Name: ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNA翻訳の評価方法。シクロヘキシミド処理と超遠心分離を用いて、ストレス条件下での翻訳効率の変化を検出し、細胞の適応メカニズムを解明する。

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私たちは、ポリソームプロファイリングプロトコルとデータの共有に関する重要な議論に対して、研究室の過去と現在のメンバー、特にUrszula Liwakに感謝しています。この研究は、カナダの衛生研究所、がん研究協会、およびカナダ国立科学工学研究評議会からMHへの運営助成金によって支援されました。MDFは、Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral AwardとOntario Graduate Scholarshipの支援を受けており、この研究は彼女の博士論文の一部を形成しています。

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ポリソームプロファイリングは、異なる処置条件下での特異的転写物の翻訳の状態の定量化を可能にする強力な技術である。それはまだそれが良いソームプロファイルを生成するために重要であるそのうちのいくつかは、実行のいくつかのステップを必要とし、原則として、非常に単純な手法である。これらの重要なステップは次のとおりです。1）RNaseフリー化学物質やプラスチック製品を使用して、2）優れたショ糖勾配を（我々の経験では10-50％スクロース勾配が効率的にバインドされたリボソームを持つ40 / 60SサブユニットとmRNAを解決するための最善の仕事）を​​製造し、3 ）指数関数的に翻訳の最高速度を捕捉するために成長し、80％以下のコンフルエントされた細胞を使用。そのような遺伝子ノックダウンまたは過剰発現する限り、細胞治療を行う際にめっきする細胞の量は、細胞は、エンドポイントでコンフルエントにどれだけの関数になるように、この後者のステップは、考慮されるべきである。 結果にPRESENテッドはここで、ポリソームプロファイル分析は、IRES-保有するmRNA XIAPおよびBcl-xLの12の翻訳調節にPDCD4の役割を評価するための重要なツールでした。我々はPDCD4ノックダウン（ 図1B）の際に、一般的なポリソームプロファイルの変化を観察しなかったという事実は、私たちはPDCD4、実験の条件の下でグローバルセルラー翻訳を損なわなかったと結論することができました。我々は次に、PDCD4または対照siRNAで処理した細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布を決定するために、RT-qPCR分析を使用した。それはmRNAの分布を定量的にではなく、半定量的分析のために、および処置の間の翻訳効率の微妙なシフトの検出を可能にするため、定量PCRは、標準的なRT-PCRまたはノーザンブロット法とは対照的に、ポリソームプロファイルを分析するために選択される方法である。この技術を用いて、XIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布は、（グラムでの合計は、標的mRNAのパーセントとして表されていることを示すことができたadient）PDCD4がノックダウン後に有意したがって、これらのmRNAの翻訳の増加を示している（ 図1D、E）重いポリリボソーム（それらに関連するリボソームの数が多いのmRNA）にシフトした。これをさらにXIAPおよびBcl-xLのタンパク質レベルではなく、それらの定常状態のRNAレベル（ 図1F、G）の増加によって確認された。重要なことは、XIAPの非IRES変異体のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）の間で変化しなかった。代わりに、翻訳効率は14（通常2〜4を留分）モノソーム対ポリソーム中のmRNA量の比率（通常は5から10分画）として提示することができた。 254nmでの吸光度測定から観察されたピークが自分でリボソームRNA（洗剤に起因することができないようなプロトコルを通じてコン​​トロールの使用は、結果プロファイリング任意のポリソームを検証する上で重要であるトリトンX-100のようなsは、強く）スペクトルのこの領域で吸収し、勾配の最上部40 / 60Sピークを不明瞭にすることができる。溶解物なしで、および/または溶解物緩衝液ブランク勾配は、254nmにおける吸光度のバッファの相対的な寄与を決定するために実行される必要がある。人為的な高次構造も事実なしで（ 例えば 「擬似ポリソーム」20）があるポリソームの誤った解釈につながることができます。 EDTAが溶解物への勾配緩衝液（15分間の20mM）に加え、二価カチオンキレート剤は、その成分の小さい（40S）にリボソームの分離を引き起こし、大きな（60Sになると（80Sリボソームを安定化するための手順を通して使用される）、マグネシウムを封鎖）サブユニット。 260nmで記録された吸光度ピークがポリソーム確かであればこのように、EDTA処理は、単一の最大値は、mRNAとリボソームユニットを解放するために対応する勾配の最上部付近に観察されるように、プロファイルを崩壊する（データは示さず）。一致するプロファイルのEDTA誘発性崩壊で、定量PCRによって分析具体的な目標のすべてが今、勾配の上部に見つかるはずです。 