迅速な分別とコミュニティベースの設定から得られた試​​料中の全血液成分の単離

この手順の全体的な目標は、迅速な眼のスループット、全血サンプルの同時処理を可能にする合理化されたプロトコルを提供することです。非臨床現場では、バキュテイナープロセッシングがオーバーラップ方式で行われ、D-N-A-R-N-A末梢血単核細胞またはpbmc血清の高品質な画分と血漿および赤血球の残留画分を効率的に分離することができます。処理は、血清バキュテナーの遠心分離、フィアルチューブのDNA単離遠心のための1つのフィアル含有バキュテナーからのアリコートの除去から始まります。

その後、K2 EDTAバキュテナーからのDNA単離後のDNA単離の完了が起こり得る。各バキュテナーからの血液は、それぞれのフィルターを通過し、PBSで洗浄された後、RNA安定化剤で処理され、フィアル含有バキュテイナーに戻ります。残留プラズマを引き出し、単核層をPBSで洗浄します。

チューブが回転している間に、残留した赤血球が収集され、分離された血清が分注されます。最後に、pbmcは細胞凍結培地に保存されます。最終的に、新鮮な血液の高品質な画分を採取から2時間以内に作製でき、すべてのアッセイ可能な検体を2日以内に入手することができます。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、この手法を非臨床環境で同時に実施できるため、マイクロアレイエピジェネティックなリアルタイムR-T-P-C-Rやフローサイトメトリー解析など、多数のダウンストリームアプリケーションのための出発物質を2日以内に作成できることです。手順を実演するのは、私の研究室のマネージャーであるエイミー・ウェックルです 全血サンプルの処理を開始します。バッファー、遠心分離機、ヒートブロックがすべて準備されていることを確認してください。

バキュテイナーの配送時間をサンプル追跡シートに記録します。サンプルを受け取った後、血清単離を文書化します。検体ログの開始時間は、ブレーキと加速をオフにして7ミリリットルの血清バキュテナーを遠心分離することにより、すぐに処理を開始します。

エアロゾルキャップ付きのスイングバケットローターを1300GSで摂氏4度で20分間使用し、血清バキュテイナーを遠心分離します。BSL 2細胞培養フードでのDNA単離開始時間を記録します。フィアルゲルを含む真空容器を5回反転させ、1つのバキュテナーの上部から200マイクロリットルの全血を2つの20マイクロリットルのプロテアーゼアリコートのそれぞれに加えます。.

プロテアーゼと血液マイクロ遠心チューブをフードに残し、真空容器を含むコールの遠心分離に進みます。.遠心分離前。PBMC 分離の開始時刻を文書化し、採血から 2 時間以内である必要があります。

エアロゾルタイトコンテナにすでに真空コンテナが含まれているFIコールを8〜10回反転させます。次に、バキュテナーを遠心分離し、ブレークして加速し、摂氏22度で1600Gで30分間オフにします。フード内のDNA分離サンプルに戻り、プロテアーゼおよび血液マイクロ遠心チューブのそれぞれに200マイクロリットルのバッファーalを追加します。

チューブにキャップをして、ボンネットから取り外します。次に、それらを15秒間渦巻きにします。ボルテックスがすぐにフラッシュした後、サンプルを回転させます。

添付のテキストプロトコルに記載されているように、DNAがEllucianのカラムから言及されるまでDNA単離を進めます。参加者ごとに 2 つのカラムから DNA をプールし、参加者あたり合計 800 マイクロリットルの収量を得ました。白血球RNA単離の開始時間を記録します。

K two EDTAバキュテイナーのゴム製セプタムにトランスファースパイクを突き刺します。シースとスクリューキャップは、K two EDTAチューブシステムの組み立て後で使用するために保持してください。金属製のヘラの端を使用して針を安全に外し、空の10ミリリットルの真空採血チューブに針を挿入します。

K 2 EDTAバキュテイナーフィルターレシーバーチューブアセンブリを反転させてセットアップを完了します ろ過とA PBS洗浄後、新しい10ミリリットルのシリンジを使用して3ミリリットルのRNA安定化剤を引き出します。フィルターをフラッシュし、RNA安定化剤が付着したままであることを確認します。次に、プランジャーを引っ込めずにシリンジをフィルターから取り外します。

