蛍光DNAための簡単な方法その場でぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション
2015年1月6日
ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA ISH)を行う簡単な方法を紹介します。この分析法は最小限の試薬で済み、短いプローブまたは長いプローブ、さまざまな組織、蛍光または非蛍光ベースのシグナルでの検出に汎用性があります。
この手順の全体的な目標は、DNA in situハイブリダイゼーションを使用して、ヘテロクロマティック配列を有糸分裂染色体にマッピングすることです。これは、最初にスターショウジョウバエの幼虫の3番目の脳、または関心のある別の組織を解剖することによって達成されます。2番目のステップは、ティッシュをカバースリップに固定することです。
次に、ティッシュをカバースリップとスライドの間に押しつぶします。ハイブリダイゼーションのために染色体を準備するための最後のステップは、短く合成されたオリゴプローブを押しつぶされた組織にハイブリダイズすることです。最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、染色体上のオリゴプローブに相補的な配列の局在を示します。
この方法が既存の方法よりも優れている点は、その単純さです。他のほとんどの染色体およびC 2ハイブリダイゼーション法は、大量のフォームアミドによる洗浄を伴いますが、これは高価で面倒な場合があります。私たちの方法は、フォームIDE洗浄を必要としないため、より安価で、よりクリーンで、より速い技術です。
この方法は、ショウジョウバエの脳の体細胞染色体上の配列を視覚的にマッピングする簡単な方法を提供しますが、さまざまな生物の異なる組織から他のタイプの染色体上の配列をマッピングするためにも使用できます。スライドを作成するごとに、4つまたは5つの組織を準備しますが、脳の解剖用にはこれ以上準備しないでください。まず、さまよう3番目の幼虫を選択し、1つのXPBSのドロップにそれらを集めることから始めます。
過密ではないバイアルから収集するバイアルを選択してください。解剖スコープでは、超微細ピンセットを使用してマウスフックをつかみ、別のピンセットを使用して体の長さの3分の2をつかみます。次に、マウスフックをそっと引っ張って、脳、腹側神経節、唾液腺、消化管の一部を露出させます。
次に、脳と腹側神経節を他の組織から離し、プラスチックプレート上の1つのXPBTの液滴に移します。鼻腔精巣解剖のために、生後3日の男性のピュイを収集します。生後3日のピュイは黄色い体と赤い目をしています。
翼パッドが小さいのはオスです。胸部近くの腹部の上部にある蛹を1組のピンセットと2組のピンセットでつかみます。腹部の非常に遠位の先端をつかみ、涙滴型の精巣を引き出します。
それらは、穏やかに振り落とすことができる脂肪体に囲まれており、精巣から体の外側の部分を剥がすと、適切な押しつぶれを防ぎ、精巣をきれいなプレート上の1つのXPBTの滴に移します。すべての組織が収集されたら、姉妹染色分体の分離を改善するために低張溶液でそれらを処理します。eクロマティック領域では、組織を0.5%クエン酸ナトリウムの滴に10分間移します。
この効果を得るために、コルヒチンは染色体形態にアーティファクトを引き起こす可能性があるため、推奨されません。次に、極細ピンセットを使用して組織を固定します。清潔なシグマコート処理されたカバースリップ上の45%酢酸で新たに作られた2.5%PFAの20マイクロリットルの滴にそれらを移し、固定剤で組織を均等にスペースアウトし、室温で4分間それらをインキュベートし、カバースリップを押しつぶすことを進めます。
カバースリップを押さずにスライドの下側に貼り付けます。治療。シグマコート付きのカバースリップは、カバースリップの取り外し後にスカッシュ組織がスライドに残るようにするのに役立ちます。ただし、まれに、ティッシュがカバースリップに付着したままになることがありました。
このステップでは、組織スカッシュの複製を行うことをお勧めします。次に、スライドを裏返して、折りたたまれた厚紙に入れます。次に、安定した表面で、親指を使用してカバースリップを非常にしっかりとまっすぐ押します。
カバーをスライドさせるような押し方をしないと、ティッシュが汚れます。非常にしっかりと押し付けると、通常、スカッシュ組織内の染色体がきれいに分解されます。ただし、染色体が不完全、押しつぶされている、断片化しているなど、染色体の品質にばらつきがある場合があります。
したがって、繰り返しになりますが、2つまたは3つの複製組織スカッシュを実行することをお勧めします。アセンブリを氷のブロックに数分間移し、窒素が沸騰しなくなるまで液体窒素に浸します組織が溶ける直前にスライドを取り外した後、新しいかみそりの刃を使用してカバースリップの角をはじきます。したがって、それを削除します。
ティッシュを傷つけないように注意してください。次に、スライドを100%エタノールで満たされたコプリンジャーにすばやく入れ、少なくとも5分間浸します。スライド芯を取り外し、ティッシュに触れずに余分なエタノールを取り除き、スライドを1時間風乾させます。
その後、スライドは乾燥チャンバーで数週間から数ヶ月間保管できます。まず、各プローブ100ナノグラムを20マイクロリットルの1.1×ハイブリダイゼーションバッファーに添加し、1×ハイブリダイゼーションバッファーの22マイクロリットル溶液を調製します。次に、混合物を固定組織にピペットで固定し、組織を手つかずのままにして、カバースリップを静かに貼り付けます。
組織に接触しない小さな気泡は問題を引き起こさないが、それ以上の気泡は、カバースリップの再適用を保証する。スライドを摂氏95度のヒートブロックの平らな面にセットし、ホイルで覆います。5分間待ってから、濡れたペーパータオルをチップボックスに追加して湿度チャンバーを準備できます。
次に、スライドを削除します。スライドを伸ばしたパラフォームで慎重に包み、湿ったタオルで構成された加湿チャンバーに移します ヒントボックスで、スライドをチャンバー内で4時間から摂氏30度で一晩インキュベートします。この温度は、GC含量の低いプローブには適していますが、GC含量の多いプローブには、ハイブリダイゼーション温度によるトラブルシューティングが必要になる場合があります。