mRNAと関連したリボソームの数は、常に特定のmRNAが翻訳されていることをどのように効率的にするものではありません。実際、ポリソーム上のアクティブな変換は、読者が知っておくべき21,22失速となるような特定のコンテキストがあります。転写物は積極的にEDTAとは異なり、「流出」を積極的mRNAを横切って転位されたリボソームを引き起こすピューロマイシンで試料を処理すること）により行うことができる翻訳機構に係合し、またはb）試料を処理しているか否かを判定する再び、任意の下流の転位リボソームの「流出」を引き起こし、開始コドンでのみ最初のリボソームの転位を抑制するホモハリングトニンと。 qPCR分析のための制御転写物の使用も重要である。セレクXIAP IRESの非IRES変種など、いくつかのハウスキーピング遺伝子（GAPDH、アクチン、チューブリン、ヌクレオリン）、リボソームのmRNA（18S、RPL13A）などの異なる処理条件によって、またはこの場合には影響を受けません転写物るが、中には重要である翻訳に対する治療の効果は、特定または一般化されている場合を検証。 XIAPおよびBcl-xLのmRNAはGAPDH mRNAに対して標準化し、すべての画分中のmRNA含有量の和で表される全mRNA含量の百分率として表し（ここで行ったように、これらの制御転写産物は、分析のmRNAの分布を正規化するために使用することができ）、又は代替的に、標的および対照mRNAは、絶対値として表され、別々に表示することができる。入力された溶解物（総体積の通常10％）のqPCR分析は、特定のmRNAの分布のた​​めに制御するもう一つのステップである。理想的には、入力された溶解物中の特定の転写物のmRNA含有量を分析し、すべての10の画分中のmRNA量の合計に匹敵する必要があります。最終的にフェノールのために制御するための任意のステップ：クロロホルム抽出工程（たとえばCAT、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど） のin vitro転写レポーターmRNAと各ポリソーム画分をスパイクすることで、その後、qPCRにより定量化され、さらに正規化するために使用することができるデータ14。 任意の技術と同様に、ポリソームプロファイリングは、いくつかの制限を提示します。通常、10画分の最小（変換効率のより微妙なシフトが20以上を必要とするかもしれない）素晴らしいポリソーム分布を有するために収集する必要があるという事実は、4つのサンプルのみを最大とすることができるという意味で、このステップは制限させる快適に一度に40個のサンプルと4の入力コントロールのRNA抽出およびqPCR分析を扱うことができるように時間に分析した。サンプルサイズは、容易に定量PCRを行うためにレプリケートする方法の多くの転写物解析されるべきであり、何を追加することができ、これはコストがかかる。プロファイリング定量PCRベースのポリソームの別の制限nalysisはそれだけで（分析される転写物が予め分かっている）は、候補ベースの手法で行うことができ、翻訳のゲノムワイドな解析のために適用することができないことである。しかし、21 世紀の初めに、研究者らは、DNAを用いてゲノムレベルでのそれらのポリソームRNAを調べるために開始した次世代シーケンス16,17とより最近15とをマイクロアレイ。むしろ個々の画分の定量PCR解析を行うよりも、ことを除いて、このプロトコルで説明したように、この強力なアプローチでは、ポリソームプロファイリングが行われ、グローバルな翻訳にフラクション（通常分2-4）およびポリソーム画分（通常留分）を一緒にプールされ、バリエーションを分析したモノソームDNAマイクロアレイまたは全ゲノムRNA配列決定によって。したがって、このアプローチでは、特定の治療の際に、その分布のシフトポリソームからモノソームに（翻訳の減少）またはその逆（翻訳の増加）全てのmRNAを評価することが可能であるメント。特定のmRNAのポリソーム分布の検証および定量化は、その後qPCRにより行うことができる。ポリソームプロファイリング原理のさらに強力な使用はリボソームプロファイリングです。この技術のさらなる高スループット拡張がポリソーム画分23の何百もの同時モニタリングが可能になることが最近報告された。変異体のコレクションや大規模RNAiスクリーニングの並進効率をプロービングするときに明確な利点を提供する。リボソームプロファイリングは、タンパク質合成24,25に従事リボソーム（リボソームフットプリント）によって保護RNA断片をマッピングするために、次世代シークエンシングを利用している技術である。この技術では、リボソームの転位は、リボソーム足跡の集団を得るために細胞溶解およびRNase消化に続いて（可逆）、シクロヘキシミドまたはエメチン（不可逆的）を抑制することができる。リボソームは、濃縮された全RNAを単離し、夾雑リボソームおよびミトコンドリアリボソームRNAを除去する。約26〜28ヌクレオチドのRNA足跡を単離し、逆転写、cDNAライブラリーに変換され、26を配列決定した。標準ポリソームプロファイリングとは異なり、このアプローチは、翻訳制御されている特定のmRNAを識別するだけでなく、そのような特定の転写物に沿ってリボソームの正確な占有密度などコドン解像度でのmRNAに固有の情報が得られる。それは転写物上リボソームの募集が行われている場所の詳細な情報を与えることができるので、これは、そのようなIRES-保有するmRNAの翻訳などの特定のモードを持つmRNAをするために特に重要である。

