Name: 光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ光変換後蛍光減衰法（FDAP）を用いて、生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の細胞内外安定性を測定する方法。この技術は細胞生物学と発生生物学の研究に有用です。

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著者は、原稿上のコメントジェフリー·ファレル、ジェームズガニオン、そしてジェニファーバーグマンに感謝したいと思います。 KWRはFDAPアッセイの開発中に国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによってサポートされていました。この作品は、AFSへとPMにドイツ研究財団（エミー·ネータープログラム）、マックス·プランク協会、とヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（キャリア開発賞）からの補助金によってNIHからの助成金によってサポートされていました。

1. Photoconvertible融合構築し、ジェクトする絨毛膜を​​除去ゼブラフィッシュ胚の生成<ol><li>ミュラーらのように、融合タンパク質をコードするキャップされたmRNAを生成するために、インビトロ転写を使用し、その後、（説明を参照）緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質に融合された関心対象のタンパク質を含有する機能性構築物を生成する。、2012 19。 </li><li> 1細胞期で約30ゼブラフィッシュ胚から絨毛膜を除去するためのプロナーゼを使用してください。あるいは、手動で鉗子28を使用して胚をdechorionate。 注：胚は、その後の画像化のために絨毛膜を除去する必要があります。所望ならば、胚は、撮像直前に、後で絨毛膜を通して注入及び絨毛膜を除去することができる。 <ol><li>標準のゼブラフィッシュ胚培地19中でストレプトミセス·グリセウスからプロナーゼの5mg / mlのストック溶液を作る。プロテアーゼを溶解させるために室温で10分間静かに解決策を揺する。アリコート2メートル-20℃でマイクロチューブにLと凍結。 </li><li> 〜8ミリリットル胚培地を含む直径5cmのガラスまたはアガロースでコーティングされたプラスチック製のペトリ皿に移し1細胞期胚。皿に解凍したプロナーゼ原液の2ミリリットルを追加し、5から10分間、室温でインキュベートする。 </li><li>絨毛膜を除去胚が破裂する原因となりますのいずれかとの接点として、空気やプラスチックに胚を近づけないようにしてください。胚培地で200ミリリットルのガラスビーカーを埋める。媒体中に沈めながら、シャーレを傾けてビーカーに胚を転送します。 </li><li>胚がビーカーの底に沈殿した後、その後ビーカーに新鮮胚培地を注ぐ、胚培地のほとんどを注ぐ。ビーカーに注ぐ媒体の穏やかな旋回は、胚は彼らの弱体化絨毛膜を失うことになります。 </li><li>手順を繰り返し1.2.4。 </li></ol></li><li>フレームド先端がガラスパスツールピペットを用いてアガロースでコーティングされた注射ディッシュ29に絨毛膜を除去した胚を転送します。燃えるようなピペットチップは、負傷の胚からぎざ​​ぎざのエッジを防ぎます。 </li><li> mRNA及び3 kDaのAlexa488標識デキストランコンジュ29,30（;提案されたmRNAとのAlexa488デキストラン金額についての議論を参照してください。図1B）を共同注入する。切断が開始されるとさえmRNAの分布及び蛍光色素を確実にするために、細胞（卵黄ない）の中心に直接注入する。 注：Alexa488標識シグナルは、細胞内および細胞外の蛍光を区別するために、コンパートメントのマスクを生成するために、データ解析中に使用される。 </li><li>転送は、1〜2％アガロースでコーティングされたウェルの胚培地で満たされた6ウェルプラスチック皿に胚を注入した。胚が後半球ステージ31（約5時間後に受精）に到達するまで28℃の暗所でインキュベートする。実体顕微鏡下で胚ごとに1〜2時間をチェックして、死亡した胚によって生成された破片を除去。 </li></ol> P 2.取付ゼブラフィッシュ胚倒立共焦点顕微鏡上hotoconversionとイメージング<ol><li>一から五健全な胚を特定し、皿からそれらを削除するフレームド先端にガラスパスツールピペットを使用するために実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>穏やかに1×Danieauの胚培地中で溶融し、1％低融点アガロース（材料リストを参照のこと）（ 図2A）の約1 mlを含むマイクロ遠心チューブに胚を取り出す。 注：アガロースを40と42℃の間の温度を有するべきである。より高い温度は、胚を損傷する恐れがあります。 </li><li>いくつかのアガロースと一緒に戻ってピペットに胚を描画します。静かにグラスボトムディッシュ（ 図2B）のカバーガラス上にアガロースおよび胚を取り出してください。カバーガラスの厚さは共焦点顕微鏡上の目的と互換性があることを確認してください。 <ol><li>必要に応じて、ガラスピペットを再利用。ピペットの外に残留アガロースをきれいにし、上下にすばやく目詰まり、ピペット胚培地を防ぐために。この目的のための実体顕微鏡の隣にある胚培地の〜5ミリリットルで満たされた15ミリリットルチューブを置きます。 </li></ol></li><li>動物極（胚盤葉）はカバーガラスに対向するように胚を位置決めする金属プローブを使用する。