同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射
2015年7月7日
ここでは、薬物のマイクロインジェクションによる脳深部構造の阻害と、同時の電気生理学的記録によるその影響のリアルタイムモニタリングという2つの機能を備えたガラスピペットを作ります。
この手順の全体的な目標は、マルチユニットのニューロン活動を監視しながら、ラットの上丘に神経伝達物質をマイクロ注射するための手頃な価格の注入道路を構築することです。これは、最初にガラスキャピラリーと垂直マイクロピペットプーラーを使用してガラスピペットを作成することによって達成されます。2番目のステップは、銀線をキャピラリーに挿入し、先細りでない端からワイヤーの一部が突き出ています。
次に、接着剤を使用して、ガラスピペットと皮下注射針との間にしっかりと密閉します。最後のステップは、鉱油で満たされたマイクロシリンジに取り付けられ、マイクロインジェクターに固定されたシカゴスカイブルーのGABA溶液をピペットに充填することです。最終的に、アクセス可能で手頃な価格の部品を使用した注射液のこの構造は、薬物の注射前、注射中、および注射後の不活性化領域のニューロン活動を記録しながら、脳深部構造を不活性化するために使用できます。
この手法には、ガスベースの圧力パルスや光注入システムなどの他の既存の方法に比べて、いくつかの利点があります。1つは、薬物送達を機能ベースで制御できるコスト効率の高い方法であり、過剰注入による組織損傷を抑制できることです。このシステムが提供するもう一つの利点は、神経不活性化の時間的要素を効率的に制御できる複合記録機能です。
記録用インジェクションピペットを準備するには、まず、外径1mmの7センチのキャピラリーを引っ張ります。セブン20または同様のユニット。ヒーターを18に、ソレノイドを次に1つに設定し、手袋を着用して手動で先端を壊して開口部を作り、内径が30〜40マイクロメートルであることを顕微鏡で確認します。
ファインダーの定規でこれを測定します。0.3〜0.6メガオームの比較的低いインピーダンスを生成します。次に、先細りになっていない端から、銀線をピペットの長さ約7センチメートルに挿入し、ピペットから1〜2センチぶら下げたままにします。
この余分なワイヤーをキャピラリーに対して直角に曲げます。次に、30ゲージの皮下注射針を取り、シャフトに柔軟なプラスチック接着剤を塗布します。次に、針をゆっくりとピペットに挿入します。
可能な限り。接着剤をさらに追加して、ピペットとニードルの間の接合部にシールを作成します。ピペットの先端を上にして、アセンブリを約12時間乾燥させます。
麻酔をかけ、ラットを定位固定装置フレームに入れた後、眼科用軟膏を塗布し、頭をきれいに剃ります。局所麻酔薬を適用し、麻酔の手術面を確認した後、10番のメスブレードを使用して中央値に沿って頭皮を切開します。これにより、冠状縫合糸と矢状縫合糸が露出します。
次に、外科的ヘラを使用して、ラムダとbgmaの解剖学的参照を特定します。これらのランドマークが同じ水平面で水平になるように、ヘッドの位置を調整します。次にゼロ、bgmaのガラス管のような細かい硬いポインター。
次に、bgma の座標を使用して、チューブの位置を関心のある位置に調整します。シャーピーを使用して、開頭術のターゲット領域の周りに正方形を描きます。次に、外科的滅菌ドリルを使用して、マークに沿って骨をゆっくりと取り除きます。
できるだけ圧力をかけずにドリルを動かし続け、骨が薄くなったときに摩擦による頭部による組織の損傷を避けるために、ピンセットで正方形の部分を慎重に取り除きます。Dora MAは、注入液が前方に浸透するため、取り外す必要はありません。露出した皮質を脳脊髄液で洗浄したままにします。
最初に5〜10マイクロリットルのシリンジに鉱油を充填して、注入液を準備します。次に、生理食塩水中の色素で目的の薬物を調製します。ここでは、0.5%シカゴのスカイブルーが300マイクロモルのガバと混合されています。
次に、最初に1ミリリットルのシリンジに調製した溶液をロードし、次にシリンジを使用してピペットをロードして、インジェクションピペットを充填します。シリンジを取り外すときは、プランジャーに軽い圧力をかけたままにして、真空が注入道路から溶液を取り除かないようにします。漏れの可能性のあるポイントで液体が漏れていないか確認してください。
余分な液体を拭き取り、漏れがないか再確認してください。次に、鉱油を入れたマイクロスシリンジを注入ロードに取り付けます。次に、余分な溶液を拭き取ります。
ガーゼ付き。インジェクションチップを確認してください。それを通して溶液の小さな滴を流すことが可能であるべきです、さもなければそれはブロックされるか、または今インジェクターをマイクロポンプシステムにしっかりと取り付けます。
次に、注入道路の位置をターゲット座標に移動し、電極を上眼コルスまで下げます。これは、視覚的に誘発された電位の記録を通じて識別できます。電極を下げた状態で、目詰まりを防ぐために、低注入率で小さな正圧を加えます。構造に到達したら、インジェクションを中断します。
注射液を挿入した後、露出した皮質を温かい寒天で覆い、乾燥を防ぎます。電極の最終的な配置後、電極の周囲の組織が安定するまで30分待ちます。次いで、上眼烹におけるニューロン活動の活性化まで、毎分40ナノリットルの速度で400〜800ナノリットルの溶液を注入し、電極は抑制性溶液の注入中にスパイクの減少を示すべきである。
視覚的に誘発される電位は、上絨毛で得られました。ギャバの注射時に対側眼に300ミリ秒の閃光が走った後、閃光刺激に反応したスパイク活動は45〜60分間抑制されました。この手順に立ち会う際には、装填中に漏れがないか確認し、薬剤溶液が注入チップ内を自由に流れていることを確認することが重要です。
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概要
この記事では、深部脳構造を抑制するための薬物投与と電気生理学的記録を通じたニューロン活性のモニタリングという二重目的のために設計されたガラスピペットの構築について説明します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 神経薬理学
背景
- 深部脳構造の理解は神経科学研究にとって重要です。
- マイクロインジェクションにより、標的となる薬物投与が可能になります。
- 薬物投与中のニューロン活性の同時モニタリングにより、データの正確性が向上します。
- 手頃な価格のツールにより、より広範な研究応用が可能になります。
研究目的
- 神経伝達物質のマイクロインジェクションのための費用対効果の高い方法を作り出す。
- 薬物投与中の多単位ニューロン活性をモニタリングする。
- 神経科学における実験技術のアクセシビリティを向上させる。
使用した方法
- ガラス毛細管を用いたガラスピペットの構築。
- 電気記録用の銀線の挿入。
- ピペットを皮下針に接着剤で密閉する。
- ピペットをマイクロインジェクション用のGABA溶液で満たす。
主要な結果
- 構築されたピペットは、ラットの上丘に効果的に薬物を投与しました。
