Name: 膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶ電位依存性イオンチャネルKvAPの巨大単膜小胞への再構成とパッチクランプ計測による機能解析。膜タンパク質の挙動とイオン電流特性を詳細に評価する手法です。

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アガロース膨潤によるタンパク質の再構成の可能性について議論してくださったSusanne Fenz氏、現在の測定についてFeng Ching Tsai氏、そしてBassereauグループの現在および過去のメンバーの支援と援助に感謝します。このプロジェクトは、Agence Nationale de la Recherche(助成金BLAN-0057-01)、欧州委員会(NoE SoftComp)、ピエール・エ・マリー・キュリー大学(FED21、Dynamique des Systèmes Complexesからの助成金)から資金提供を受けました。M.G.は、Institut Curie International PhD Fellowship, S.A.、Fondation pour la Recherche Médicaleからのフェローシップ、G.E.S.T.、欧州委員会のMarie Curie Incoming International Fellowship、ピエール・エ・マリー・キュリー大学からの助成金の支援を受けました。掲載料はLabexの「CelTisPhyBio」(ANR-11-LABX0038)が負担しました。

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<li>Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Voltage+Dependent+Proteins+with+Giant+Unilamellar+Vesicles+in+a+%E2%80%9CWhole+Cell%E2%80%9D+Configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 466a(2013).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

バイオミメティックモデル系は、タンパク質および膜の特性との相互作用を研究するための重要なツールである。 BLMSまたはサポートされている脂質膜、GUVベースのシステムかなりの膜組成、張力および形状の制御、ならびに真オイルフリーであることを含む本いくつかの機会のような他の再構成されたシステムと比較して。しかし、GUVsに、そのようなKvAPなどの膜貫通タンパク質を、組み込むことは、脂質のみGUVsための従来のプロトコルの重要な適応を必要とします。ここに提示エレクトロフォーメーションプロトコルは以前に特徴付けられ、湾曲した膜2,4,35に膜タンパク質の分布とダイナミクスの生物物理学的な原理を研究するために使用した。この作品はGUVs中のタンパク質の再構成のためのメソッドのセットへの追加、新しいゲル支援腫脹プロト​​コルを示しています。両方のプロトコルはKvAPの高い密度を含む欠陥のないGUVsを生成することができ、そしてインサイドアウトパッチの測定があることを確認SE GUVsは機能的なカリウム選択、電位依存性チャネルが含まれている。 2つのアプローチは異なる長...