アガロースは20〜30秒で固化するので、すぐに作業。胚のポジションを監視し、アガロースが硬化するまで、必要に応じて再調整する実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>胚の所望の数がマウントされるまで繰り返します2.1から2.4を繰り返します。 注：典型的な実験において、4つ、または5つの胚をそれぞれ含む4アガロース滴をカバーガラス上に容易に収まる。約16の胚を単理想的実験（ 図2C）中に撮像することができる。 </li><li>アガロースが固化した場合には、1X Danieauの胚培地とガラスボトムディッシュを埋める。 </li></ol> 3. PhotoconvertingとPhotoconverted信号の減少を測定する 25Xまたは40X水客観Iゼブラフィッシュ胚の大きさ及び屈折率の適切な秒。水は5時間の実験中に蒸発するので、それは、水ではなく、実際の水と同じ屈折率液浸油を使用するのが最適です。イマージョンオイルを水（しない油）目的で使用するように設計されていることを確認。 <ol><li>対物レンズとカバーガラスとの間に油膜がイメージング中に異なる胚の位置にステージを移動するように破壊しないことを確実にする目的に液浸油の大滴を置く。ステージが移動したときの皿がずれないように、確実に、ステージ上にガラスボトムディッシュを置く。可能な場合は、28℃、ゼブラフィッシュの開発に最適な温度で加熱されたステージを使用しています。 </li><li>共焦点顕微鏡のソフトウェアパッケージ内の各胚の位置を定義します。各胚のためのZ深度を調整し、各胚にほぼ同じ平面をターゲットにしようとします。 注：約30μm動物極からは、外出先でこの深さで、胚の被覆層を回避することができるので、外径の深さは、撮像領域が最大化され、光の散乱は最小である。 〜3.3ミクロンの厚さの単一の光スライスは十分なデータを提供します。 zスタック（セクション5を参照）を取得する必要はない。 </li><li>実験中に2つの信号を収集する：Alexa488標識デキストラン共役がphotoconvertedされた後の融合タンパク質からの細胞外および細胞内の蛍光及び「赤」信号を分離するために、データ解析中に使用されるから「グリーン」信号を出力する。 <ol><li> 488nmレーザーを使用してAlexa488エキサイト、および〜500と540nmの間で放出される蛍光を収集します。注：光変換した後、多くの緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質（ 例えば 、Dendra2）は、543 nmのレーザーで励起すると、〜550〜650nmの蛍光を発することができる。使用photoconvertibleタンパク質に基づいて、必要に応じて調整します。 </li></ol></li><li>取得する「事前光変換「イメージ、および（5節を参照してください5時間の時間のコースに適した撮像条件と（ステップ3.2から）以前に定義された位置の各々ごとに10または20分間の映像に共焦点顕微鏡のソフトウェアを設定し、 考察）。 </li><li> 、融合タンパク質をphotoconvert 10X対物レンズに切り替えて、2分間100％出力で〜300-400 nmの励起フィルターとの水銀アークランプからのUV光に胚のグループを露出させる。 （セクション5を参照）均一の光変換を促進するためのz軸に沿って焦点を移す。液浸油は、光変換時の10倍の目的上に滴り落ちていないことを確認してください。 注：光変換時のフォーカスの移動は実験者の間で変動性を回避するために自動化することができる。 </li><li>すぐに光変換した後25Xや40X客観的に切り替えます。ステップ3.2から以前に定義された位置は正確であることを確認してください。料理はphotoconv中にシフトした場合ERSION、胚の位置を再定義します。 <ol><li>ステップ3.4で作成したプログラムを起動し、イメージングは​​5時間続けることができる。光変換し、各胚のために撮影開始の間の経過時間に注意してください。 </li></ol></li><li>時折実験に確認してください。 Danieauの媒体のレベルを監視し、必要に応じてさら​​に追加する。それが失速している場合は、ソフトウェアを再起動します。 </li><li>指数関数的に減少するモデルの漸近線を推定するデータ解析中に使用されるバックグラウンドの蛍光値を決定するために、実験にAlexa488標識デキストランはなく、mRNAを注入されたいくつかの胚を含む。また、その後のデータ解析中に使用される装置のノイズを決定するために、サンプルの非存在下での画像を取得する。 </li></ol> 4. PyFDAPを使用したデータの分析<ol><li>視覚的に各胚からの時間経過データセットを検査します。虚部中に死亡した胚からのデータセットを破棄photoconverted信号の非常に低いレベルを持っている、またはそれは珍しい見て、移動すると、（負傷または病気の胚の典型的な）で除停止した細胞の領域を含む大幅にシフトしたING、、。 注：時々、液浸油中の気泡またはその他のアーチファクトがそうでなければ、使用可能なデータ·セットに1つまたは2つの画像に表示されます。アーティファクトを含むすべての画像を注意してください。彼らは、後に破棄され、そのようなデータセットからの残りの時点では、まだ分析することができる。 </li><li> FDAPデータを分析するPythonベースのソフトウェアパッケージPyFDAPを使用してください。 PyFDAPは、各画像の平均細胞内および細胞外の赤色蛍光強度を測定し、指数関数的に減少する関数56（ 図3）を使用してデータをフィッティングすることにより半減期を算出する。 <ol><li> PyFDAPをダウンロード（見る マテリアルリスト）。 </li><li>細胞内および細胞外photoconverted信号（ 図3A、B）を分離するPyFDAP使用。私達細胞内のマスクを作成するために、厳密に細胞内でのAlexa488信号を、メール。平均外強度を計算する際に考慮されてからの細胞内のピクセルを防止するために、対応する赤色チャンネル画像にこのマスクを適用します。平均細胞内の強度を測定するために、マスクを反転。 </li><li> PyFDAPでは、ステップ4.2.2で生成されたマスクされた画像を表示する。視覚的にこれらの画像を検査し、マスクが正確に細胞外空間から細胞内（これは稀であるべきで区別しないでデータセットを破棄し、その細胞膜は、細胞外空間がマスクされた画像に含まれることに注意し、それらは、閾値を変化させることによって除去することができアルゴリズムまたはメンブレンマスクを導入することにより（ 例えば 、用いた膜-CFP））。また、ステップ4.1で識別された成果物（ 例えば 、浸漬油中の気泡）を含む任意の単一のイメージを捨てる。 </li><li> EACの平均外および細胞内の蛍光強度を計算するPyFDAPを使用H画像。 PyFDAPが合計の総画素数で除算マスクの外側にある画素の強度を合計することによって、これらの平均値を算出する。 </li><li>以下の指数関数との蛍光データ（ 図3C）を取り付け： <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> tは時間後の光変換であり、C（t）は、tの任意の値での強度であり、c 0はを t = 0での強度であり、kは一定のクリアランス速度であり、y 0は、関数が蛍光として近づく漸近線である減少した（ 図1D）。Y 0は、ステップ3.8 19における測定結果に基づいて制約することができる。 </li><li>以下の関係を用いてクリアランス速度定数（k）をから細胞外および細胞内タンパク質の半減期（τ）を計算するために使用PyFDAP。 <img fo:contENT-幅= &quot;1インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot;幅= &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol>退色、不注意による光変換、および光変換均一性を評価するために5.制御実験<ol><li>評価退色 注：光退色は、目的のタンパク質のクリアランスに加えて、蛍光タンパク質の漂白特性を反映した蛍光強度のアーティファクトの減少を引き起こす可能性がある。 <ol><li>可能な光退色を評価するために、撮像と撮像の間に20分間隔（ 図4）を有する第二の組の間に10分間隔でFDAPの一組の実験を行う。第4節で説明したようにPyFDAPを用いた実験の両方のセットからのデータを分析します。 </li><li> 10と20分間隔実験から半減期を比較してください。長い半減期20分間隔の実験からは、重要な光退色を示している。両実験からの半減期が同一である場合、photobleachingは重要な問題ではない。 </li><li>あるいは、すぐに光変換した後〜30一連の画像を取得することにより退色評価する。蛍光強度の有意な減少が有意な光退色を示している。 </li><li>退色が検出された場合、より低いレーザーパワーを使用する撮像時間を減少させる、またはそれ以上の光安定photoconvertibleタンパク質32の使用を検討してください。 </li></ol></li><li>不注意な光変換を評価する。 注：Dendra2は488nmの照明27を用いphotoconvertedすることができる。 488nmレーザーで励起のAlexa488、目的のタンパク質の見かけの半減期段階3.3.1、不注意光変換ので、人為的な増加で説明するように、可能な場合である。しかし、我々は、他の33は、488nmの照明は、ゼブラフィッシュ胚における光変換の非効率的な方法であることを見出した。 <ol><li>不注意な光変換を検出するために、ステップ5.1.1で説明した対照実験を使用して。 10と20分間隔実験から半減期を比較してください。 20分間隔の実験から、より短い半減期は大幅な不注意光変換を示している。両方の実験からの半減期が同一である場合には、不注意による光変換は重要な問題ではない。 </li><li>不慮の光変換が検出された場合、誤ってDendra2をphotoconverting避けるために、下部488のレーザパワーより短い撮像時間を使用する。 </li></ol></li><li>光変換均一性を評価する。 注：光変換胚の動物極に向かって付勢されている場合、蛍光の減少は、より深い面（ 図5A）へのタンパク質の拡散または細胞運動によって影響される。 <ol><li>光変換が均一であるかどうかを判断するには、（細胞外融合タンパク質を用いた実験のために）分泌さphotoconvertibleタンパク質または（細胞内の融合タンパク質を用いた実験のために）細胞質photoconvertibleタンパク質を発現する。いつものようにPhotoconvert、T鶏を80分間、20分毎に、胚盤葉のほとんどを包含するzスタックを取得する。 </li><li>光変換は、動物極に向かって付勢されている場合は、より深い面での蛍光強度は、拡散または細胞運動（ 図5B）に経時的に増加します。不均一な光変換が検出された場合、光変換の間、胚に深い焦点を当てる。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示する競合がない。

