蛍光DNAための簡単​​な方法

この手順の目的は、DNAインサイチュハイブリダイゼーションを用いて、有糸分裂期染色体上のヘテロクロマチン配列をマッピングすることです。まず、第3 instar のショウジョウバエ幼虫の脳またはその他の目的の組織を解剖します。次に、組織をカバーガラス上に固定します。

次に、組織をカバーガラスとスライドガラスの間で圧砕します。ハイブリダイゼーションに向けて染色体を準備するための最終ステップは、圧砕した組織に合成した短鎖オリゴプローブをハイブリダイズさせることです。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、染色体上のオリゴプローブに相補的な配列の局在を示します。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、その簡便さにあります。他の多くの染色体およびC2ハイブリダイゼーション法では、大量のホルムアミドを用いた洗浄が必要であり、コストが高く手間がかかる場合があります。本手法ではホルムアミド洗浄を必要としないため、より安価でクリーンかつ迅速な技術となっています。

この手法は、ショウジョウバエの脳の体細胞染色体上の配列を視覚的にマッピングするための簡便な方法を提供しますが、異なる生物の異なる組織における他の種類の染色体上の配列をマッピングするためにも使用できます。スライド1枚につき、4〜5つの組織を準備しますが、脳の解剖の場合はそれ以上は準備しないでください。まず、3齢の徘徊期幼虫を選択し、1×PBSの滴の中に回収することから始めてください。

過密な状態ではない個体が入ったバイアルを選択します。解剖顕微鏡下で、超極細ピンセットを用いて口鉤を掴み、別のピンセットで体長の3分の2あたりの位置を掴みます。次に、口鉤をゆっくりと引っ張り、脳、腹側神経節、唾液腺、および消化管の一部を露出させます。

次に、ピンセットで脳と腹側神経節を他の組織から分離し、プラスチックプレート上の1滴のXPBTに移します。精巣の解剖を行う場合は、生後3日のオスの子プヨを採取してください。生後3日の子プヨは、体が黄色く、目が赤いのが特徴です。

翅芽（しが）が小さい方がオスです。1組のピンセットで腹部上端の胸部付近を、もう1組のピンセットで腹部の最先端部を把持します。そして、涙滴状の精巣を抽出します。

精巣は脂肪体に囲まれていますが、これらは軽く振ることで取り除くことができます。精巣から外側の部位をすべて切り離してください。これにより、適切な圧接（squashing）が妨げられるのを防ぐことができます。その後、精巣を清潔なプレート上のXPBT 1滴に転移させます。すべての組織を回収したら、姉妹染色分体の分離を改善するために低張液で処理します。染色質領域において、組織を0.5%クエン酸ナトリウム液 1滴に10分間転移させます。

この効果を得るためにコルヒチンを使用することは、染色体形態にアーティファクトが生じる可能性があるため推奨されません。次に、超極細ピンセットを用いて組織を固定します。組織を、sigma coat処理された清潔なカバーガラス上の20 µLの新鮮な45%酢酸含有2.5%PFA液滴に転移させます。組織を固定液内で均等に広げ、室温で4分間インキュベートした後、カバーガラスの押し潰し（スクワッシング）工程に進みます。まず、ポリリシンコートされたスライドガラスを、組織とカバーガラスの上に面を下にして軽く置きます。

カバーガラスを圧迫せず、スライドガラスの裏側に密着させます。Sigma-coatでカバーガラスを処理すると、カバーガラスを取り外した後に押し潰した組織がスライドガラス上に確実に残ります。ただし、まれに組織がカバーガラスに付着したままになることがあります。

このステップでは、組織の潰し（スクッシュ）を繰り返し行うことを推奨します。次に、スライドを裏返し、厚手の紙を折ったものの中に置きます。その後、安定した superfície 上で、親指を使用してカバーガラスの上から真っ直ぐに強く押し付けてください。

カバーがずれるように押さないでください。組織が塗りつぶされてしまいます。通常、非常に強く圧力をかけることで、押し潰した組織内で染色体が良好に分離します。しかし、場合によっては、不完全に分離していたり、潰れたり、断片化したりするなど、染色体の品質にばらつきが生じることがあります。

したがって、組織の圧砕サンプルを2回または3回繰り返し作成することを推奨します。アセンブリを氷の上に数分間置き、その後、液体窒素の中で沸騰が止まるまで、あるいはそれ以上の時間浸します。組織が解凍される直前にスライドを取り出し、新しいカミソリの刃でカバーガラスの角を弾いて跳ね上げ、取り除きます。