生体系を支配する物理的原理を研究する際に、ボトムアップアプローチは、実験者は、システム構成および容易に細胞ベースのシステム1で操作されていない他のパラメータを制御することを可能にする。 10 -彼らは顕微鏡研究とマイクロマニピュレーション8に非常に適しているとして7 -膜ベースのプロセス、ジャイアントの単層ベシクル（GUVs、直径〜1-100μm）のために非常に有用な生体模倣システム2であることが証明された。 GUVsを生成するために、多くの異なるプロトコルが存在するが、大部分は2つのカテゴリーに分類さ- 16 -ベースのエマルジ ​​ョンは、脂質膜13を再水和に基づいて、11,12および技法に近づく。エマルジョンベースの方法では、GUV膜の内側と外側のリーフレットは、水/油界面での脂質単層から順に組み立てられる。このアプローチは、との可溶性タンパク質をカプセル化するための理想的ですGUVsで、非対称リーフレット脂質組成物を用いたGUVsを形成するため。しかし、エマルジ ​​ョンから形成GUVs、膜の機械的特性17を変更する微量の溶媒を保持することができ、そしてアプローチは、特に膜貫通タンパク質の再構成に適していない。 フィルム再水和法は、（脱水）を乾燥して膜の多層のスタックを形成する多くの脂質混合物を生じるという事実に依存している。このスタックは、その後水性緩衝液と接触させて配置されている場合は、スタック内の膜は、それらの間に、スタックの表面のような溶媒の流れを離れて移動し、個々の膜はGUVs 13,18（同様の真の動物園を形成するために取り外すことができる他の脂質のオブジェクト）。しかし、最適な緩衝液及び脂質組成物のために、この古典的な「自発膨潤」方法は、欠陥のないGUVs比較的低い収率を有する。無欠陥GUVsの収率を高めるために1つの広く使用されている方法は、「電鋳である交流電流（AC）フィールドは、フィルム再水和の間に適用される221 ;,。メカニズムはよくわかっていないままであるが、「電鋳「壮大なGUVの収量を与えることができます（&gt;有利な状況では90％）、低塩濃度バッファー用（&lt;5mm）を14,19、さらには（〜100 mM）の生理的緩衝液中で作業することができます使用して高い周波数（10 Hzの対500 Hz）の交流電界と白金電極15。無欠陥GUVsの収率を高めるための別のアプローチは、「ゲル支援膨潤」、脂質溶液はなく、古典的な「自発腫脹で使用される受動的な（ 例えば 、ガラス、PTFE）基板より高分子ゲル基材上に堆積されている&quot;。結果として得られる脂質/ゲルフィルムを再水和されると、GUVsは急速にも生理的なバッファ16,20のために形成することができる。 これら全ての方法は、次のような膜結合現象を研究するために使用することができる脂質のみGUVsを生成することができ可溶性タンパク質および膜との相互作用。しかし、GUVsに膜貫通タンパク質を組み込むために、重要な改変は、タンパク質が再構成手順の間、機能状態に留まることを確実にするために必要とされる。有機溶媒（ 例えば、クロロホルム、シクロヘキサン）中の脂質溶液は脂質膜を製造するための理想的であるが、それらの疎水性膜貫通ドメインが脂質二重層に埋め込 ​​まれた、または界面活性剤ミセルにより囲まれている場合に、膜貫通タンパク質は、（典型的にのみ安定している例えば、タンパク質精製の ​​間に）。したがって、再構成のための出発材料は、典型的には界面活性剤の除去によって形成されたネイティブの膜、洗剤溶液中で精製されたタンパク質、または小さな単層のタンパク質含有小胞（プロテオのSUV）および/またはマルチラメラ小胞（MLVはプロテオ）である脂質の存在。 GUVs、これらの膜タンパク質を組み込むために、ほとんどの方法は、3つのカテゴリーに分類される。 ダイレクトInsertionは洗剤に懸濁トランスメンブレンタンパク質は、予め形成された、脂質のみ、穏やか洗剤可溶化GUVsと混合し、界面活性剤は、次にバイオビーズ21を用いて除去される。概念的には簡単ながら、この方法は、高すぎる界面活性剤濃度は、濃度が、タンパク質がアンフォールディングまたは凝集する可能性が低すぎる一方GUVsを溶解することができるように、界面活性剤濃度の正確な制御を必要とする。 