FDAP実験の成功は、機能的なphotoconvertible融合タンパク質の生成に依存している。タンパク質をタグ付けすると、その局在性、溶解性、および安定性36-41を含む、その生物学的活性および/ ​​または生物物理学的特性に影響を与えることができる。アクティブなものを見つけるために、いくつかの異なる融合構築物の活性を試験するために調製すること。本発明者らは、目的のタンパク質にphotoconvertibleタンパク質の位置を変更したり、より長いリンカーを用いて（ 例えば 、アミノ酸配列LGDPPVAT 19を使用して）融合タンパク質の活性を増強することができる。シグナル伝達タンパク質の場合には、融合タンパク質の活性は、標的遺伝子の19の発現を誘導する能力を試験することにより決定することができる。定量RT-PCR、またはin situハイブリダイゼーションは、標的遺伝子の発現19の良好な読み出しを提供する。ここで説明するプロトコルは、タンパク質の安定性を決定するために設計されていることに注意...

細胞および生物中のタンパク質のレベルは、製造及びクリアランス形成速度によって決定される。タンパク質半減期は数分から数日1-4の範囲とすることができる。多くの生物学的システムでは、重要なタンパク質の安定化またはクリアランスは、細胞活性に重要な影響を有している。細胞内のタンパク質の安定性の調節は、細胞周期の進行5,6、発達シグナリング7-9、アポトーシス10、および正常な機能およびニューロン11,12の維持に必要である。細胞外タンパク質の安定性は、組織内のモルフォゲン13,14、などの分泌タンパク質の分布と可用性に影響を与えます。 過去数十年にわたって、タンパク質の安定性は、主に放射パルス標識またはシクロヘキシミドチェイス実験15を使用して、細胞培養において評価されている。このようなパルスチェイス実験において、細胞を一過放射性アミノ酸の「パルス」に露出されている新たに合成されたタンパク質に組み込まれているか、又はそれらは、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド、にさらされている酸前駆体。培養された細胞は、その後の異なる時点で、そしていずれかの免疫沈降は、（放射パルスチェイス実験において）、続いてオートラジオグラフィーまたはウェスタンブロッティング（シクロヘキシミド実験で）収集され、経時的タンパク質のクリアランスを定量化するために使用される。 従来のタンパク質安定性アッセイは、いくつかの欠点を有する。まず、これらのアッセイにおけるタンパク質は、しばしば、それらの内因性の環境において発現されるのではなく、異なる種由来の細胞組織培養において、時には。その安定性はコンテキスト依存であるタンパク質については、このアプローチには問題がある。第二に、時間をかけて、個々の細胞または生物におけるタンパク質のクリアランスに追従することができず、これらのアッセイからのデータは、異なる時点で細胞の異なる集団の平均を反映している。個々の細胞が開始している可能性があるのでタンパク質の異なる量、異なる時間に放射性標識またはシクロヘキシミドを取り上げてもよいし、異なるクリアランス速度を有していてもよく、そのような集計データは誤解を招く可能性がある。最後に、シクロヘキシミドチェイス実験の場合、タンパク質合成阻害剤の添加は、人為的にタンパク質の安定性16-18を変えることができ、意図しない生理学的効果を有することができる。これらの欠点は、光変換（FDAP）後に蛍光減衰を使用して（FDAP技術の限界のための説明を参照）、生物19-25で動的にタンパク質クリアランスを測定するためにphotoconvertibleタンパク質を利用して技術を避けることができる。 Photoconvertibleタンパク質は、その励起および発光特性は、光26の特定の波長に暴露された後に変更蛍光タンパク質である。 1つの一般的に使用される変形はDendra2、最初にEXを持つ「グリーン·ツー·赤」photoconvertibleタンパク質である緑色蛍光タンパク質と同様の引用及び発光特性が、UV光- 「光変換」 -そのへの曝露後に、励起/発光特性は、赤色蛍光タンパク質23,27と同様になる。重要なことは、光変換後に生成新しいタンパク質はphotoconvertedタンパク質の唯一のプールの光変換時の生産とクリアランスのデカップリングと観察を可能にphotoconvertedタンパク質と同じ励起/発光特性を持っていません。 photoconvertibleタンパク質と目的のタンパク質にタグを付けるため、そのまま、光学的にアクセス可能な生物中のタンパク質ラベルのパルスに便利な方法を提供します。 FDAPアッセイ（ 図1A）において、目的タンパク質はphotoconvertibleタンパク質でタグ付けされ、生体（ 図1B）で表さ。融合タンパク質はphotoconvertedされ、経時photoconvertedシグナルの減少はfluorescenによって監視されているCE顕微鏡（ 図1C）。データは、その後、融合タンパク質（ 図1D）の半減期を決定するために適切なモデルが取り付けられている。 ここで説明FDAPアッセイは、初期胚発生19時のゼブラフィッシュ胚における分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞外半減期を決定するために設計されました。しかし、このアプローチは、ライブイメージングを許容し、かつ任意のタグ付け、細胞内または細胞外タンパク質のクリアランスを監視するために使用することができる任意の透明なモデル生物に適合させることができる。ここに記載の技術の変形は、培養細胞20,23およびショウジョウバエ 22及びマウス21胚で行われている。

