神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析

この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーを使用して神経細胞上の表面および細胞内抗原の発現を解析することです。これは、まずin vitro培養物または初代神経組織から神経細胞を採取することによって達成されます。次に、オプションの非特異的細胞内染色液を細胞に塗布します。

その後、目的の表面抗原を直ちに一次抗体で標識しますが、目的の細胞内抗原は細胞の固定と透過後に標識します。最終的には、細胞内標識によって定義される特定の目的の神経亜集団における表面抗原の共発現について、フローサイトメトリー解析を使用することで結果を得ることができます。このプロトコールでは、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して表面抗原および細胞内抗原を調べるための組織培養由来神経細胞を調製する方法を示します。

採取を開始するには、まず、室温で5ミリリットルのマグネシウムおよびカルシウムを含まないPBSで細胞を1回優しく洗浄することにより、T75フラスコで増殖した付着神経細胞を採取します。次に、3ミリリットルのトリプシン置換を加えてフラスコから細胞を切り離し、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。細胞懸濁液を数回ピペッティングして細胞塊を緩めた後、6ミリリットルのフローバッファーを追加して酵素消化をクエンチし、細胞懸濁液全体を新鮮な15ミリリットルのチューブに移して細胞を分離します。

チューブを遠心分離機に入れ、細胞を室温で5分間スピンダウンし、細胞内色素標識の準備としてスナットを吸引します。細胞ペレットを5ミリリットルのPBSと0.1%BSAで再懸濁します。それ以外の場合は、標準的なトライアンブルー染色プロトコルと組み合わせて5ミリリットルのフローバッファーを追加します。

ヘモサイトメーターを使用して、有効な生細胞数を推定します。既存の懸濁液の細胞濃度を、前のステップで使用したのと同じバッファーを使用して、1ミリリットルあたり100万個の生細胞に再調整します。これらの細胞は、表面抗原抗体染色、またはカルボキシフルオレセインとそれに続く前述の表面抗原染色によるオプションの蛍光細胞内染色の2つの染色オプションの準備が整いました。

カルボキシフルオレセインCINエステル色素で細胞内標識ステップを実行するには、まず10マイクロリットルのCFSEストック溶液を添加します。細胞懸濁液1ミリリットルごとに、チューブを200 RPMのシェーカーに置き、混合物を5分間インキュベートします。室温では、チューブを直接光にさらさないように保護することにより、光退色を防ぎます。

フローバッファーを含む5容量の血清を加えてすべての非反応性色素をクエンチし、ピペットで数回ゆっくりと上下させて混合します。次に、室温遠心分離機で細胞を5分間スピンダウンし、上清を吸引して、非反応性色素の残留微量を除去します。細胞ペレットを5容量のフローバッファーで懸濁して洗浄します。

次に、細胞を室温遠心分離機で5分間再度スピンダウンしてから、SUPナタントを廃棄します。最後に、細胞ペレットをフローバッファーで再懸濁し、最終的な細胞濃度が1ミリリットルあたり100万個の生存細胞になるようにします。マルチプレックス実験では、異なる実験条件で採取した同数の未染色細胞をCFSC染色細胞懸濁液に加えます。

これで、細胞は抗体による表面抗原標識の準備ができ、細胞表面の染色を開始できます。CFSCラベルの有無にかかわらず、100マイクロリットルの細胞懸濁液を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。抗体滴定試験で事前に決定した量で、細胞懸濁液に4つの標識抗体を添加します。

チューブを100 RPMの室温オービタルシェーカーに置き、混合物を30分間インキュベートします。光が当たらない場合は、1ミリリットルのフローバッファーを加えて抗体混合物を希釈します。静かにピペットで上下させて、あらかじめ冷やした摂氏4度の微量遠心分離機で細胞を混合し、スピンダウンします。

穿返酸を吸引して未結合の抗体を除去し、この洗浄遠心分離機と吸引を繰り返します。もう一度一歩踏み出します。Reusは、細胞ペレットを100マイクロリットルにフローバッファーとして、以前に染色した細胞に懸濁します。

500マイクロリットルの固定バッファーを細胞懸濁液の100マイクロリットルに加えます。チューブを100 RPMの室温オービタルシェーカーに置き、暗所で15分間インキュベートします。ホルムアルデヒドは、互いに近接しているすべてのタンパク質およびDNA種を架橋し、生存不能な細胞懸濁液を生成します。