GUV /プロテオSUV融合：プロテオSUVの中のタンパク質は、予め形成され、脂質専用GUVsと合わせ、融合は、特殊な膜融合性ペプチド22または洗剤21で促進される。通常、融合の程度は低タンパク質密度でGUVsにつながる制限されている。 脱水/再水和：タンパク質含有脂質膜を部分的プロテオSUVの脱水（またはプロテオMLV）溶液GUVsによって形成され、その後、純粋な脂質膜として成長させる。明白な課題は、部分的なdehydrati間にタンパク質を保護することです25 -ステップ23が、この方法で正常にGUVs 7,23にそのようなバクテリオロドプシン、カルシウムATPアーゼ、インテグリンとVDACとして膜貫通タンパク質を再構成するために使用されています。 この記事では、Hyper-好熱性古細菌、Aeropyrumのペルニクスから、電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを作るために、脱水/再水和プロトコルについて説明します。KvAPは、真核生物の電圧依存性カリウムチャンネル26と既知の結晶構造27に高度の相同性を有している、それ電圧ゲーティングのメカニズムを研究するための優れたモデルとなっています。プロテオのSUVの生産は以前に詳細に記載し、このチュートリアル26,28,29の一部ではありませんされています。重要なことには、KvAPのプロテオSUVは、それらが長期間（&gt; 1年）のために-80℃で小さい（ 例えば、10μl）を一定分量で保存することができるように、各GUV調製のために生成する必要はない。電鋳またはゲル補助膨張はその後KvAPのプロテオのSUV（またはプロテオたMLV）からGUVsを成長させるために使用することができる。 電鋳プロトコルの重要なステップは、 図1に示されている。タンパク質を含有するSUVの溶液の液滴の白金線（ 図2に示す）上に堆積される。 SUV懸濁液の部分的脱水のSUVの融合による脂質タンパク質フィルムの形成をもたらす。再水和の間に、交流電界を離層とGUVsを形成するための脂質層を支援するために電極に印加される。 「低塩」を使用するときに10Hzのフィールドはうまく機能（&lt;5 mM）の再水和緩衝液28とGUVsは数時間かかるが成長する。対照的に、生理的なバッファ（〜100mMの塩を含む）より低い電圧、500 HzのAC場でうまく動作しますが、長期（〜12時間）を必要とする期間15膨潤 。このメソッドは、ITOが24スライドが、カスタム室続きを使用して使用して、以前のプロトコルに基づいています図2に示すように、（単純な、即興室のための設計の詳細や提案のための議論を参照）は、2つの白金線をaining。 図3は、ゲル支援膨潤法を例示する。プロトコルは、生理的塩濃度の緩衝液を用いてうまく迅速で、より均一なタンパク質分布をGUVsを生成する。しかし、単離された、明らかに欠陥のないGUVsの収率は（ すなわち、GUV膜は、光学長さスケールで均一であり、任意のオブジェクトを囲むされません）は、パッチクランプとマイクロマニピュレーションの実験のために十分な数を提供していますが、低く、 。この方法は、脂質のみGUVs 16を生成するために、アガロースゲルを用いたプロトコルに基づいており、エレクトロフォーメーション法よりも少ない特殊な装置を必要とした。 蛍光顕微鏡によるGUVsの特徴について説明したが、同様に、標準的なパッチクランプセットアップを用いて、手順「インサイドアウト」にKvAP活性を測定は、膜パッチを切除し。 成長タンパク質含有GUVsは脂質のみGUVsよりも困難であることができる。具体的には、最終的なGUV収率はSUV溶液が膜スタックを形成するために堆積され、脱水された方法を正確に敏感に依存することができる。 GUVsと以前の経験のない人のために、第一の膜の膜は、有機溶媒から脂質を堆積することによって形成される従来のプロトコル15,16以下の脂質のみGUVsを成長させることが有用であろう。従来のプロトコルがうまく機能すると、SUVの堆積と部分脱水は、新しい脂質組成のためのプロトコルを調整する際にも非常に有用である脂質専用のSUVを、使用して習得することができます。 GUVs脂質のみのSUVから確実に成長する場合には、プロテオのSUVからのタンパク質含有GUVsを生成するためにわずかなステップがある。

