ラット視神経への注入のための低侵襲テクニック

この手順の全体的な目標は、生きたラットの視神経に薬物または幹細胞を注射するための低侵襲アプローチを提供することです。これは、最初にラットに麻酔をかけ、解剖スタンドに配置し、眼を操作するために結膜に縫合糸を挿入することによって達成されます。その後、2番目のステップは、目の後ろの眼窩隆起を解剖して視神経を露出させることです。

次に、ガラスピペットを視神経に挿入し、手術部位を閉鎖してラットを麻酔から蘇生させる前に、薬物または幹細胞を注入します。最終的に、一定期間後、ラットが犠牲にされ、視神経が解剖され、外科的注射または移植の影響が顕微鏡検査によって視覚化されます。この手法が既存の方法よりも優れている点は、このアプローチが低侵襲であり、必要な限りラットが生き残ることができることです。

外科的注射または移植の効果を研究します。手順を実演するのは、私の研究室の学生技術者であるKate Schwartzです。すべての外科的処置は、2〜3%のフッ素を含む麻酔下で行ってください。

つま先をつまむ程度の麻酔と呼吸数で適切な麻酔レベルを確認します。ネズミがつま先に反応してひるまないことを確認してください。抓る。処置中の頭の動きを避けるために、必要に応じて動物を固定します。

次に、手術用の眼にリドカインを一滴垂らします。麻酔下での乾燥を防ぐために、10分ごとに人工涙液を使用してください。術前にブプレノルフィンを1キログラムあたり0.01ミリグラムで皮下注射し、その後必要に応じて6〜8時間ごとに注射します。.

加熱パッドで動物を暖かく保ちます。頭皮の毛皮をアルコールで濡らします。目に触れないように注意してください。

術後感染のリスクを最小限に抑えるために、滅菌ツールと滅菌技術を必ず使用してください。次に、外側結膜に4OH縫合糸を配置し、穏やかな牽引を可能にするのに十分な縫合糸で結びます。眼窩隆起を覆う皮膚に約1インチの切開を行います。

サイズ10のメスを使用。皮膚とその下にある筋膜を引っ込め、筋膜を慎重に解剖します。収縮した皮膚に1つの縫合糸を配置して、上眼窩嚢が露出できるようにし、手術部位への過度の出血を防ぎます。

筋膜を解剖しながら血管を切断することは避けてください。結膜を優しく牽引し、目を下に引っ張ってソケットから外すと、上眼窩筋が見えてきます。視神経を露出させるためには、眼窩後脂肪を取り除き、この筋肉を切開する必要があります。

脂肪は廃棄することができ、注射後に交換しないでください。この点から、視神経筋膜は、硬膜に包まれた血管とともに、視神経自体の束として見えるはずです。より深い解剖を行うには、メスまたは31ゲージの斜角針を使用してDRAに小さな切開を行い、ピアスの外傷性を減らし、安定性を提供するために直径50〜100ミクロンのプルガラスマイクロピペットを用意しました。

マイクロピペットをマイクロマニピュレーターに取り付け、20ccのプラスチックシリンジに取り付けます。0.5〜1マイクロリットルで再構成したビーズまたは幹細胞をマイクロピペット逆行性に引き上げ、ガラスピペットに色素を充填する前後に0.5マイクロリットルのメチルブルー溶液をプルアップします。1 ccの注射器と30ゲージの針を使用して、マイクロピペットの先端を傷んだ硬膜のすぐ上の視神経に下げます。

ガラスの先端が視神経に小さくて活発に動くと、プランジャーにゆっくりと一定の圧力をかけながら、損傷が最小限に抑えられます。エバンスブルー染料は、注入された視神経の領域を強調する必要があります。染料は、くも膜下腔に漏れることなく視神経内に局在したままである必要があります。.

Evan's Blue Dyeの2番目のバンドをたどって、幹細胞注入がいつ完了したかを判断します。必要な量が視神経に注入されたら、プランジャーを放します。マイクロピペットを視神経内に5分間静止させ、注射が完了したときにマイクロピペットを抜くときに高圧が放出されるのを防ぎます。

マイクロピペットと、止血に使用した綿チップをすべて取り外します。3.0シルクで皮膚を縫合し、結膜縫合糸を取り除きます。ラットが麻酔から出てくるまで、加熱パッドで暖かく保

動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。動物が過度の無気力、運動失調、または苦しい呼吸などの痛みの兆候を示している場合は、筋肉内ブプレノルフィンによる適切な鎮痛剤を1日3回まで投与します。.実験後、ラットを屠殺し、パラアルデヒドで灌流しました。

視神経は慎重に解剖され、クライオスタット切片化のためにマウントされました ここに示されているのは、Evanの青い色素が注入された低電力のラットホール視神経の例です。部位を視覚化するために、矢印は注入の正確な位置を識別します。この解剖は、その発達後に神経への色素の拡散が制限されていることで示されるように、注射から数日以内に行われました。

この技術は、再生神経学の分野の研究者が、この脱髄疾患のラットモデルで視神経を再生し、失われた視力を回復する可能性のある新しい方法を探求する道を開きました。