊富なまたはシナプトフィジンが豊富なエリアを隔離します。老化マウスでは、いくつかの疾患状態でのAChRのための終板染色はあまり強くすることができる、のAChRクラスターエッジがぼやけて表示されて...

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス不全に至ることもあるさまざまな条件で変化します。本稿では、このような構造変化を定量化するための蛍光顕微鏡法について述べる。

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

この手順の全体的な目標は、シナプスのサイズ、断片化、シナプス後膜のタンパク質の相対密度など、シナプスパラメータを客観的に定量化することです。これは、まず実験動物から目的の筋肉を解剖することによって達成されます。次に、解剖した筋肉を凍結切片にし、切片を蛍光顕微鏡用の免疫染色します。次に、phosでは、さまざまな治療群からの神経筋接合部の画像を客観的にサンプリングし、シナプス特殊化の染色の相対強度を定量化します。最終的に、治療または遺伝子改変が神経筋接合部の構造組織に及ぼす影響の再現性のある定量的測定値は、共焦点顕微鏡法によって得られます。この方法は、重症筋無力症や運動ニューロン疾患などの疾患のマウスモデルにおける神経筋接合部の構造の変化を評価するために、共焦点顕微鏡を用いた標準化された客観的なプロトコルを提供します。一般に、この方法を試みる人は、偏りのない客観的な方法で共焦点顕微鏡でNPLSをサンプリングするには、NPLSのサンプリング分析を一貫した再現性のある方法で実施する必要があるため、NPLSの動物間の変動がこれを困難にする可能性があるため、難しいと感じるかもしれません。クライオ切片を単離し、免疫蛍光染色を行った後、テキストプロトコルに従って、マウス神経筋接合部またはnjsは、NMJパラメータの定量が完了するまで、第2の研究者のみが知っている乱数で各スライドを標識することにより、スライドを盲検化します。顕微鏡ステージにスライドを置き、トリットCフィルターセットを使用して広視野照明下でスライドを表示します。フィールドを左から右へ、そして後方に徐々に移動して、共焦点ピンホールを1.0エアリーユニットに設定したエンドプレートがフィールドに現れるまで、低レーザー出力を使用して、イメージングするエンドプレートのtrit C赤色BGTのゲインとオフセットレベルを最適化します。次に、488ナノメートルのレーザーを使用して、シナプトフィジンを表すフィットC蛍光を最適化し、各光学スライス間に0.7ミクロン間隔でエンドプレートのZスタックを収集します。イメージングセッションの日付、スライドのコード名、エンドプレートの番号を含むファイル名で画像を保存します。スライドまたはサンプルから20枚のエンドプレートが収集されるまで、先ほど示したサンプリングとイメージングの手順を繰り返します。次に、同じ共焦点設定で残りのコード化されたスライドに対してこのプロセスを繰り返します。コントロールスライドからいくつかの画像を撮ります。画像Jフリーウェアを使用してZackを開き、1つの蛍光チャンネルで最大投影画像を準備します。投影をTIFファイルとして保存し、画像セッションの日付、サンプルコード、エンドプレート番号、蛍光チャネルなどのファイル名を付けます。次に、画像Jを使用してZ投影を開きます。アセチルコリン受容体またはA CHR画像チャネルを選択し、画像タイプ8ビットを選択して、ポリゴンツールを使用して画面上で24ビットRGBカラー画像を1つの8ビットグレースケール画像に変換します。赤色のBGT染色チャネルで、目的のエンドプレートに由来しない染色を除外して、目的のエンドプレートの周囲に大まかな輪郭を描きます。画像に最小強度のしきい値を適用するには、画像調整しきい値を選択します。閾値レベルを調整して、A CHR染色部分を分離し、周囲の背景信号をサブ閾値として除外します。次に、比較のために元のフルトーン画像で2番目のウィンドウを開きます。ポリゴンのアウトラインが残っている状態でしきい値の設定を確認するには、ポップアップメニューで[分析]、[パーティクルの分析]を選択します。ピクセル数のサイズの範囲を 50 から無限大に指定し、電気ノイズから生じる小さなアーティファクトの選択を排除します。フォトマルチプライヤーで、粒子の解析をクリックすると、離散的なスープラ閾値領域のリストと、バイナリ画像に表示される蛍光強度値に番号が付けられたウィンドウが生成されます。このデータをラベル付きスプレッドシートにコピーして、エンドプレートの総面積を測定します。多角形内で [測定の分析] を選択し、A CHR の面積と強度のデータをコピーして、列にラベルが付けられたスプレッドシートに貼り付けます。シナプトフィジンチャネルに切り替えます。最大の投影画像を準備します。対象領域を選択し、示したように最小強度の閾値を設定します。オーバーラップの領域を測定するには、次の手順に従います。2 つのチャンネル画像を含む元のファイルを開き、画像スタックを選択します。画像にスタックして、2 つの別々の画像に分割します。