<table><tbody><tr><td>DPhPC (1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>卵PC L-&α;-ホスファチジルコリン(卵・鶏肉)&nbsp;</td><td>アバンティポーラー脂質&nbsp;</td><td>840051P</td><td></td></tr><tr><td>卵 PA L-&α;-ホスファチジン酸 (卵、鶏肉)</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>840101P</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&デルタ;9-cis) PC (DOPC) 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>Avanti Polar Lipids&nbsp;</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール(ヒツジウール、>98%)&nbsp;</td><td>アバンティポーラー脂質&nbsp;</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>TRed-DHPE</td><td>Invirtogen</td><td>T-1395MP</td><td>標識脂質</td></tr><tr><td>BPTR-セラミド</td><td>Invirtogen</td><td>D-7540&nbsp;</td><td>標識脂質</td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>VWR</td><td>20066.296</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン注射器&nbsp;</td><td>ハミルトンボナドゥーズAG</td><td></td><td>多様な</td></tr><tr><td>琥珀色のバイアルとテフロンカップシ</td><td>グマSU860083</td><td>とSU860076</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td>VWR291-1214<td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>多様な</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>ユーロメックス</td><td>LM3(1670-B、Tg 25.7C、TM 64C)</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>84097-1kg</td><td></td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>G8270-1kg</td><td></td></tr><tr><td>トレハロー</td><td>スシグマ</td><td>T9531-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ヘペ</td><td>スシグマ</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>ユーロメックス</td><td>EU0011-A</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>ウェスコール</td><td>Vapro</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>ショット機器</td><td>Lab850</td><td></td></tr><tr><td>ソニケー</td><td>ターElmasonic</td><td>S 180 H</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター0.2&micro;m</td><td>ザルトリウス シュタイム</td><td>Minisart 16532</td><td></td></tr><tr><td>機能発電機</td><td>TTi</td><td>TG315</td><td></td></tr><tr><td>プラチナ線</td><td>Goodfellow</td><td>LS413074</td><td>99.99+%, d = 0.5 mm</td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエチレン</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダウ コーニング '高真空グリース'</td><td>VWR</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>シーリング ペースト</td><td>Vitrex medical A/S, デンマーク</td><td>REF 140014</td><td>Sigillum ワックス</td></tr><tr><td>カバー スライド 22 x 40 mm No1.5</td><td>VWR</td><td>631-0136</td><td></td></tr><tr><td>カバー スライド 22 x 22 mm No1.5</td><td>VWR&nbsp;</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td>エアプラズマ、「高」</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td>の設定 <td>Falcon BD</td><td>REF 353001</td><td>3.5 cm x 1 cm</td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>Axon instruments</td><td>Multiclamp700B</td><td></td></tr><tr><td>DAQ カード</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td>バージョン8.6</td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペットホウケイ酸OD 1&nbsp;mm内径0.58&nbsp;mm</td><td>ハーバード・デバイス</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ&nbsp;</td><td>Q45W-T10P</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター&nbsp;</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>サッター&nbsp;</td><td>P-2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ProSilica&nbsp;</td><td>GC1380</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオーバート 135</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td></td><td>40倍 長作動距離、位相コントラスト</td></tr><tr><td>対物レンズ&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td>100X プランアポクロマート NA 1.3</td></tr><tr><td>フィルターセット GFP (Alexa-488用)</td><td>堀場</td><td>XF100-3</td><td></td></tr><tr><td>フィルターセット Cy3 (テキサスレッド用)</td><td>堀場</td><td>XF101-2</td><td></td></tr><tr><td>ベータカゼイン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Nikon Eclipse TE 2000-E</td><td></td><td>D-Eclipse C1 共焦点ヘッド</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 100X NA 1.3</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>画像処理と電流トレースの分析</td></tr></tbody></table>

