スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

このプロセスの全体的な目標は、制御された栄養条件下で多数の細胞を培養することです。細胞培養ラボにある従来の装置を使用。関連するアルゴリズムにより、実験範囲内の栄養素の制御と操作が可能になります。

この方法は、大規模な細胞培養アプリケーションにおける重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、ヒト細胞療法など。この技術の主な利点は、栄養素とガスが均一に分布した大規模な細胞の施設培養です。

これにより、静的またはバルク供給の細胞培養よりも高い細胞密度が可能になり、収量が増加し、細胞損失が減少します。これは、ほとんどの細胞培養ラボで一般的に見られる機器を使用して行うことができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、無菌条件下で特定の順序で事前に実行する必要がある多数のステップのために、使用されるこれらの技術を習得するのが難しい場合があるため、新しい研究者に役立つ可能性があります。

給餌システムに必要な5つの主要コンポーネントを収集します。中型リザーバー、ペリスタルティックポンプ、攪拌バイオリアクター、廃棄物リザーバー、カスタム設計のチューブサンプリングセット。1リットルのガラス瓶を使用して中程度の貯水池を確立します。

廃棄物貯留層は2リットルのガラス瓶を使用しています。250mL容量のガラス反応器を使用して攪拌したバイオリアクター。デジタル蠕動ポンプ、または8チャンネルポンプヘッドを備えた同様のポンプを使用して、媒体交換を制御します。

リザーバーと改質バイオリアクターの蓋を硬質でオートクレーブ可能なプラスチックで組み立てます。ステンレス製パイプのパススルーポートにより、滅菌フィルターによる換気を行い、リザーバーとバイオリアクター間の媒体移動を可能にします。多孔質ガラス曝気チューブから製造されたアウトフローチューブを、改質された攪拌懸濁液バイオリアクターの蓋に取り付けます。

ポリフッ化ビニリデン製チューブコネクターと耐久性に優れたチューブチューブから、オートクレーブ可能な灌流チューブセットを組み立てます。セクションの長さは、異なるコンポーネント間の距離によって異なります。2つのチューブ直径を使用してフィードラインを組み立てます。

L/S 14 は、バイオリアクターから培地リザーバーまでの距離にまたがる一次チューブに使用します。適切なPVDFアダプターを使用して、ポンプセクションのチューブ長の中央にL / S 13チューブのソート長を挿入します。標準のPVDFホースバーブチューブアダプターを使用して、短いポンプセクションチューブの両側にある2つのL/S 14チューブを結合します。

大径のL/S 16チューブを使用して廃棄物除去用のセクションチューブセクションを組み立て、ポンピングセクションの中央にL/S 14チューブの短いセクションを挿入します。これは、PVDFホースバーブアダプターを使用したフィードラインの組み立てと同じ方法で行われます。チューブセットの最終コンポーネントを組み立てるには、3つの短いL/S 14チューブの長さからセットを構築します。

T型HVDFコネクタと、2つのチューブ長に2つの小さなホースクランプで接続されています。サンプルアセンブリをバイオリアクターの蓋に取り付けられたステンレス鋼のサンプルコネクタに接続します。滅菌後、クランプされた長さの1つにガスを通気するための滅菌ガスフィルターが取り付けられます。

もう1つは、滅菌サンプリングシリンジへの接続に使用されます。サンプリングアセンブリをバイオリアクターに接続した状態でオートクレーブ処理を行い、テキストプロトコルに記載されている実験を開始します。このアセンブリを使用して、必要に応じてバイオリアクターから無菌サンプルを収集し、連続供給プロセスを妨害することはありません。

スピナーフラスコ、中型容器、廃棄物容器、およびサンプルポートの蓋の適切な位置に滅菌ベントを取り付けます。テキストプロトコルに記載されているように細胞を培養し、回収します。細胞をバイオセーフティキャビネット内でトリプシンの室温で2〜3分間インキュベートし、その後、細胞を円錐形のチューブに集めます。

