酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法インビトロ

次の手順の全体的な目標は、in vitro で酸化ストレスに対する赤色近赤外光療法の範囲と強度の影響を評価することです。そのために、私たちは、光を届ける新しい方法を開発し、送達される波長と強度を操作しました。金属ベースのハウジングにキセノン光源または広帯域光源を取り付け、光の前にコーティングレンズ、水フィルター、および入口開口部を配置します。

手順の次のステップは、広帯域光源から生成された光を入口、絞り、および液体光ガイドを通って、そして第2のコーティングレンズを通して導くことです。次に、帯域幅フィルターと減光フィルターを取り付けて、光の所望の波長と強度を取得します。フィルターは、波長帯と呼ばれる狭い範囲の波長を通過できることに注意してください。

この技術の主な利点は、LEDやレーザーなどの既存の赤色近赤外光線療法の方法と比較して、波長と強度のパラメータに対して正確で較正された操作を可能にすることです。これにより、現在の研究が解離細胞に投与するような最良の生物学的結果を得るために、光の送達を最適化することができます。さらに、それはまた、器官型、神経外傷のモデルなどの他のシステムにも適用することができます。

Brightブロードバンド光源を使用する場合は、光源を直接見ないようにしてください。これにより、視覚的な損傷が永久的に発生する可能性があるためです。光送達装置を準備するには、キセノンランプやタングステンランプなどの広帯域光源を適切な電源に接続します。光源の前にコレーティングレンズを配置して、コレーテッドビームを生成します。

光を液体ヒートフィルターに通して、光線からほとんどの熱を取り除きます。光源の前にコレーティングレンズを配置して、コレーテッドビームの光を生成します。光を液体ヒートフィルターに通して、光線からほとんどの熱を取り除きます。

用途に応じて、照合されたビームを液体ライトガイドの入口に集束させ、より柔軟な光の伝送を提供します。リキッドライトガイドのもう一方の端には、2つ目のコーティングレンズを配置し、次に干渉フィルターと減光フィルター用のホルダーを配置します。この配置は、所望の波長帯および強度の光の均一に照らされたスポットを生成するべきである。

ライトガイドの端と試料面の間の距離は、照らす必要がある領域によって異なる場合があります。逆二乗の法則に従って、ライトガイドの端からの距離が長くなると、本研究では光強度が減少することを覚えておくことが重要です。この距離は14cmで、96ウェル組織培養プレート上の3×3ウェル領域を均一に照らすビーム断面が生成されます。

ランプや関連する光学部品からの迷光が、黒い段ボールなどを使用して他の試料に到達しないようにします。デバイスが構築されたら、液体ヒートフィルターのウォータークーラーをオンにし、フィルタージャケットを介して水が交換されることを確認します。ランプの電源をオンにし、ブロードバンド光源を5分以上待ちます。

安定させるには、狭帯域干渉フィルターを選択して、目的の照明の波長帯を生成します。試料が配置される平面でランプによって生成される光を測定します。治療中。

光は、適切なスペクトルに接続された較正された放射照度プローブを使用して測定されます。放射 計。NDフィルターを使用して、目的の出力が得られるまで光の強度を調整します。本研究では、各干渉フィルターを通過する光の強度を調整して、4つの処理波帯のそれぞれで等しい品質の出力を提供します。

記載されている赤色近赤外光線療法の送達方法は、任意の細胞タイプまたはin vitroモデルシステムに適用できる。ここでは、褐色細胞腫またはPC12細胞を使用して細胞に光を送達する技術を示します。一例として、増殖培地で細胞を培養します。

96では、ウェルトレイをポリオールリジンでコーティングし、70〜80%のコンフルエントになるまで塗布します。グルタミン酸または代替ストレッサーを完全増殖培地で所望の濃度で調製します。ここでは10ミリモルのグルタミン酸を使用しています。

細胞から培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水で3回穏やかに洗浄します。洗浄後、グルタミン酸含有培地をウェルあたり合計100マイクロリットルまで加えます。グルタミン酸または選択のストレッサーを添加した直後に、調製した光送達装置の下に培養プレートを置くことにより、細胞を所望の波長および強度での光処理にさらす。

光ビームのクォイル出力は、確立された減光フィルターの組み合わせを使用して変更してください。投与される波長によって異なります。光処理終了後、細胞を平らな面に置き、二酸化炭素調節条件で摂氏37度で24時間インキュベートします。

赤色近赤外光線療法の追加用量も投与できます。.最終ラウンドの光処理を行う前に、酸化ストレスの指標となる活性酸素種の検出に使用する試薬を準備します。ここでは、dilu、フルオレセインDアセテートなどのさまざまな反応種と反応すると蛍光を発する指示食を使用し、ステップ4で説明したように細胞に光処理を施し、細胞が目的のインフルエンザと光の波長で治療されていることを確認します。

光処理の直後に、グルタミン酸含有培地を取り除き、PBSで2回洗浄します。メーカーの指示に従って、反応種と反応すると蛍光を発するインジケーター色素を使用してアッセイを進めてください。適切な励起および発光設定に設定されたプレートリーダーを使用して、インジケーター色素によって生成される蛍光を測定します。

メートル法キットの色を使用して、製造元の指示に従ってウェル内のタンパク質濃度を定量化します。各ウェルのタンパク質濃度に対する蛍光出力を発現し、Statistical ソフトウェアを使用して結果を解析します。この技術の開発は、酸化ストレスに対する赤色近赤外光療法の複数の波長と強度の影響を調査する研究者への道を開くものです。

この技術は、解離細胞または器官型培養を含む一連のモデルシステムで使用できます。