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、kvap、

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

ジャイアント層小胞（GUVs）は膜結合現象を研究するための人気のある生体模倣システムです。しかし、GUVsを成長させる一般的に使用されるプロトコルは、機能的な膜貫通タンパク質を含むGUVsを形成するために修正されなければならない。電鋳とゲル支援腫脹 - - 電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを形成するために、この記事では、2脱水 - 再水和の方法について説明します。両方の方法では、タンパク質含有小単層小胞の溶液を再水和緩衝液中で膨潤させた膜のスタックを形成するために部分的に脱水される。 AC電界は、フィルム再水和の間に適用することができるようにエレクトロフォーメーション法では、フィルムは、白金電極上に堆積される。対照的に、ゲルアシスト膨潤法は、フィルム再水和を向上させるためにアガロースゲル基質を使用する。どちらの方法も、低い（ 例えば5mm）でGUVsおよび生理学的（ 例えば、100 mM）の塩濃度を生成することができます。得られGUVs蛍光顕微鏡、及びインサイドアウトパッチクランプ構成を使用して測定された再構成されチャネルの機能を介して特徴付けられる。交番電界（電鋳）の存在下で膨潤が無欠陥GUVsの高収率を与え、一方、ゲルアシスト膨潤法は、より均一なタンパク質分布を生成し、特殊な装置を必要としない。

GUVsの成長を迅速に顕微鏡下で成長チャンバを調べることによって評価することができる。電鋳のために、GUVs、 図4に示すように、白金線に沿って房に成長する傾向がある。ゲルアシスト膨潤時に、GUVsは急速に成長し（ 図5）融着球状構造として現れる。 欠陥のないGUVsは、より容易に識別され、観察室に転送した後に評価されます。較正測定は、厳密にGUV品質を評価するために必要とされ、体系的定量化は、以前に28公表されている。しかし、経験的な指針として、「良い」GUVsを分離する必要があります（ つまり、クラスタ内）、シングル、なめらかな、球状の外膜を持って、内部にはオブジェクト（ すなわち、チューブ、ネストされた小胞など ） を含んでいない、と「標準」脂質蛍光レベルを有する（明るいオブジェクトは、典型的には、二環式または多あるラメラ）。 図6は、等浸透圧グルコース溶液への転送後に「欠陥のない...