- ニューロン活性の同時記録を成功裏に得ました。
- この方法は、標的脳構造の不活性化において信頼性を示しました。
- 結果は、神経科学研究におけるより広範な応用の可能性を示しました。
結論
- この二重機能ピペットは神経科学研究のための貴重なツールです。
- 薬物投与とニューロン活性のリアルタイムモニタリングの両方を可能にします。
- このアプローチは、神経薬理学における実験結果を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables real-time functional validation of drug effects on neuronal circuits, supporting target de-risking in early neuropharmacology discovery. By combining microinjection with electrophysiological readout, it provides mechanistic confidence for inhibitory compound screening. The approach offers a low-cost, adaptable platform for probing brain region-specific pharmacodynamics prior to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets through site-specific drug delivery and concurrent neuronal activity monitoring.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven validation of neuronal pathway involvement in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time electrophysiological readouts as functional biomarkers of drug engagement.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through reproducible microinjection and recording parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges in vitro findings to intact circuit function by validating drug effects in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Supports go/no-go decisions by linking target inhibition to measurable changes in neural network activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement and functional consequence must be established before compound advancement.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by confirming that target modulation produces expected electrophysiological outcomes.
- Screening: Enables primary screening of inhibitory agents using neuronal silencing as a functional readout.
- Analytics: Provides spike suppression metrics and latency-to-effect measurements for compound comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by demonstrating target-mediated effects in vivo.
- Enterprise Reuse: The injectrode design is adaptable across brain regions and chemical compounds, supporting broad reuse in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking pharmacological intervention to functional neural output.
- Operational Value: Reduces reliance on separate injection and recording systems, improving workflow efficiency and data synchronization.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by minimizing false positives through functional target confirmation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent electrophysiological responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electrophysiology, and stereotaxic targeting.
- Depends on access to microinjectors, amplifiers, and signal acquisition systems capable of multi-unit recording.
- Necessitates standardization of injection volumes, rates, and post-injection stabilization periods across studies.
- Adaptation to different brain regions may require recalibration of coordinates and electrode positioning.
- Potential limitations include tissue damage from repeated insertions and variability in seal integrity affecting drug delivery accuracy.
