膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

次の実験の全体的な目標は、電位依存性イオンチャネルを巨大なユニラメラ小胞に組み込み、パッチクランプ測定でそれらの活性を特徴付けることです。これは、まずイオンチャネルKVAPを含む小さな小胞の溶液を部分的に脱水して脂質タンパク質膜を作成することによって達成されます。次に、脂質膜が再水和され、チャネルを含む細胞サイズの巨大なALR小胞またはgvの形成と増殖を引き起こします。

その後、GVを記録チャンバーに移し、イオン電流を測定するためにパッチピペットでGUV膜の一部を切り取ります。その結果、電流記録の解析に基づいて、GUV膜のイオンチャネルが膜電圧の変化に応答して活性化することがわかりました。巨大な片側性物理学は、膜タンパク質相互作用に関連する生物物理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、膜貫通タンパク質と脂質膜の物理的特性との相互作用などです。この方法は、電位依存性鉄チャネルKVAPの機能についての洞察を提供することができますが、他の鉄チャネル、トランスポーター、ポンプ、および一般的に膜貫通タンパク質にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、巨大な小胞の操作を含むステップと同様に重要です。

記事を読むだけのピックアップ方法溶液とKVAPを含む小さな単一小胞を準備した後。テキストプロトコルに従って、最初に穴にワイヤーを挿入し、ワイヤーを回転させて拭き、窒素または空気の流れの下で清潔で日光が降り、乾燥していることを確認します。テキストプロトコルに記載されているように、SUVバッファーに3ミリグラム/ミリグラムのSUVサスペンションの30マイクロリットルを準備し、溶液を激しく混合してSUV溶液を堆積させます。

2マイクロリットルのピペットまたは5マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、SUV溶液の小さな液滴をワイヤーに置きます。液滴が十分に小さく、接触したり融合したりしないように十分に間隔を空けていることを確認してください。堆積したSUVを屋外で約30分間乾燥させます。

液滴が落ち着いたら、ワイヤーを回転させて、顕微鏡で脂質沈着物を観察しやすくなります。次に、シリンジを使用してチャンバーの底に3つのウェルの周りの真空グリースを塗布し、40ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップをそっと押し付けてチャンバーの底を密閉し、隙間なく密着させます。次に、天井ペーストを使用してチャンバーの側面をシールし、チャンバーの上部に3つのウェルの輪郭を描く真空グリースを塗布します。

各ウェルが上部まで満たされるまで、成長バッファーをゆっくりと追加します。これにより、ウェル内の溶液が急速に移動することは避けてください。脂質フィルムを電極から剥がします。

トップカバースライドをグリースにそっと押し付けて、チャンバーを閉じます。底面カバーのスリップが外れないように注意してください。2つのワニ口クリップを使用して、信号発生器をワイヤに接続します。

使用するバッファの塩分濃度に応じて周波数を設定し、マルチメータ測定でワイヤ間の電圧を調整します。また、バッファーに応じて、アルミホイルを使用してチャンバーを覆い、フローラフォーを光から保護します。G UUVを低塩分バッファーで2〜3時間、高塩分バッファーで12時間または一晩成長させます。

インキュベーション後、チャンバーをジェネレーターから切り離し、倒立顕微鏡に慎重に置きます。GUV成長プラズマを評価するには、カバースライドを1分間清掃して、ARO溶液がきれいに広がるようにします。カバースライドをクリーニングしてから15分以内に、テキストプロトコルに従って調製された200マイクロリットルの温かいaro溶液を塗布して、表面全体を濡らします。

スライドを垂直に傾け、ティッシュの下端に触れて余分な液体を取り除き、スライドに薄く滑らかなアロスの層を残します。スライドを60°Cのホットプレートまたはオーブンに置き、少なくとも30分間乾燥させます。次に、AROSコーティングされたカバースリップを標準の3.5cmのシャーレに入れます。

次に、SUV溶液を調製した後、約15マイクロリットルを約30個の非常に小さな滴でaros表面に静かに塗布します。アロス層を歪めすぎないように注意してください。スライドを穏やかな窒素の流れの下に約10〜15分間置き、バッファーの蒸発を目視で追跡します。