タンパク質合成（翻訳）の調節は、密接に細胞生存にリンクされている重要な細胞プロセスです。翻訳が細胞のエネルギーの50％以上を消費することを考慮すると、変換が厳密に調節されていること、および翻訳の摂動が十分に許容されていないことは驚くべきことではない。逆に、多くの異常な細胞プロセスは、翻訳機構と翻訳出力（ すなわちプロテオーム）を修正しなければならないことを要求している。これは、しばしば、様々なストレス応答および疾患状態における場合であり、おそらく最も癌に例示されている。翻訳制御の重要な利点は、迅速に、様々な外部及び内部トリガー、先端細胞生存および死亡1のバランスそれによって微調整機構に応じて、タンパク質の出力を再プログラムする細胞の能力である。 翻訳制御には2つの側面は、特に興味深いものです。規制MECの性質の理解hanism（単数または複数）と特定の変換を可能にする制御エレメントは、特定のmRNAおよび最初の場所で選択的翻訳を誘発し、特定のトリガに対する細胞応答に関与するそれらのタンパク質産物の同定。ソームプロファイリングは、両方のプロセスの効果的な研究を可能にする技術である。 ポリソームプロファイリング技術の全体的な目標は、異なる細胞条件下で特定のmRNAの翻訳状態を研究し、定量化することである。技術の原理は、「異なる転写産物上で「積極的に翻訳するリボソームを「凍結」することによってmRNAの翻訳を取り込むため、（数リボソームによって結合された）高度に翻訳された転写産物の区別を考慮して、ショ糖勾配上で遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することで、不十分（1つまたは2つのリボソームによって結合された）ものを翻訳した。この特定のプロトコルに結合する抗生物質シクロヘキシミド中60SリボソームサブユニットとブロックリボソームのEサイト2からの脱アセチル化されたtRNAのリリースは、リボソームの転位を阻害し、mRNAの翻訳にリボソームを停止するために使用されます。しかし、このようなエメチンもブロック翻訳伸長3などの他のブロッキング剤を使用することができる。 翻訳プロセスの最終的な出力を測定し、ウェスタンブロッティングおよび35 Sメチオニン標識技術とは異なり、ポリソームプロファイリングは、このように異なる条件下で変換メカニズムのより詳細な研究を可能にし、積極的に翻訳mRNAとリボソームとの関連を測定するという利点を有する。したがって、この技術は、容易に翻訳調節7-9、タンパク質合成1,10,11、又はIRESの上流またはmRNA構造の効果に影響を与えるストレス状態に関与するタンパク質因子は、特異的に翻訳4-6の異なるモードを研究するために適合させることができるタンパク質シンセ上のオープンリーディングフレームESIS 12-14。今日では、ポリソームプロファイリングアプリケーションがさらに広いポリソーム関連するmRNAを分析するためのDNAマイクロアレイ15または次世代シーケンス16,17を用いている。