1ミリリットルのPBSを加えて固定混合物を希釈し、数回ピペットで軽く上下させて混合します。次に、あらかじめ冷却した摂氏4度の遠心分離機で固定細胞を3分間スピンダウンします。100マイクロリットルの液体が細胞ペレットの上に残るように supinate を吸引し、その後の細胞内抗原標識のために細胞膜を透過します。

500マイクロリットルの透過緩衝液を100マイクロリットルの細胞懸濁液に加えます。チューブを100 RPMの室温オービタルシェーカーに置き、暗所で15分間インキュベートします。1ミリリットルのPBSを数回ピペットで静かに上下させて、あらかじめ冷やした摂氏4度の遠心分離機で固定細胞を混合し、スピンダウンして、浸透混合物を希釈します。

インキュベーション前にSUPナタントを完全に吸引します。一次抗体ワーキングストックを調製するには、抗体をPBSと0.5%tween 20バッファーで希釈します。これは、1%BSA 10%ロバ血清または10%ヤギ血清のいずれかでさらに強化されています。

次に、膜透過性細胞ペレットを100マイクロリットルの一次抗体ワーキングストックで再懸濁します。チューブを200 RPMの室温オービタルシェーカーに置き、暗所で30分間インキュベートします。一次抗体混合物を1ミリリットルのフローバッファーを加えて希釈します。

数回ピペットで静かに上下させて、あらかじめ冷やした摂氏4度の遠心分離機で細胞を混合し、スピンダウンします。穿孔器を完全に吸引して、結合していない抗体を除去します。次に、ペレットを100マイクロリットルの二次抗体ワーキングストックで再懸濁します。

光保護室温インキュベーションを30分間繰り返します。同じシェーカーで、1ミリリットルのフローバッファーを加えて二次抗体混合物を希釈します。同じチューブ反転混合、スピンダウン、上清の除去を繰り返して、結合していないすべての抗体を排除します。

同じ1ミリリットルの洗浄遠心分離と上清除去のステップをさらに2回繰り返しますが、洗浄バッファーとして新鮮なPBSを使用します。代わりに、最終結果は、CFSC細胞外または細胞内標的蛍光抗体、または3つの再懸濁抗体の任意の組み合わせで標識されたクリーンな細胞ペレット、つまり150マイクロリットルのフローバッファーに標識された細胞ペレットになります。細胞懸濁液をフローサイトメーターに移し、4つのフロアごとに適切なレーザー励起フィルターと蛍光フィルターの設定で解析を開始します。

前方散乱光と側方散乱光のデータをガイドとして、フローサイトメトリー解析ソフトウェア内で初期前方散乱と側方散乱光を設定し、細胞破片や死細胞などの非特異的なデータポイントを除外します。次に、未染色細胞懸濁液の生データをネガティブコントロールとして、細胞外抗原標識と細胞内抗原標識の両方からのポジティブ発光シグナルを選択する複数の蛍光インテグレーションゲートを設定し、マルチカラーのバックグラウンド蛍光を考慮します。スペクトルオーバーラップ効果は、単一の抗体染色コントロールからの生データを使用して蛍光ゲートを再調整します。

マルチプレックスFAX実験では、カルボキシフルオレセインタグをベースラインシグナルとして使用でき、抗体を使用せずに2つの異なる系統または実験条件の細胞を区別できます。例えば、不均一な細胞懸濁液では、緑色チャネルの蛍光の有無を見るだけで、CFSCでタグ付けされた神経細胞とタグされていない線維芽細胞を即座に区別することができます。さらに、CFSE Esther標識と併用して、異なる色の蛍光抗体を使用して、混合サンプル内のCFSE標識サブセットと非標識サブセット間の表面抗原の発現差を測定できます。

例えば、緑色蛍光チャネルにCFSEで標識されたSHSY 5 Y神経芽腫細胞は、高レベルのCD 24表面抗原を共発現したが、線維芽細胞マーカーCD54は共発現しなかった。対照的に、CFSC陰性のBJ線維芽細胞は、CD 54に対して陽性であり、CD 24のレベルは低い。神経表面抗原の解析は、抗体を用いた細胞内抗原の検出と併せて行うこともできます。

表面抗原および細胞内抗原の未染色サンプルおよび単一染色コントロールを含めることは、ここに示す神経マーカーマップ2のような細胞内抗原の一次および二次抗体ベースの標識の代替として重要です。一次抗体の共有結合性蛍光標識は、共発現解析で同等の結果を得ることができ、プロトコールを短縮します。このビデオを見れば、さまざまな代替標識アプローチとその組み合わせを使用して、基本的なフローサイトメトリー解析のために神経細胞を調製する方法を十分に理解できるはずです。