<table><tbody><tr><td>PyFDAP(次のサイトからダウンロードします webサイト:http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>PyFDAPのWebサイトに記載されている指示を使用してインストールおよび操作します。PyFDAPは、Linux、Mac、およびWindowsオペレーティングシステムと互換性があります。</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 転写キット</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>胚への注入用キャップ付きmRNAの生成</td></tr><tr><td>Alexa488-デキストランコンジュゲート、3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>mRNAとの共注入により、細胞内および細胞外マスクを作成</td></tr><tr><td>6ウェルプラスチックディッシュ</td><td>BD Falcon</td><td></td> ア<td>ガロースコーティングされたウェルで胚をインキュベート 胚培地のマウント準備が整うまで</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>250 mg / Lインスタントオーシャンソルト、1&nbsp;NaHCO3ProteaseでpH 7に調整した逆浸透水中のmg / Lメチレンブルー</td></tr><tr><td>Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td> 5 <td>mg / mlストックを作成し、1&nbspで使用します。mg/ml 1細胞期の胚をデコリオネートする</td></tr><tr><td>直径5cmのガラス製ペトリ皿</td><td></td><td></td><td>胚のデコレーション用</td></tr><tr><td>200ml ガラスビーカー</td><td></td><td></td><td>胚のデコレーション用</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション装置</td><td></td><td></td><td>1細胞期の胚にmRNAと色素を注入するため</td></tr><tr><td>ステレオマイクロスコープ</td><td></td><td></td><td>胚</td></tr><tr><td>の注入とマウント用1x Danieau's medium</td><td></td><td></td><td>低融点アガロースを希釈し、この培地でイメージングを行います。レシピ: 58 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.4 mM MgSO4、0.3 mM CaCl2、5&nbsp;mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure 低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>胚のマウント用; ダニオー培地で 1% の濃度で使用: 200 mg を 20 ml ダニオー培地に加え、マイクロ波で溶解するまで加熱し、1&nbsp;mlを微量遠心チューブに入れます。アリコートは4°Cで保存できます。C、70°Cで再溶解。&deg;C、および40&#8211に冷却。42度;C 使用する準備ができたとき</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>キンブルチェイス (フィッシャー経由)</td><td>63A53WT</td><td>胚の取り付け用; ギザギザのエッジが胚を傷つけるのを防ぐために先端を炎で覆ってください</td></tr><tr><td>金属プローブ</td><td></td><td></td><td>取り付け中に胚を位置決めするため</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>目的に適したカバーガラスの厚さを使用してください。ここに記載されている部品番号はカバーガラスNo.1.5用です</td></tr><tr><td>~5 mlの胚培地</td><td>BDファルコン</td><td></td>で満たされた15 mlチューブ <td>パスツールピペットからの残留アガロースをすすぐため</td></tr><tr><td>倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>水銀アークランプ、488&nbsp;nmレーザー、543nmレーザー、および適切なフィルターセットが必要です</td></tr><tr><td>加熱ステージ</td><td></td><td></td><td>胚を28°Cの最適温度に維持するには;実験中のC</td></tr><tr><td>タイムラプスイメージング</td><td></td><td></td>が可能な共焦点ソフトウェア <td>複数の位置を定義し、定義された間隔で自動的に画像化できる必要があります&nbsp;</td></tr><tr><td>25Xまたは40X水対物レンズ</td><td></td><td></td><td>イメージング用対物レンズ</td></tr><tr><td>10X空気対物レンズ</td><td></td><td></td><td>光変換用対物レンズ</td></tr><tr><td>浸漬油</td><td></td><td></td><td>水と同じ屈折率の浸漬油</td></tr></tbody></table>