<table><tbody><tr><td>グラジエントマスター 108 自動グラジエントメーカー</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>自動デンシフロー 2チャンバーグラジエントメーカー</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン超遠心&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>モデル # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配分画装置</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>構成:チューブ穿孔システム、&nbsp; 蠕動ポンプ、UA-6 検出器、254 nmおよび280 nmフィルターとFoxy R1フラクション</td></tr><tr><td>コレクターWinDaqデータ収集ソフトウェア</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmポリアロマー超遠心チューブ(SW41用、14 x 89 mm)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー 2 ml 遠心チューブ(ドルフィンノーズ)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー 2 ml 遠心チューブ(平底)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖(ヌクレアーゼフリー)</td><td>カルバイオケム</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. DMSOに再懸濁し、-80°Cに保ち、長期保存します。注意:有毒です!人工呼吸器や皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。計量するときはマスクを着用してください。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(ヌクレアーゼフリー)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O(ヌクレアーゼフリー)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base(ヌクレアーゼフリー)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>注意:有毒!呼吸器や皮膚の炎症を引き起こす可能性があります</td></tr><tr><td>組換えRNasinリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase不活化溶液</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td>注意<td>:有毒!呼吸困難症、尿路の炎症、皮膚の炎症や腐食を引き起こす可能性があります</td></tr></tbody></table>

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mrnaの翻訳の評価

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

タンパク質合成の調節は、ストレスに対する細胞応答の重要な制御点を表す。具体的には、控えめなRNA調節エレメントは通常、特定のストレス応答に必要なタンパク質をコードする特定のmRNAの選択的翻訳を可能にすることが示された。これらのmRNAの同定だけでなく、選択的な翻訳のために責任を調節メカニズムの特徴付けは、しばらくの間、分子生物学の最前線に立ってきました。ソームプロファイリングは、これらの研究における礎石方法です。ポリソームプロファイリングの目標は、異なる転写に積極的に翻訳するリボソームを固定化することによってmRNAの翻訳をキャプチャし、これにより、高度に翻訳された転写物および不完全に翻訳されたものとの区別を可能にする、スクロース勾配上の超遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することである。次いで、これらは、さらに伝統的な生化学的および分子生物学的方法によって特徴付けることができる。重要なことは、組み合わせのpハイスループットゲノムアプローチとolysom​​eプロファイリングは翻訳制御の大規模解析を可能にします。

我々は最近、アポトーシス阻害剤XIAPおよびBcl-xLの12をコードするIRES-保有するmRNAの選択的な翻訳阻害剤として腫瘍抑制PDCD4のための新規の役割を説明した。ソームプロファイリングはIRES媒介翻訳PDCD4の具体的な関与を実証するための重要な技術だった。 HEK293細胞を一過性にPDCD4（ 図1A）の内因性レベルを枯渇させるトランスフェクトし、その後、プロファイル分析をポリソームに供した。我々は、比較siCTRLとsiPDCD4細胞（ 図1B）で処理ソームプロフィールの変化の欠如によって判断されるようにPDCD4のレベルを減らすことが、グローバル細胞翻訳を損なわなかったことを観察した。同様に、XIAP 19の非IRES変異型のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）との間で変化しなかった。対照的に、2つのIRES-保有するmRNAのポリソーム分布は、XIAPおよびBcl-xLのは、有意に変化した。 Pの非存在下でDCD4これら2つのmRNAの分布は重いribopolysomes（ 図1D、E）にシフトされます。これはXIAPおよびBcl-xLのmRNAは（ 図1F）の定常状態レベルの変化を伴わないので、これらの結果は、ウェスタンブロッティング（ 図によって確認された減少PDCD4のレベルの細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのの翻訳の増強を実証1G）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 図1：ポリソームプロファイリングがXIAPおよびBcl-xLの翻訳の選択的阻害剤としてPDCD4を識別し、（A）HEK293細胞を、PDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）で処理し、抗PDCD4で溶解し、ウェスタンブロット分析に供したsiRNAを、非標的およびPDCD4の程度を確認するために、抗ヌクレオリン抗体がノックダウン（B）PDCD4は（A）のようにノックダウンしたと細胞溶解物をプロファイリングポリソームに供した。代表ポリソームプロファイルは、トップパネルに示されている。 XIAP非IRES（C）の分布は、GAPDHのそれと比較したBcl-xLの（D）、およびXIAP IRES（E）のmRNAが各画分中の全mRNAのパーセント（％mRNA）のように示されている。（F）で点灯-state mRNAレベルはPDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）siRNA処理細胞におけるRT-qPCRにより測定した。（G）からの溶解物（A）抗XIAP、抗-Bcl-xLの、及び用いたウエスタンブロット分析に供した抗ヌクレオリン抗体。 （NB。データが元々 12に掲載された図1に示した） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