トランスファースパイクから保持されたシースとスクリューキャップでフィルターの入口と出口を密閉し、フィルターをRNA安定化剤で飽和させます。フィルターは、RAアイソレーションが完了するまで、摂氏マイナス80度で少なくとも2時間保管してください。バキュテナーをBSL 2フードに戻したら、ストッパーを取り外し、血清ピペットを使用して、単核層に近づくことなく上部血漿層の1.5ミリリットルを引き出します。

2つのバキュテナーから血漿を5ミリリットルのクライオバイアルに移します。次に、収集したボリュームをログに記録します。血清学的ピペットを使用して、残りの血漿と単核層を15ミリリットルの円錐管に移します。

次に、事前に準備したXPBSを十分に追加して、円錐管の総容量を最大15ミリリットルにします。チューブにキャップをして、5回反転させます。次に、ブレークと加速をオフにしてチューブを遠心分離し、摂氏300GSで22°Cで15分間

フード内の真空容器を含むフィアルに戻り、赤血球または赤血球を採取します。5インチと3/4インチのパスティエピペットを使用して、フィアルゲル層の外側をぐるぐる回して緩め、取り除きます。血清学的ピペットを使用して、RBCを収集し、5ミリリットルのクライオバイアルに移します。

次に、ボリュームをログに記録します。次に、血漿およびRBCクライオバイアルを制御速度凍結容器に移し、摂氏マイナス80度で少なくとも24時間保存します。24時間後、サンプルをクライオボックスに移し、マイナス80°Cに戻して長期保存します。

遠心分離が完了したら、円錐形のチューブをフードに戻し、液体を吸引すると、ペレットを乱すことなく500マイクロリットルのPBSが残ります。XPBSを1つ追加して容量を10ミリリットルにし、ペレットを再懸濁します。チューブをそっとキャップし、5回反転させます。

次に、ブレーキと加速でサンプルを遠心分離し、摂氏300GSで22°Cで10分間加速します。遠心分離後、バキュテナーから最上部の血清層を2ミリリットルのクライオバイアルに分注し、容量を文書化します。4つのクライオバイアルを使用し、200マイクロリットルをクライオバイアルに分注します。

1000マイクロリットルをクライオバイアル2に。次に、残りの容量をクライオバイアル3と4に分割します。クライオバイアルをクライオボックスに移し、マイナス80°Cに保ち、長期保存します。

そして、冷凍庫の開始時間を文書化します。PBMC 分離を続行します。遠心分離後にサンプルをフードに戻すときは、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引します。

ペレットを2.5ミリリットルのPBMCに懸濁します。ミディアムワン。2.5ミリリットルのPBMCを加え、DMSOとRPMIを含む2つの培地を凍結します。

事前に調製した細胞溶液に培地を移し、サンプルを穏やかにボルテックスします。次に、10マイクロリットルの細胞溶液をマイクロ遠心チューブに分注します。0.4%トリップパンブルーステイン10マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに加え、数回ピペッティングして溶液を混合します。

次に、混合物の10マイクロリットルを細胞計数チャンバーにピペットで移します。スライドさせて、混合後3分以内にスライドをセルカウンターに入れます。ズームインして、セルに焦点を合わせます。

次に、カウントセルを選択して、A-P-B-M-Cカウントを取得します。生存PBMC数が1ミリリットルあたり300万細胞を超える場合は、サンプルを最大5つのクライオバイアルに分注し、少なくとも1ミリリットルあたり300万細胞の濃度で分注します。それぞれが検体ログにクライオバイアルあたりの細胞数を記録します。

生存PBMC数が1ミリリットルあたり300万細胞未満の場合の対処方法については、添付のテキストプロトコルを参照してください。最後に、クライオバイアルを制御速度の凍結容器に移し、摂氏マイナス80度で少なくとも24時間置きます。24時間後、クライオバイアルをクライオボックスに移し、ボックスを液体窒素タンクの気相に置いて長期保存します。

フリーザーの開始時刻を試料ログに記録します。白血球RNA単離およびフィルター処理法により、キャピラリー電気泳動から得られたこのゲル像が得られました。ATTおよび28sリボソームRNAを表す2つの異なるバンドが最小限の分解で生成されました。

この手順を試行する際には、正確なレコードを維持することが重要であることを覚えておくことが重要です。クライオバイアルのすべての情報(容量、濃度、品質、バーコード、保存場所など)を最初に保存するためのデータベースを開発することをお勧めします。また、サンプルの編成に関するその他の推奨事項は、テキストプロトコルに記載されています。