組織を傷つけないように注意してください。次に、スライドを速やかに100% ethanolで満たされたコプリンジャーに入れ、少なくとも5分間浸漬させます。スライドを取り出し、組織に触れないように余分なethanolを拭き取り、1時間自然乾燥させます。

その後、スライドはデシケーター内で数週間から数ヶ月間保存できます。まず、各プローブ100 nanogramsを1.1 x ハイブリダイゼーションバッファー20 microlitersに加え、1 x ハイブリダイゼーションバッファーの溶液を22 microliter作成します。次に、この混合液を固定組織上にピペッティングし、組織に触れないように注意しながら、カバーガラスをそっと被せます。

組織に接触していない小さな気泡が1つある程度であれば問題ありませんが、それ以上の気泡がある場合は、カバーガラスを掛け直す必要があります。スライドを95 °Cのヒートブロックの平らな面に置き、アルミホイルで覆います。5分間待ちます。その間に、チップボックスに濡れたペーパータオルを入れて加湿チャンバーを準備してください。

次に、スライドを取り出します。スライドをストレッチパラフィルムで丁寧に包み、湿らせたタオルを入れたチップボックスで構成した加湿チャンバーに移します。30°Cで4時間から一晩、チャンバー内でスライドをインキュベートします。この温度はGC含量の低いプローブに適していますが、GC含量の高いプローブの場合は、ハイブリダイゼーション温度の調整が必要になる場合があります。

インキュベーション後、パラフィルムを慎重に取り除き、カバーガラスの端をゆっくりと持ち上げます。次に、0.1 XSSCバッファーで1回15分間、計3回スライドを洗浄します。洗浄中は、光への露出を最小限に抑えるため、容器をアルミホイルで覆ってください。

長いビオチン標識プローブを使用する場合は、事前にロドミネアバドンを添加し、洗浄してから次へ進んでください。まず、組織周辺の水分を拭き取り、組織を100 µLのブロッキング溶液で覆います。次に、気泡が入らないように注意しながら、新しいカバーガラスを静かに被せます。

再度、スライドをパラフィルムで包みます。次に、スライドを37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベート後、カバーガラスを取り除き、組織の周囲をワイプで拭き取ります。

次に、組織上に、SBTで希釈した1:1000のrumine avadonを100 µL適用します。その後、ブロックと同様に、スライドをカバーしてラップし、インキュベートします。最後に、カバーガラスを慎重に外し、スライドを洗浄します。

4 x SSCs Tで3回洗浄し、続いて0.1 XSSCで3回洗浄します。各洗浄工程は少なくとも5分間行います。プロトコルに従い、組織に触れないように余分なバッファーを吸い取って、スライドを乾燥させます。

次に、スライドを組織面を上にして暗所に10〜15分間、または水分が完全に消失するまで置いておきます。ここで、DPI含有Vector Shieldを11 µL用いてスライドを封入し、non sigma coatカバーガラスを慎重に被せます。封入剤が端まで行きわたっていない場合は、端からさらに数µLの封入剤を添加し、余剰分を拭き取ってください。

次に、カバーガラスをマニキュアで封印し、マニキュアが乾くまで（通常は少なくとも30分かかります）スライドを暗所で立てた状態で保存します。その後、スライドを−20°Cで最大1週間保存し、可能な限り速やかに組織のイメージングを行います。蛍光標識された市販の合成短鎖オリゴヌクレオチドのセットと、ニックトランスレーション法で作製したより長いビオチン標識プローブを用いて、いくつかの異なる組織型の染色体にハイブリダイゼーションを行いました。

述べてきた手法を用いて、Drosophila Melanogasterの359塩基対サテライト反復配列に対するプローブを用いたところ、X染色体上の巨大なマルチメガベースペアブロックと、3番染色体上のより小さな領域が認識されました。レスポンダーサテライトに対するより長いプローブでは、反復コピー数が約700回という比較的少ない反復ブロックが検出されました。したがって、本手法により、非常に小さなサテライトブロックの可視化が可能となります。

低張溶液による処理時間を10分に倍増させたところ、姉妹染色分体の分離がより促進されました。この手順を抗体染色などの他の手法と組み合わせることで、特定のクロマチンタンパク質が特定の配列に局在しているかといった疑問を検討することが可能です。