次に、スモールセルサンプルを採取し、トリパンブルーで染色します。顕微鏡と標準血球計算盤を使用して、テキストプロトコルに記載されているようにトリパンブルー染色を行い、細胞密度をカウントします。各条件について、必要な数の総細胞を滅菌攪拌懸濁液バイオリアクターに添加します。

ピペットを使用して攪拌した懸濁液バイオリアクターに培地を加え、所望の総培養量に到達します。細胞を撹拌した懸濁液バイオリアクターを細胞培養インキュベーター内の攪拌板に移します。バイオリアクター内で細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度100%、撹拌速度70rpmで3日間培養し、スフェロイドを形成させます。

スフェロイド形成後、攪拌した懸濁液バイオリアクターをインキュベーターから取り出します。連続供給システムのコンポーネントを生物学的安全キャビネットに組み立てます。まず、新鮮な培地リザーバーに目的の培地を充填し、次に供給ラインの片側に接続します。

また、新鮮な培地リザーバーが滅菌フィルターで適切に換気されていることを確認してください。バイオリアクターの入口ポートに滅菌フィルターを交換して、培地がバイオリアクターに入る前に培地をろ過する必要があります。廃棄物ラインを中程度の廃棄物リザーバーに接続し、廃棄物リザーバーが滅菌フィルターで適切に換気されていることを確認します。

攪拌した懸濁液バイオリアクターをインキュベーター内部の攪拌板に、スフェロイド形成と同じ培養パラメータを用いて置きます。新鮮な中型のリザーバーを近くのミニ冷蔵庫に入れます。供給ラインがドアが閉まるのを妨げずに冷蔵庫から出ることができることを確認してください。

また、供給ラインが冷蔵庫やインキュベーターのドアに挟まれて閉じられていないことも重要です。廃液リザーバーは、インキュベーターの外側のベンチトップの便利な場所に置くことができます。残りのチューブの端をインキュベーターに通し、供給ラインをバイオリアクターの入口ポートのフィルターに接続します。

次に、廃棄物ラインを流出管ポートに接続します。次に、供給ラインが新鮮な媒体リザーバーから攪拌された懸濁液バイオリアクターに媒体を送り込み、廃棄物ラインがバイオリアクターから廃棄物媒体リザーバーに媒体を送り込むように、適切な向きを確保し、供給ラインのポンプセクションをポンプヘッドに配置します。テキストプロトコルで説明されているように、調整された送り速度の式を使用して送り速度を計算します。

細胞数情報を含む最新のサンプルを、成長率予測および培地グルコース測定値とともに使用して、培養物中の所望のグルコース濃度を維持するために必要な供給速度を推定します。計算された送り速度に基づいてポンプ速度を設定します。送り速度の計算を繰り返し、各サンプリングポイントのポンプ速度を調整します。

Β-TC6インスリノーマスフェロイド培養物から、静的撹拌懸濁バイオリアクターを使用した培養物、および連続的に供給された攪拌懸濁バイオリアクター培養法による中グルコース測定値が示されています。標準的な高グルコース培地で給餌します。連続給餌はグルコースの変動を排除することができますが、培地の平均グルコースレベルは培養期間中に劇的に変化し、生理学的範囲をはるかに上回っています。

調整された給餌は、変動を排除するだけでなく、培養期間中、グルコース濃度を生理学的レベル近くに維持することができます。ここでは、21日間の培養期間中の細胞数の倍数変化として報告された細胞増殖を、定期的な培地交換を伴う攪拌懸濁バイオリアクター、一定の供給速度の攪拌懸濁バイオリアクター培養、および調整された供給速度の攪拌懸濁バイオリアクター培養物と比較します。この手順に従うと、新しい細胞株の栄養要件や特定の実験結果などの追加の質問に答えるために、さまざまな条件などの他の方法が事前に実行されます。

開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者が、がんやその他の疾患を持つヒトの細胞の代謝要件を調査する道を開きました。このビデオを見れば、培養条件をより適切に制御し、細胞収量を最大化するためのプロフュージョン細胞培養システムの組み立て方法について十分に理解できるはずです。人間の細胞を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、血液媒介病原体からの保護などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。