光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

次の実験の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの胚における細胞内および細胞外タンパク質の安定性を測定することです。これは、目的のタンパク質に光変換可能な蛍光タンパク質をタグ付けし、融合をコードするmRNAと蛍光色素をゼブラフィッシュの胚に注入することで達成されます。次に、光変換融合タンパク質が光変換され、パルスがタンパク質を標識します。

この例では、融合タンパク質が分泌され、その後、細胞内および細胞外の光変換された蛍光強度の崩壊を経時的に監視し、指数関数的に減少する関数を装着して、融合タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定します。この結果は、光変換融合タンパク質のin vivo安定性を、時間の経過に伴う蛍光シグナルの減衰に基づいて示しています。この方法は、細胞生物学および発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

たとえば、安定性がタンパク質の分布と利用可能性にどのように影響するかなどです。FD DPデータの解析には、当社のソフトウェアEPを使用しています。EPは、当社のウェブページで無料で入手できます:コード化してキャップ付きmRNAを生成した後、関心のある緑から赤への光変換融合タンパク質をコード化し、約31の細胞段階のゼブラフィッシュ胚を直径5センチメートルのガラスまたは寒天ローズコーティングプラスチックペトリ皿に約8ミリリットルの胚培地を移します。

あらかじめ調製して解凍したプロナイストック溶液2ミリリットルを皿に加え、室温で5〜10分間インキュベートします。ガラススピーカーに胚培地を入れ、胚を空気やプラスチックにさらさないようにしながら、ペトリ皿を傾けて胚をビーカーに移し、培地に沈めます。胚がビーカーの底に落ち着いたら、培地の大部分を注ぎ出し、新鮮な培地を使用して慎重に交換します。

新鮮な培地の穏やかな渦巻きは、胚が弱くなったコリオンを失う原因となります。洗浄を繰り返した後、先端が炎状になったガラスPEピペットを使用して、コーティングされた胚をアガロースコーティングされた注射皿に移します。次に、mRNAと3キロダルトンのAlexa 4 88 DExTストランドコンジュゲートを細胞の中心に直接共注入して、mRNAと色素が均一に分布するようにします。

卵割が始まったら、注入した胚を胚を充填した6ウェルプラスチック皿の1〜2%アガロースコーティングウェルに移し、胚が実体顕微鏡で後期球体に達するまで摂氏28度の暗闇でインキュベートし、1〜5個の健康な胚を特定し、炎の先端が付いたガラスPEピペットを使用して皿からそれらを除去します。1 x danios胚培地中の約1ミリリットルの溶融1%低融点AROSを含むマイクロ遠心チューブに胚を穏やかに排出します。次に、胚をいくつかのアロと一緒にピペットに戻します。

次に、アロと胚をカバーにそっと排出します。ガラス底皿のガラス。ガラスピペットを再利用するには、胚培地をすばやくピペッティングして目詰まりを防ぐため、残留アロを清掃し、アロが固まる前に迅速に作業します。

金属プローブを使用して、動物のポールが実体顕微鏡の下のカバーガラスに面するように胚を配置します。胚の位置を監視し、アガロが固まるまで必要に応じて再調整します。アガロが固まったら、1つのx danios胚培地を使用してガラス底皿を満たします。

写真変換の準備として、インキュベーターを摂氏28度に設定し、対物レンズに大量の浸漬油を垂らして、ステージが異なる胚位置に移動するときに対物レンズとカバーガラスの間の油膜が壊れないようにします。イメージングを確実に行いながら、ステージが動いたときに皿がずれないように、ガラス底の皿をステージに置きます。次に、共焦点顕微鏡のソフトウェアパッケージで、各胚の位置を定義します。

各胚のZ深度を調整し、4 88 ナノメートル レーザーと 5 43 ナノメートル レーザーの両方を使用して、各胚のほぼ同じ平面を標的にしようとします。写真変換前の画像を取得します。次に、共焦点顕微鏡ソフトウェアを設定して、事前に定義した各位置を適切なイメージング条件でイメージングします。

10分または20分または5時間の時間経過ごとに、融合タンパク質スイッチを10倍対物レンズに変換し、胚のグループを水銀ランプからの紫外線に約300〜400ナノメートルのフィルターで100%出力で2分間さらします。Z軸に沿ってフォーカスをずらすと、写真変換ごとに均一な写真変換が促進されます。すぐに25 x または 40 x の対物レンズに切り替えて、以前に定義した位置がまだ正確であることを確認します。

写真変換中に皿がずれた場合は、胚の位置を再定義します。イメージングタイムコースを開始し、5時間実行します。各胚の写真変換からイメージング開始までの経過時間に注意してください。

時々実験をチェックし、ダニエルの培地のレベルを監視し、必要に応じてさらに追加します。まず、各胚の時系列データセットを視覚的に調べることから始めます。イメージング中に死亡した胚で、大幅にシフトした胚、光変換されたシグナルのレベルが非常に低い胚、または異常に見えて移動と分裂が停止した細胞の領域を含む胚のデータセットは破棄します。

PI F DAPは、Pythonベースのソフトウェアパッケージを使用して、Alexa 4 88信号(厳密には細胞内)を使用してマスクを作成します。細胞内および細胞外の写真変換されたシグナルを分離するには、対応する赤チャネル画像にマスクを適用して、細胞内ピクセルが考慮されないようにします。平均細胞外強度を計算するために平均細胞外強度を測定する場合は、マスクを反転し、生成されたマスク画像を表示し、それらを視覚的に検査し、マスクが細胞内空間と細胞外空間を正確に区別しないデータセットを破棄します。

PI F DAPを使用して、各画像の平均細胞外および細胞内蛍光強度を計算します。次に、テキストプロトコルのガイドラインに従って、ここに示されているように蛍光データを適合させ、細胞外および細胞内タンパク質を計算します。クリアランス率から半減命タウ。

コンスタンスKスクイントは、ゼブラフィッシュの胚発生時にミス内胚葉遺伝子の発現を誘導する分泌タンパク質です。この実験では、胚にAlexa 4 88デキストランとmRNAをコードするsquint DENDRA twoを同時注入し、F DAPアッセイを行いました。このように、細胞外光変換された信号強度は時間とともに減少します。

PI F dapを使用して、23の胚から細胞外強度プロファイルを生成し、データに一次クリアランスモデルを適合させました。その結果、平均半減期タウは116分でした。強度プロファイルとタンパク質が類似しています。

半減期は、イメージングの間隔が10分または20分の場合に得られました。写真の漂白や不注意による写真の変換が強度の変化に大きく寄与しなかったことを示唆しています。このビデオを見た後、写真変換後の蛍光減衰の使用方法をよく理解しているはずです。

in vivoで測定する。生きたゼブラフィッシュ胚における光変換融合タンパク質の半減期。