image J colocalization プラグインを使用して、プラグインの共ローカリゼーションを選択し、A CHR チャネルと神経チャネルに対して以前に記録したしきい値をそれぞれのチャネル クエリ ボックスに入力します。その結果、白いピクセルで画像が重なり合います。新しく作成したオーバーラップ画像をグレースケール形式に変換し、最大値にしきい値を適用すると、前の2つのチャンネルのオーバーラップ領域に対応する白いピクセルのみが選択されます。コローカライゼーションの結果の面積値(ピクセル単位のオーバーラップ領域を表す)をスプレッドシートに記録し、データのスプレッドシートを準備します。サンプル平均は、標準偏差と標準誤差を計算し、ヒストグラムまたは散布図としてプロットします。A CHR領域を散布図または度数ヒストグラムとしてプロットおよびプレート化し、統計的検定の前にデータが正規分布しているかどうかを判断します。テキストプロトコルに概説されているように、横筋線維切片の免疫蛍光染色およびイメージングを準備した後、元の画像ファイルを開き、A CHRチャネルを表示しながら、チャネルを分割する画像スタック画像を選択し、画像タイプ8ビットを選択して8ビットグレースケール形式を画面に変換します。これを両方の蛍光チャンネルに対して行います。Select image stacks images to stacksは、以前に分離された2つの8ビット画像から新しいスタックを開き、ポリゴンツールを使用して1つのウィンドウ内で2つの蛍光チャネルを切り替えることができます。A CHR染色の境界の周りにしっかりと線を引き、分析測定を選択して、囲まれた領域内のA CHRの平均強度を測定します。この値をラベル付きスプレッドシートにコピーし、ポリゴンのアウトラインを保持します。2 番目の蛍光チャンネルに切り替えて、分析メジャーを選択します。これにより、A CHR染色によって定義されるシナプス領域内の目的のタンパク質の平均染色が得られます。目に見えるエンドプレートの汚れから離れた領域を選択します。次に、[measure の分析] を選択して、平均バックグラウンド蛍光強度を測定します。他の蛍光チャンネルについても測定を繰り返し、バックグラウンド値を蛍光値のスプレッドシートにコピーします。エンドプレートの値から平均バックグラウンド値を差し引いて、各エンドプレートのA CHRと対象タンパク質の補正強度を求めます。最後に、目的のタンパク質の補正されたnplate強度値を補正されたBGT蛍光強度で割って、ここに示すように蛍光強度比を求めます。A CHRとシナプトフィジンの蛍光強度は、モーターエンドプレートのPERSシナプス部分とシナプス部分の境界で急激に上昇します。このような画像の場合、最小閾値は、エンドプレートのA CHRに富む領域またはシナプトフィジンに富む領域を容易に分離する。この図で老齢マウスや一部の疾患状態で示されているように、シナプトフィジンの終板染色はそれほど強くない可能性があります。CHRクラスターのエッジはぼやけて見える場合があり、余分なシナプス自家蛍光散布図のより高いレベルが存在する可能性があり、個々のマウスの脛骨前筋の末端板間のA CHRが豊富な領域にかなりの範囲が明らかになります。それにもかかわらず、顔端板画像上の15〜20に基づく平均A CHR面積は、7つのサンプルマウス間で類似していた 横断断面では、終板achrは通常、三日月形として現れるが、この形状は、ここに示すようにしばしば不規則である。ここでシナプトフィジンチャネルに示されているような低強度のバックグラウンド蛍光は、通常、A CHR染色のパッチが単一のエンドプレートを表しているのか、隣接する筋線維上にある2つの別々のエンドプレートを表しているのかを明らかにします。さらに、rapson、musk、β disro glycanなどの多くのシナプスタンパク質は、nplateでCHRと共局在しています。この手順を試みる間、実験者はnplate画像のサンプリングと分析中に治療と遺伝子型グループに盲目であることが重要です。このビデオを見れば、神経筋接合部の共焦点蛍光画像の収集、サンプリング、分析の方法について十分に理解できるはずです。最終的に、研究者は、さまざまな治療グループや遺伝子型間でnplateのさまざまな構造パラメーターを一貫して客観的に比較できる必要があります。

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出典: Marinello, M., et al.共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組合せによるマウスの神経筋接合部の特性評価J. Vis.

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学ぶ神経筋接合部の構造変化を共焦点蛍光顕微鏡で定量的に評価する方法。シナプスサイズ、断片化、タンパク質密度を客観的に測定し、神経筋疾患のメカニズム解明に貢献します。

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