インキュベーション後、パラフィルムを慎重に剥がし、カバースリップをゆっくりと片方の角まで持ち上げます。次に、スライドを0.1 XSSCバッファーで3回、1回の洗浄につき15分間洗浄します。光への露出を最小限に抑えるために、洗浄中は瓶をホイルで覆います。
ビオチン化プローブが長い場合は、ロッドドミンアバドンを添加し、洗浄してから先に進みます。まず、組織の周囲を乾燥させ、組織を100マイクロリットルのブロッキング溶液で覆います。次に、気泡を引っ掛けずに新しいカバースリップをそっと塗ります。
再度、スライドを param で囲みます。次に、スライドを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、インキュベーション後、カバースリップを取り外し、ワイプで組織の周りを拭き取ります。
次に、SBTで希釈した1〜1000ルミンアバドンを100マイクロリットル塗布します。ブロックで行ったように、スライドを覆い、包み、インキュベートしてフォローアップします。最後に、カバースリップを慎重に取り外し、スライドを洗います。
4 x SSCs T で 3 回洗浄し、続いて 0.1 XSSC で 3 回洗浄します。各洗濯ステップは少なくとも5分の長さにする必要があります。プロトコールを進めながら、組織に触れずに余分なバッファーを吸い取ってスライドを乾燥させます。
次に、スライドティッシュを上にして、10〜15分間、または水分が完全に消えるまで暗い場所に置きます。次に、11マイクロリットルのDPI付きベクトルシールドを使用してスライドを取り付け、シグマコーティングカバースリップ以外の上に慎重に下げます。メディアがすべての端に達しない場合は、端からさらに数マイクロリットルのメディアを適用し、余分なものを拭き取ります。
次に、カバースリップをマニキュアで密封し、マニキュアが乾くまでスライドを直立させて暗い場所に保管します(通常、少なくとも30分かかります)。その後、スライドをマイナス20°Cで最大1週間保存し、できるだけ早く組織を画像化します。Nick Translation社製の蛍光コンジュゲートとより長いビオチン化プローブを用いた商業的に合成された小さなオリゴのセットを、すべていくつかの異なる組織タイプの染色体にハイブリダイズしました。
記載された方法論を用いて、ショウジョウバエMelanogaster 359塩基対サテライトリピートへのプローブは、x上に大きなマルチメガベースペアブロックを認識し、3番染色体上にはるかに小さな領域を認識しました。レスポンダサテライトに対するより長いプローブは、約700の比較的低いリピートコピー数からなるリピートブロックを検出しました。したがって、この方法では、非常に小さな衛星ブロックを視覚化できます。
低張液治療ステップの持続時間を2倍の10分にすると、姉妹染色分体の分離は東に増加しました。この手順は、特定のクロマチンタンパク質が特定の配列に局在するなどの質問に答えるために、抗体染色などの他の方法と組み合わせることができます。
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概要
この記事では、染色体上の反復性のヘテロクロマチン配列を可視化するための蛍光DNA in situ ハイブリダイゼーション（DNA ISH）の方法を紹介します。この技術は様々な組織タイプとプローブ長に適応可能で、検出に蛍光顕微鏡を使用します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 細胞生物学
背景
- DNA in situ ハイブリダイゼーションは染色体構造を研究するための強力な技術です。
- ヘテロクロマチンは遺伝子制御と染色体の安定性に重要な役割を果たします。
- 蛍光顕微鏡により特定のDNA配列の可視化が可能になります。
- この方法は様々な組織に適用でき、その汎用性を高めます。
研究の目的
- ヘテロクロマチン配列のマッピングのための簡単な方法を開発すること。
- 有糸分裂染色体上でこれらの配列を可視化すること。
- 最小限の試薬で済むプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 3齢のショウジョウバエ幼虫の脳またはその他の組織の解剖。
- カバースリップ上での組織の固定。
- カバースリップとスライド間での組織の圧潰。
- 短い合成オリゴプローブの準備された染色体へのハイブリダイゼーション。
主要な結果
- 染色体上のヘテロクロマチン配列の成功した可視化。
- 異なるプローブ長での方法の汎用性の実証。
- 局在化のための蛍光顕微鏡の効果的な使用。
- 最小限の試薬要求は研究者にとってのアクセスしやすさを高めます。
結論
- 開発された方法はヘテロクロマチンの研究に効率的です。
- 様々な実験条件に適応可能です。
- この技術は染色体動態の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This streamlined DNA ISH method enables rapid, cost-effective mapping of repetitive DNA sequences to heterochromatic regions, addressing a key challenge in target validation where computational approaches fail. By eliminating formamide washes, the protocol reduces technical complexity and reagent burden, supporting early-stage mechanistic de-risking of chromosomal targets. The approach is particularly valuable for phenotypic screening workflows requiring reliable visualization of satellite repeats in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of repetitive DNA sequences in heterochromatic regions, supporting target validation in genomic regions inaccessible to computational methods.