本実験の全体的な目的は、ポリリボソームを固定・分離させることで、翻訳効率の高いmRNAと低いmRNAを区別することである。まず、細胞にシクロヘキシミドを添加してリボソームの転位とRNA翻訳を抑制し、次に、処理した細胞から得られたライセートをショ糖密度勾配に載せて超遠心分離を行うことで、蓄積されたポリリボソームをその質量に応じて分離する。次に、最終ステップで翻訳効率の高い転写物と低い転写物を分離するため、グラジエントを等分に分画します。各分画に含まれる目的のmRNAの存在を検出するために、R-T-Q-P-C-Rを用います。最終的に、リボソームプロファイリングを利用することで、さまざまな生理学的および病態生理学的ストレスに応答した、mRNAの特異的な翻訳およびグローバルな翻訳の変化を検出することが可能です。PolyOneプロファイリングは、どのようなmRNAが選択され、Sストレス下で翻訳されるか、またそれによって細胞がどのようにこれらの条件に適応するのかといった、分子細胞生物学分野における重要な疑問に答えることができます。この手順を実演するのは、研究室の大学院生です。自動グラジエントメーカーを用いてショ糖密度勾配を調製するには、まずグラジエントメーカーの電源を入れ、勾配を保持するプレートを水平にします。プレートの水平出しが完了したら、「完了」をクリックしてください。次にグラジエントプログラムを選択するため、gradメニューを開き、リストを選択します。SW 41をクリックし、リストをスクロールして10〜50%グラジエント11ステッププログラムが表示されたら、Useを押します。次に、SW 41コニカル超遠心管をマーカーブロックにセットし、付属の細管マーカーを使用して、ブロックの上端に合わせてチューブに線を引きます。チューブを安定した場所にある適切なラックに設置し、提供された2本のカニューラを2本の10 milliliterシリンジに取り付けます。活性化溶液中のRNAを含む温めた蒸留水を数回ピペッティングして、シリンジを洗浄します。その後、水気を完全に取り除き、10% sucroseとcyclo heideを混合した液を一方のシリンジに満たし、カニューラを超遠心管の底まで挿入します。気泡が入らないように注意しながら、チューブに付けた印をわずかに超えるまで、溶液をゆっくりと分注します。次に、もう一方のシリンジに50% sucroseおよびcyclo heideを充填し、チューブに付着した余分な液体をワイプで拭き取ります。カニューラを使用して、50% sucrose溶液をチューブ内にゆっくりと注入します。溶液がマークの高さまで達したところで停止し、速やかにスムーズにカニューラを抜去します。10% sucrose溶液が上昇し、チューブの上端にメニスカスが形成されるはずです。次に、超遠心機用チューブをわずかに傾けて気泡を追い出し、キャップを装着します。マイクロピペットを用いて、キャップのリザーバー内にある余分な液体を取り除きます。チューブをグラジエントメーカーにセットし、ランボタンを押します。プレートが指定された角度に傾くことに注意してください。5秒間停止した後、グラジエントを形成するための回転が始まります。約2分後、グラジエントの形成が完了したことを知らせるビープ音が鳴ります。チューブをゆっくりとラックに移し、グラジエントを乱さないよう、キャップを上方へ素早く取り除きます。次に、あらかじめ調製した細胞溶解液を各スクロースグラジエントに260 unitsずつ慎重にロードし、超遠心機を用いて4 °C、260,343 ×gで1.5時間遠心分離します。勾配分画システムの装置をセットアップするには、まず分光光度計の電源を入れます。次に、フォルダアイコンを2回選択し、続いて戻る矢印を2回選択してホーム画面に戻り、フラクションコレクターをPolyZone法に設定して、フラクションコレクターのバルブが廃棄（waste）に設定されていることを確認します。ゴミ箱アイコンを指す矢印をクリックし、廃棄回収チューブの下に蒸留水を入れた250 mLのMIAフラスコを配置します。次に、チャートレコーダーで以下の設定を行います。感度ダイヤルをランプおよび光学系の設定に合わせ、ノイズフィルターを1.5に切り替えます。ピークセパレーターダイヤルをoffに、チャート速度ダイヤルを30 cm/hに設定し、分光光度計ユニット上部のベースライン調整ダイヤルを最大（max open）にします。その後、ポンプにシリンジとバレルを装着し、付属のネジと六角レンチを使用して固定します。revコマンドを高速で実行し、シリンジにチェイス溶液を満たします。次に、ポンプを直立位置に配置し、forwardコマンドを使用してチューブ内の空気を押し出します。続いて、RNaseフリー水を満たした超遠心チューブをホルダーに設置し、2つの黒い印が見えるまでカニューレでチューブを刺します。分注孔は2つのマークの間にあります。