SUVが乾くとすぐに液滴が乾くので、スライド面を覆うために約1ミリリットルの成長バッファーを追加します。腫れを約30分間進行させてから、位相差またはDICを備えた倒立顕微鏡を使用して、成長チャンバー内のGU UUVの成長を調べ、パッチクランプgu UUVは、ガスが付着するのを防ぐ1ミリグラムあたり5ミリグラムのベータカイン溶液を追加してチャンバーを食べました。 広がり、破裂します。5分間インキュベートしてすすぎ、接地電極を挿入し、観察バッファーを使用してチャンバーを満たします。

次に、G UUVを電気形成GU UUV用の観察室に移します。トップカバースリップをそっと取り外して、成長チャンバーを開きます。ピペットチップを各ワイヤーの真上に置き、GU UUVを取り外すには、ピペットチップをワイヤーに沿って動かしながら約10マイクロリットルをゆっくりと吸引し、ゲルアシスト膨潤GU UUVを実現します。

まず、ペトリ皿の側面を数回軽くたたいて、GU UUVをカバースリップ面から取り外します。ピペットチップをカバースリップのすぐ上に置き、10マイクロリットル吸引しながらチップを表面に戻して、採取したGVSを直接観察チャンバーに移します。ガスが底に落ち着き、GVSをパッチクランプするまで数分待ちます。

観察バッファを使用して新しいパッチピペットを充填し、パッチクランプヘッドステージに取り付けます。チャンバー内を検索して欠陥のないGUVを見つけ、蛍光タンパク質が含まれていることを確認します。パッチピペットの内部を清潔に保ち、パッチピペットをチャンバーに挿入して、100パスカルを超える一定の正圧を適用します。

パッチピペットを視野に入れ、テストパルスを適用して、ピペットの電圧オフセットと抵抗を測定または補正します。次に、蛍光灯の下でピペットを調べて、チップが汚れていないことを確認します。パッチピペットをGUVに近づけ、必要に応じて同時に正圧を下げて、パッチピペットからの外向きの流れがGUVを暴走させないようにします。

パッチピペットがGUVに近づいたら、負圧を加えてGUVをパッチピペットに引き付けます。GUVメンブレンの舌がパッチピペットに入り、ギガシールが形成される際の抵抗を監視します。裏返しのメンブレンパッチがGUVから切除され、ギガシールが安定したら、テストパルスをオフにし、テキストで概説されているように電圧プロトコルを適用します。

この図は、欠陥のないGUVのDICおよびエピ蛍光画像を示しています。GUVメンブレン内の均一なタンパク質蛍光は、KVAPが脂質膜に留まるのではなくGUVに取り込まれ、ここで見られる3つの方法を使用して生成されたGusが凝集体を形成していないことを裏付けています。蛍光脂質シグナルとタンパク質シグナルは同じ平均密度にスケーリングされているため、タンパク質密度が低いまたは高いg UUVはオーバーレイ画像でマゼンタまたは緑の色合いになり、平均タンパク質密度のGVSは白色になります。

単離された欠陥のないG UUVが同定され、GUVサイズ分布がここに示されている。通常、エレクトロフォーミングはゲルアシスト膨潤よりも欠陥のないG UUVを生成しますが、エレクトロフォーミングによって生成されるGUSは小さくなります。ここに示されているのは、GUV蛍光から推測されるタンパク質密度分布です。

高塩緩衝液によるエレクトロフォーミングは、さまざまなタンパク質密度のGU UUVを生成します。密度は、低塩緩衝液による電気形成の場合、はるかに変化が少なく、ゲルによって生成されるGU UUVのタンパク質密度は、切除されたパッチ内のタンパク質濃度に応じて非常に均一です。電流トレースは、1つのチャンネルまたはチャンネルのアンサンブルのいずれかを示しています。

KVAPは電圧依存の開口部を示します。この手順を試みるときは、純粋な浸透圧ストレスに耐性のない壊れやすい物体の巨大な小胞を覚えておくことが重要です。この手順に続いて、脂質ナノチューブを引っ張るなどの方法を実行して、タンパク質の曲率検出などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、機能的に再構成されたタンパク質を含むGVSの作り方を十分に理解できるはずです。