- Operational Value: Eliminates formamide wash steps, reducing protocol time, cost, and technical variability for high-throughput target interrogation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for repetitive sequence localization, enabling assay standardization across insect tissue types.
- Operational Value: Uses simple laboratory supplies and short fluorescent oligo probes, facilitating assay scalability and reuse in screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system analysis by mapping sequences in Drosophila neural cells and Nasonia spermatocytes, providing mechanistic insight into chromosomal organization.
- Operational Value: Adaptable to larger probes and single-copy sequences, allowing translational extension to non-repetitive targets in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing of repetitive elements and enabling progression to lead identification through chromosomal target de-risking.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis interrogation of heterochromatic regions by providing direct visualization of repeat localization on mitotic chromosomes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support reliable compound or genetic perturbation screening in chromosomal contexts.
- Analytics: Generates measurable hybridization signals (e.g., multi-megabase pair blocks) that allow comparative analysis across conditions or genetic backgrounds.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by visualizing targets in disease-relevant tissues such as neural cells and germline cells.
- Enterprise Reuse: Requires only basic lab equipment (dissection tools, cover slips, hybridization buffer, fluorescence microscope), positioning it as a reusable platform across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterochromatic regions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through elimination of variable formamide wash steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering reagent costs and technical training barriers for target validation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets located in repetitive, heterochromatic genomic regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection (e.g., Drosophila larval brains, insect testes) and chromosome preparation techniques.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and basic molecular biology reagents (fluorescent oligos, hybridization buffer, SSC buffers).
- Necessitates standardization of squashing pressure and incubation times to ensure consistent chromosome resolution across users.
- Adaptation to larger probes or single-copy sequences may require optimization of hybridization temperature and blocking steps.
- Practical limitations include potential variability in chromosome quality (incomplete or fragmented squashes), mitigated by performing replicate tissue squashes.
