エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

この手順の目標は、マウス胚、蝸牛exvivoを培養し、電気操作することです。形態形成、分化、成長イベントなど、蝸牛の発生のさまざまな側面を研究するために、これは最初に13日目の胚性マウス胚から頭部を取得することによって達成されます。次に、脳を取り外して内耳を露出させ、頭蓋骨の基部から分離して発達中の側頭骨から分離します。

次に、上にある軟骨を切除し、蝸牛管を開いて蝸牛の感覚上皮を取得します。最後のステップは、エレクトロポレーションの有無にかかわらず、解剖された蝸牛を最大1週間培養することです。最終的に、インプラントは、生細胞イメージングまたは固定免疫染色のために分析し、共焦点イメージング、マウス胚の培養によって分析することができます。

Cochlear explanは、発達中の蝸牛の増殖、硫酸塩の仕様、極性など、器官形成のさまざまな側面と、これらのイベントが成長と分化にどのように寄与するかを研究するための優れたシステムを提供します。したがって、この技術により、薬理学的操作を行い、生体外で遺伝子機能を監視することができます。したがって、この技術はエレクトロポレーションによる遺伝子導入と相まって、目的の遺伝子の発現を変更し、その機能を単一細胞レベルで監視することができます。

この手順を開始するには、E 13マウス胚の頭部を、冷たい解剖液を含む滅菌ソガー皿に入れます。解剖顕微鏡下で、目の周りの細かいピンを配置して胚の頭を固定します。次に、2対の滅菌鉗子を使用して、慎重に皮膚を取り除き、正中線に沿って背側の頭蓋骨を開きます。

その後、頭蓋腔から脳を取り出します。側頭骨の内側にある内耳は、その周りの血管の内壁から識別できます。次に、鉗子を組織の下に置き、内耳を頭蓋骨の基部から分離することにより、側頭骨から内耳を解剖します。

その後、解剖した内耳を冷たい解剖液を含む新しい皿に移します。次に、腹側が上を向くように内耳を向けます。ミニューシンピンの鋭い端を前庭部分にそっと挿入して、内耳を安定させます。

超微細鉗子を使用して、楕円形の窓の近くに切開を行い、上にある軟骨を切り開きます。鉗子が軟骨に深く挿入されすぎないように注意してください。なぜなら、上にある軟骨が蝸牛管と融合することがあるからです。次に、蝸牛から軟骨を慎重に取り外します。

次に、鉗子を蝸牛管の基部または頂点に配置して感覚上皮を露出させ、蝸牛の屋根をそっと引き出します。最後のステップとして、露出した感覚上皮から下にある結合組織を慎重に取り除き、人工内耳の基部が平らになるようにします。その後、解剖された蝸牛を内耳の前庭部分から分離します。

解剖された蝸牛感覚上皮を基底膜マトリックスに移す 1.5ミリメートルの滅菌スクーパーを使用してコーティングされた培養井戸 余分な組織を除去するためにさらに洗浄が必要な場合、これはこの段階で行うことができます。次に、上皮の管腔表面を上に向けて蝸牛の説明を向けます。基底膜マトリックスDMEM溶液を吸引して組織を慎重に平らにし、150マイクロリットルの新鮮な培地を皿に穏やかに加えます。

各x explanaがコーティングされたガラスカバースリップにしっかりと付着し、培地に浮いていないことを確認してください。次に、マイクロ解剖した蝸牛を無菌の150mm培養皿に静かに移し、組織培養インキュベーターに入れます。摂氏37度、二酸化炭素5%、3〜6DIVです。

1D IV.解剖顕微鏡で培養物を検査し、人工内膜が培養皿にしっかりと付着していることを確認します。次に、インビボで所望の期間培養をインキュベートし続けてから、免疫組織化学に処理し、エレクトロポレーション用にセットアップします。まず、100mmシガーコーティングガラス皿1枚をオートクレーブまたは70%エタノールに約20分間浸して滅菌します。

その後、使用する前に清潔なベンチで風乾させます。次に、適切なマキシまたはMIDI調製キットを使用して、選択した発現ベクターからDNAを調製します。このプロトコルで使用される発現ベクターは、H one 発現コンストラクトおよびニューロ D one 発現コンストラクトである。

そして、DNAの最終濃度は、無菌DNA RNAの自由水で1マイクロリットルあたり少なくとも1マイクログラムである必要があります。100ミリの葉巻でコーティングされた新鮮な皿に10マイクロリットルの血漿DNA溶液を加えます。次に、完全に解剖した蝸牛エクスプランを、上皮の管腔表面を上にしてDNA溶液に移します。

蝸牛を少し傾けて、皿の平面に対して垂直になるようにします。次に、負極パドルを感覚上皮に向けて配置し、正極パドルを電気装置を使用して蝸牛の基部の隣に配置します。24ミリボルト30ミリ秒のパルス持続時間を9〜10パルス配信します。

続いて、100マイクロリットルの温かい培地を電気定格の蝸牛に加えます。すべての人工内耳の説明と目的のすべての遺伝子のDNAについて手順を繰り返してから、電気定格の蝸牛を基底膜マトリックスコーティング皿に移してプレーティングします。次に、電気定格のすべての蝸牛を摂氏37度の5%二酸化炭素加湿インキュベーターで所望の時間培養し、免疫細胞化学のために処理します。

これらの画像は、野生型CD oneマウスパブからの胚の13日目人工内耳を示しており、TH one、EEG FP、またはneuro D one EGFP Reporterコンストラクトでエレクトロポレーションされています。それらは、有毛細胞特異的マーカー、抗ミオセブンA、またはニューロンマーカー2対1で免疫標識されました。EGFPの発現によって視覚化できる電気定格細胞は、大方上皮隆起細胞、小方上皮隆起細胞、および感覚上皮細胞全体に見られます。

ニューロD oneは、5回のDIV後にトランスフェクションされた蝸牛上皮細胞で、樹状突起を伴うニューロン表現型を獲得し、そのほとんどはtwo oneまたはa T oh H oneに対して陽性であった。トランスフェクションされた細胞はMyo sevenに対して陽性でした。表現 一度習得すると、このテクニックは8〜10ポップのインテルリットルで3〜4時間で行うことができます。

これにより、解剖培養、エレクトロポレーション、および説明のめっきに十分な時間を確保できます。