同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

本手順の最終的な目的は、マルチユニット神経活動をモニタリングしながら、ラットの上丘に神経伝達物質を微量注入するための、安価な注入路を構築することである。まず、ガラスキャピラリーと垂直マイクロピペットプラーを用いてガラスピペットを作製する。次に、銀線をキャピラリーに挿入し、非テーパー端から線の一部を突き出させる。

次に、ガラスピペットと皮下注射針の間を密閉するために接着剤を使用します。最終ステップとして、マイクロインジェクターに固定し、ミネラルオイルを満たしたマイクロシリンジに接続したピペットに、シカゴスカイブルーで着色したGABA溶液を満たします。最終的に、入手可能で安価な部品を用いて構築されたこの注入装置により、薬物注入前、注入中、および注入後の不活性化領域のニューロン活動を記録しながら、脳深部構造を不活性化させることが可能になります。

この手法には、ガスベースの圧脈パルスや光注入システムなどの他の既存の手法と比較して、いくつかの利点があります。一つは、薬剤投与を機能的に制御できるコスト効率の高い方法であることで、これにより過剰注入によって引き起こされる組織損傷を抑えられます。もう一つの利点は、記録機能を兼ね備えていることであり、神経不活性化の時間的要素を効率的に制御することが可能です。

記録用注入ピペットを準備するために、まず外径1 mm、長さ7 cmのキャピラリーを、Cop Verticalモデル（Seven 20または同様の装置）でプルします。ヒーターを18に、ソレノイドを1に設定します。次に、手袋を着用し、手動で先端を折って開口部を作成し、顕微鏡下で内径が30〜40 µmの間であることを確認します。

ビューファインダーの定規を用いてこれを測定します。これにより、0.3から0.6 MΩという比較的低いインピーダンスが得られます。次に、テーパーのない端から、長さ約7 cmの銀線をピペットに挿入し、1から2 cm分をピペットの外に出したままにします。

この余分なワイヤーをキャピラリーに対して直角に曲げます。次に、30ゲージの皮下注射針を用意し、シャフトに柔軟性プラスチック接着剤を塗布します。その後、ゆっくりと針をピペットに挿入します。

可能な限り、ピペットと針の接合部に接着剤を追加してシールを作成します。ピペットチップを上にした状態で、アセンブリを約12時間乾燥させます。

ラットを麻酔し、脳定位固定装置に固定した後、眼軟膏を塗布し、頭部をきれいに剃毛します。局所麻酔を施し、外科的な麻酔深度にあることを確認した後、10番のメスを用いて正中線に沿って頭皮を切開します。これにより、冠状縫合と矢状縫合が露出します。

次に、外科用スパチュラを用いて、Lambdaおよびbgmaの解剖学的指標を確認します。これらの指標が同一の水平面上で揃うように頭部の位置を調整します。その後、ガラス管のような細い剛性ポインターをbgma上のゼロ点に合わせます。

次に、bgmaの座標を用いて、チューブの位置を目的の場所に調整します。シャーピーを使用して、開頭術の標的領域を囲む正方形を描きます。次に、滅菌済みの外科用ドリルを使用し、印に沿ってゆっくりと骨を除去します。

骨が薄くなった際に摩擦によって生じるヘッド起因の組織損傷を避けるため、可能な限り弱い圧力をかけ、ドリルを動かし続けてください。その後、ピンセットを用いて四角い部分を慎重に除去します。注入液はそのまま透過するため、Dura MAを除去する必要はありません。露出した皮質は脳脊髄液で灌流し続けてください。

まず、5～10 µL シリンジにミネラルオイルを満たして注射液を準備します。次に、生理食塩水を用いて、染料を加えた目的の薬物を調製します。ここでは、0.5% Chicago sky blue を 300 µM GABA と混合します。

次に、まず1 mLシリンジに調製した溶液を充填し、そのシリンジを用いて注入用ピペットに充填します。シリンジを取り外す際は、プランジャーに軽く圧力をかけ続け、真空状態によって注入路から溶液が吸い出されないようにしてください。漏れが生じやすい箇所で液漏れがないか確認します。

余分な液体をスワブで吸い取り、漏れがないか再確認します。次に、ミネラルオイルを満たしたマイクロシリンジを注入路に取り付けます。その後、余分な溶液を拭き取ってください。

ガーゼを用いてください。注入チップを確認します。溶液が小さな滴となって流れる必要があります。流れない場合は詰まっているため、対処してください。その後、インジェクターをマイクロポンプシステムにしっかりと取り付けます。

次に、注入路の位置を目標座標まで移動させ、電極を上丘まで降ろします。上丘は視覚誘発電位の記録によって特定できます。電極を降ろす際、閉塞を防ぐために低流量で注入を行い、わずかな正圧をかけます。目的の構造に到達した時点で注入を停止してください。

注入後、乾燥を防ぐために露出した皮質を温かいアガロースで覆います。電極を最終的な位置に配置した後、電極周囲の組織が安定するまで30分間待ちます。その後、溶液を40 nanoliters/minの速度で400から800 nanoliters注入し、上丘の神経活動が活性化することを確認します。抑制性溶液の注入中は、電極でスパイクの減少が認められるはずです。

上丘において視覚誘発電位を測定した。GABAの注入後、対側眼に300ミリ秒間のフラッシュ刺激を与えたところ、フラッシュ刺激に応答するスパイク活動が45〜60分間にわたり抑制された。この手順を行う際は、充填時の漏れがないかを確認し、薬液が注入チップからスムーズに流れていることを検証することが重要である。