シリンジポンプをフォワードマニュアルモードで6.0 milliliters per minuteで開始します。チェイス溶液がチューブの3分の1まで満たされたら、速度をバリアブルに切り替え、流量を1.0 milliliters per minuteにします。次に、分光光度計のベースライン調整ダイヤルを回し、チャート上の電圧がゼロになるようにします。すると、廃液チューブからel Myaフラスコへ水が出始めます。その後、希望の感度を1.0 auに設定してください。感度の調整が完了したら、「baseline」ボタンを押し、レコーダーのオフセットダイヤルを回して、チャートレコーダー上のベースライン設定を10%の目盛りに合わせて調整します。ベースラインが安定したら、ポンプスイッチとチャート速度ダイヤルをオフにします。ポンプが停止したら、スイッチを「rev」の位置に切り替え、チェイス溶液を穿刺カニューレの最初の目盛りまで回収します。次に、遠心管を取り出し、少量のチェイス溶液を用いてカニューラ内の気泡を分散させ、グラジエントを分画する際にフローセルから漏出した可能性のある残留水を清掃します。続いて、ショ糖密度勾配を含む遠心管をホルダーに取り付け、カニューラでチューブに穴を開けます。その後、10本の2 mLマイクロ遠心チューブを分画コレクターのトレイの2番から11番のポジションに配置し、1番のポジションにウェストチューブを配置します。この際、キャップが上に突き出ないようにしてください。ポンプ制御ダイヤルをマニュアルに設定し、シリンジポンプの流量を6.0 milliliters per minuteに設定します。その後、アームが最初のチューブに到達した直後に、フラクションコレクターの再生ボタンを押します。一時停止ボタンを押し、アームの位置を調整して、フラクション分注バルブを開きます。次に、forwardコマンドを使用してポンプを始動させ、チャートレコーダーのペンを監視します。ペンが上方に振れ始め、サンプルがフローセルを通過していることが確認されたら、速やかに廃棄チューブをチューブ1に交換します。最初の液滴が回収された時点で、速やかにコマンドをリモートスタート、ストップ、および variable 1.0 milliliters per minute に切り替え、再生ボタンを押して、フラクションコレクターインターフェースに1分ごとに1 milliliterの分画を回収させます。最後に、青色の追液が最後のチューブに入ったら、ストップを押します。PolyZoneプロファイリングは、IRAsを介した翻訳におけるPDCD4の特異的な関与を実証するための重要な手法です。例えば、本実験では、HEK 293細胞を一過性に・トランスフェクションして内因性PDCD4レベルを枯渇させ、その後PolyZoneプロファイル分析に供しました。PolyZoneプロファイルの解析において変化が見られなかったことから、PDC D fourのレベルを低下させても、遺伝子の全般的な翻訳は阻害されなかった。SIコントロール群とIPD CD four処理群を比較したところ、非IRAs変異体であるXIAPのポリソーム分布は、処理群と未処理群の間で変化していなかった。対照的に、ISを保持する2つのmRNAであるXIAPおよびBCL XLのポリソーム分布は、著しく変化していた。PD CD4が欠損している場合、これら2つのmRNAの分布はヘビーリボソーム側へとシフトしました。XIAPおよびBCL XL mRNAの定常状態レベルに変化が伴っていないことから、これらの結果は、PDC D4レベルが低下した細胞においてXIAPおよびBCL XLの翻訳が促進されることを示しており、これはウェスタンブロッティングによってさらに確認されました。このビデオを視聴することで、ショ糖密度勾配を調製し、超遠心分離によってポリソームを分離することで、mRNAの翻訳効率を測定する方法について十分に理解できるはずです。

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生物学

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グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

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学ぶポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNA翻訳の評価方法。シクロヘキシミド処理と超遠心分離を用いて、ストレス条件下での翻訳効率の変化を検出し、細胞の適応メカニズムを解明する。

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

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