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（fdap）

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

タンパク質の安定性は、生物学の多くの側面に影響を与える、タンパク質のクリアランス速度を測定することは、生物学的システムへの重要な洞察を提供することができる。 FDAP実験では、生物内のタンパク質のクリアランスを測定することができる。目的のタンパク質は、photoconvertible蛍光タンパク質でタグ付けされ、インビボで発現され、photoconverted、経時photoconvertedシグナルの減少がモニターされる。データは、その後、タンパク質の半減期を決定するための適切なクリアランスモデルが取り付けられている。重要なのは、生物の異なる区画におけるタンパク質の集団のクリアランス動態コンパートメントマスクを適用することによって、別々に検査することができる。このアプローチは、ゼブラフィッシュの開発中に分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定するために使用されてきた。ここでは、ゼブラフィッシュ胚におけるFDAP実験のためのプロトコルについて説明します。それのクリアランス速度を決定するFDAPを使用することが可能であるべきであるすべての光学的にアクセス可能な生物内の任意のタグ付けタンパク質。

FDAPはゼブラフィッシュ胚19における細胞外シグナル伝達タンパク質の半減期を決定するために使用されてきた。これらのタンパク質のいずれか、スクイントは、胚形成34中胚葉遺伝子の発現を誘導する。目を細め-Dendra2は定量RT-PCRによっておよびin situハイブリダイゼーションアッセイ19 で示したように 、タグの付いていない目を細め同様のレベルで中内の遺伝子の発現を活性化する。胚のAlexa488デキストランおよびmRNAはスクイント-Dendra2をコードするとFDAPアッセイに供と共に同時注入した。経時的な細胞外photoconvertedシグナル強度の減少が明らかである（ 図4A）。 23の胚からの細胞外強度プロファイルはPyFDAPを使用して生成された。得られたデータは、一次クリアランス動態をPyFDAPに装着し、そして116分間の平均半減期τに ​​対応する1.00×10 -4 /秒の平均クリアランス速度定数kは 、決定された...