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

本実験の全体的な目的は、電位依存性イオンチャネルを巨大単層リポソーム（GUV）に組み込み、パッチクランプ法を用いてその活性を特性評価することです。まず、イオンチャネルKVAPを含む小型リポソーム溶液を部分的に脱水し、脂質タンパク質膜を作成します。次に、この脂質膜を再水和させることで、チャネルを含む細胞サイズの巨大単層リポソーム（GV）を形成および成長させます。その後、GVを記録室に転送し、パッチピペットを用いてGUV膜の一部を切り出し、イオン電流を測定します。電流記録の解析結果から、GUV膜中のイオンチャネルが膜電位の変化に応じて活性化することが示されました。巨大単層小胞は、膜タンパク質の相互作用に関する生物物理学分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、膜貫通タンパク質と脂質膜の物理的特性との相互作用が挙げられます。この手法は、電位依存性カリウムチャネルKVAPの機能に関する知見を提供できるだけでなく、他のイオンチャネル、輸送体、ポンプ、および一般的な膜貫通タンパク質にも適用可能です。巨大小胞の操作を含む工程があるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。溶液およびKVAPを含む小型単層小胞（SUV）を調製した後の手順について説明します。テキストプロトコルに従い、まず電極線を穴に通し、線を回転させて拭き取ることで汚れがないことを確認し、窒素気流または空気で洗浄・乾燥させて電気形成チャンバーを準備します。テキストプロトコルの記載通り、SUVバッファーを用いた3 mg/mLのSUV懸濁液を30 µL準備し、溶液を激しく混ぜてSUV溶液を導入します。2 µLピペットまたは5 µLガラスシリンジを使用して、SUV溶液の小さな液滴をワイヤー上に滴下します。液滴が互いに接触したり融合したりしないよう、十分な小ささと間隔を確保してください。滴下したSUVを、開放空気中で約30分間乾燥させます。液滴が静止したら、顕微鏡で脂質堆積物が観察しやすくなるようにワイヤーを回転させます。次に、シリンジを使用して、3つのウェル周辺のチャンバー底面に真空グリースを塗布し、40 mm × 22 mmのカバーガラスをゆっくりと押し当てて、隙間なく密着させてチャンバー底面を密封します。その後、シーリングペーストでチャンバーの側面を密封し、チャンバー上部の3つのウェルの外周に真空グリースを塗布します。各ウェルが満杯になるまで、成長バッファーをゆっくりと加えます。ウェル内の溶液が激しく動くと、電極上の脂質膜が剥がれる可能性があるため、避けてください。トップカバーのスライドをグリースの上にそっと押し当てて、チャンバーを閉じます。この際、ボトムカバースリップがずれないように注意してください。2つのアリゲータークリップを使用して、信号発生器をワイヤーに接続します。使用するバッファーの塩濃度に応じて周波数を設定し、マルチメーターを用いて電線間の電圧を測定し調整します。また、バッファーの種類に応じて、アルミホイルでチャンバーを覆い、フローラフォーラスを光から保護してください。G UUVを、低塩バッファーでは2～3時間、高塩バッファーでは12時間または一晩育成させます。インキュベーション後、チャンバーをジェネレーターから取り外し、倒立顕微鏡の上に慎重に配置します。GUV成長プラズマを評価するために、ARO溶液が適切に広がるよう、カバーガラスを1分間洗浄します。カバーガラスを洗浄してから15分以内に、テキストプロトコルに従って調製した温かいARO溶液200 µLを滴下し、表面全体を濡らします。スライドを垂直に傾け、下端をティッシュに触れさせて余分な液体を取り除き、スライド上にAROSの薄く均一な層を残します。スライドを60 °Cに設定したホットプレートまたはオーブンに置き、少なくとも30分間乾燥させます。次に、AROSをコーティングしたカバーガラスを標準的な3.5 cmのペトリ皿に入れます。SUV溶液を調製した後、約15 µLを約30個の非常に小さな滴として、aros表面にゆっくりと滴下します。この際、aros層を過度に乱さないように注意してください。スライドを緩やかな窒素気流下に約10～15分間置き、バッファーの蒸発を目視で確認します。SUVが乾燥すると同時に液滴が乾燥したら、スライド表面を覆うように成長バッファーを約1 mL加えます。約30分間膨潤させ、その後、位相差顕微鏡またはDICを備えた倒立顕微鏡を用いて、成長チャンバー内でのGU UUVの成長を確認します。チャンバーに5 mg/mLのβ-シクロデキストリン溶液を添加してGU UUVのパッチクランプを行います。これにより、GUの接着、拡散、および破裂を防ぎます。5分間インキュベートして洗浄し、接地電極を挿入して、観察バッファーでチャンバーを満たします。次に、GU UUVを観察チャンバーへ移します（電界形成GU UUVの場合）。トップカバーのスリップをゆっくりと取り除き、成長チャンバーを開きます。ピペットチップを各ワイヤーの直上に配置し、GU UUVを脱離させるため、ワイヤーに沿ってチップを動かしながら約10 µLをゆっくりと吸引します（ゲル補助膨潤GU UUVの場合）。まず、ペトリ皿の側面を数回軽く叩き、カバーガラス表面からGU UUVを剥離させます。ピペットチップをカバーガラスの直上に配置し、チップを表面上で引き戻しながら10 µLを吸引します。回収したGVSを観察チャンバーに直接移します。GVSをパッチクランプするため、GUが底部に沈殿するまで数分間待ちます。新しいパッチピペットに観察バッファーを満たし、パッチクランプのヘッドステージに取り付けます。チャンバー内を探索して欠陥のないGUVを見つけ、そこに蛍光タンパク質が含まれていることを確認します。パッチピペット内部を清潔に保つため、100 pascals以上の一定の正圧をかけ、パッチピペットをチャンバー内に挿入します。パッチピペットを視野に入れ、テストパルスを印加してピペットの電圧オフセットと抵抗を測定または補正します。次に、蛍光照明下でピペットを観察し、先端が清潔であることを確認します。パッチピペットをGUVに近づけ、必要に応じて正圧を同時に下げ、パッチピペットからの流出によってGUVが流されないようにします。パッチピペットをGUVに近づけ、陰圧をかけてGUVをパッチピペットに吸着させます。GUV膜の舌状部分がパッチピペット内に進入し、ギガシールが形成される際の抵抗値をモニタリングします。インサイドアウト膜パッチがGUVから切り出され、ギガシールが安定したら、テストパルスをオフにし、本文に記載されている電圧プロトコルを適用します。この図は、欠陥のないGUVのDIC像およびエピ蛍光像を示しています。GUV膜におけるタンパク質の均一な蛍光は、KVAPが脂質膜に残存せずGUVに組み込まれており、凝集体を形成していないことを裏付けています。ここでは、3つの方法を用いて作製されたGUVが示されています。蛍光脂質とタンパク質のシグナルは同じ平均密度にスケーリングされており、オーバーレイ像において、タンパク質密度が低いGUVはマゼンタ色に、高いGUVは緑色に、また平均的なタンパク質密度のGUVは白色に表示されます。欠陥のない単離されたGUVが同定され、そのGUVのサイズ分布をここに示します。通常、電場形成法はゲル支援膨潤法よりも欠陥のないGUVを多く生成しますが、電場形成法で生成されるGUVはサイズが小さくなります。ここでは、GUVの蛍光から推定されたタンパク質密度分布を示しています。高塩濃度バッファーを用いた電気形成では、タンパク質密度が異なるGU UUVが生成されます。低塩濃度バッファーを用いた電気形成では密度の変動が大幅に抑えられ、またゲル支援膨潤法によって生成されたGU UUVのタンパク質密度は、切り出されたパッチ中のタンパク質濃度に応じて非常に均一になります。電流トレースには、単一チャネルまたはチャネルのアンサンブルのいずれかが示されています。KVAPは電位依存的な開口を示します。この手順を行う際は、巨大小胞が剪断ストレスや浸透圧ストレスに耐性のない脆弱な物体であることを念頭に置くことが重要です。本手順に続き、脂質ナノチューブの牽引などの手法を行うことで、タンパク質の曲率センシングなどのさらなる疑問に対する検討が可能です。このビデオを視聴することで、機能的に再構成されたタンパク質を含むGVSを製造する方法について十分に理解することができます。

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

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生物学

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