細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

次の実験の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの胚における細胞内および細胞外タンパク質の安定性を測定することです。これは、目的のタンパク質に光変換可能な蛍光タンパク質をタグ付けし、融合をコードするmRNAと蛍光色素をゼブラフィッシュの胚に注入することで達成されます。次に、光変換融合タンパク質が光変換され、パルスがタンパク質を標識します。この例では、融合タンパク質が分泌され、その後、細胞内および細胞外の光変換された蛍光強度の崩壊を経時的に監視し、指数関数的に減少する関数を装着して、融合タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定します。この結果は、光変換融合タンパク質のin vivo安定性を、時間の経過に伴う蛍光シグナルの減衰に基づいて示しています。この方法は、細胞生物学および発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、安定性がタンパク質の分布と利用可能性にどのように影響するかなどです。FD DPデータの解析には、当社のソフトウェアEPを使用しています。EPは、当社のウェブページで無料で入手できます:コード化してキャップ付きmRNAを生成した後、関心のある緑から赤への光変換融合タンパク質をコード化し、約31の細胞段階のゼブラフィッシュ胚を直径5センチメートルのガラスまたは寒天ローズコーティングプラスチックペトリ皿に約8ミリリットルの胚培地を移します。あらかじめ調製して解凍したプロナイストック溶液2ミリリットルを皿に加え、室温で5〜10分間インキュベートします。ガラススピーカーに胚培地を入れ、胚を空気やプラスチックにさらさないようにしながら、ペトリ皿を傾けて胚をビーカーに移し、培地に沈めます。胚がビーカーの底に落ち着いたら、培地の大部分を注ぎ出し、新鮮な培地を使用して慎重に交換します。新鮮な培地の穏やかな渦巻きは、胚が弱くなったコリオンを失う原因となります。洗浄を繰り返した後、先端が炎状になったガラスPEピペットを使用して、コーティングされた胚をアガロースコーティングされた注射皿に移します。次に、mRNAと3キロダルトンのAlexa 4 88 DExTストランドコンジュゲートを細胞の中心に直接共注入して、mRNAと色素が均一に分布するようにします。卵割が始まったら、注入した胚を胚を充填した6ウェルプラスチック皿の1〜2%アガロースコーティングウェルに移し、胚が実体顕微鏡で後期球体に達するまで摂氏28度の暗闇でインキュベートし、1〜5個の健康な胚を特定し、炎の先端が付いたガラスPEピペットを使用して皿からそれらを除去します。1 x danios胚培地中の約1ミリリットルの溶融1%低融点AROSを含むマイクロ遠心チューブに胚を穏やかに排出します。次に、胚をいくつかのアロと一緒にピペットに戻します。次に、アロと胚をカバーにそっと排出します。ガラス底皿のガラス。ガラスピペットを再利用するには、胚培地をすばやくピペッティングして目詰まりを防ぐため、残留アロを清掃し、アロが固まる前に迅速に作業します。金属プローブを使用して、動物のポールが実体顕微鏡の下のカバーガラスに面するように胚を配置します。胚の位置を監視し、アガロが固まるまで必要に応じて再調整します。アガロが固まったら、1つのx danios胚培地を使用してガラス底皿を満たします。写真変換の準備として、インキュベーターを摂氏28度に設定し、対物レンズに大量の浸漬油を垂らして、ステージが異なる胚位置に移動するときに対物レンズとカバーガラスの間の油膜が壊れないようにします。イメージングを確実に行いながら、ステージが動いたときに皿がずれないように、ガラス底の皿をステージに置きます。次に、共焦点顕微鏡のソフトウェアパッケージで、各胚の位置を定義します。各胚のZ深度を調整し、4 88 ナノメートル レーザーと 5 43 ナノメートル レーザーの両方を使用して、各胚のほぼ同じ平面を標的にしようとします。写真変換前の画像を取得します。次に、共焦点顕微鏡ソフトウェアを設定して、事前に定義した各位置を適切なイメージング条件でイメージングします。10分または20分または5時間の時間経過ごとに、融合タンパク質スイッチを10倍対物レンズに変換し、胚のグループを水銀ランプからの紫外線に約300〜400ナノメートルのフィルターで100%出力で2分間さらします。Z軸に沿ってフォーカスをずらすと、写真変換ごとに均一な写真変換が促進されます。すぐに25 x または 40 x の対物レンズに切り替えて、以前に定義した位置がまだ正確であることを確認します。写真変換中に皿がずれた場合は、胚の位置を再定義します。イメージングタイムコースを開始し、5時間実行します。各胚の写真変換からイメージング開始までの経過時間に注意してください。時々実験をチェックし、ダニエルの培地のレベルを監視し、必要に応じてさらに追加します。まず、各胚の時系列データセットを視覚的に調べることから始めます。イメージング中に死亡した胚で、大幅にシフトした胚、光変換されたシグナルのレベルが非常に低い胚、または異常に見えて移動と分裂が停止した細胞の領域を含む胚のデータセットは破棄します。PI F DAPは、Pythonベースのソフトウェアパッケージを使用して、Alexa 4 88信号(厳密には細胞内)を使用してマスクを作成します。細胞内および細胞外の写真変換されたシグナルを分離するには、対応する赤チャネル画像にマスクを適用して、細胞内ピクセルが考慮されないようにします。平均細胞外強度を計算するために平均細胞外強度を測定する場合は、マスクを反転し、生成されたマスク画像を表示し、それらを視覚的に検査し、マスクが細胞内空間と細胞外空間を正確に区別しないデータセットを破棄します。PI F DAPを使用して、各画像の平均細胞外および細胞内蛍光強度を計算します。次に、テキストプロトコルのガイドラインに従って、ここに示されているように蛍光データを適合させ、細胞外および細胞内タンパク質を計算します。クリアランス率から半減命タウ。コンスタンスKスクイントは、ゼブラフィッシュの胚発生時にミス内胚葉遺伝子の発現を誘導する分泌タンパク質です。この実験では、胚にAlexa 4 88デキストランとmRNAをコードするsquint DENDRA twoを同時注入し、F DAPアッセイを行いました。このように、細胞外光変換された信号強度は時間とともに減少します。PI F dapを使用して、23の胚から細胞外強度プロファイルを生成し、データに一次クリアランスモデルを適合させました。その結果、平均半減期タウは116分でした。強度プロファイルとタンパク質が類似しています。半減期は、イメージングの間隔が10分または20分の場合に得られました。写真の漂白や不注意による写真の変換が強度の変化に大きく寄与しなかったことを示唆しています。このビデオを見た後、写真変換後の蛍光減衰の使用方法をよく理解しているはずです。in vivoで測定する。生きたゼブラフィッシュ胚における光変換融合タンパク質の半減期。

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ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

学ぶ光変換後蛍光減衰法（FDAP）を用いて、生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の細胞内外安定性を測定する方法。この技術は細胞生物学と発生生物学の研究に有用です。

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

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