ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

本実験の全体的な目的は、ポリリボソームを固定・分離させることで、翻訳効率の高いmRNAと低いmRNAを区別することである。まず、細胞にシクロヘキシミドを添加してリボソームの転位とRNA翻訳を抑制し、次に、処理した細胞から得られたライセートをショ糖密度勾配に載せて超遠心分離を行うことで、蓄積されたポリリボソームをその質量に応じて分離する。

次に、最終ステップで翻訳効率の高い転写物と低い転写物を分離するため、グラジエントを等分に分画します。各分画に含まれる目的のmRNAの存在を検出するために、R-T-Q-P-C-Rを用います。最終的に、リボソームプロファイリングを利用することで、さまざまな生理学的および病態生理学的ストレスに応答した、mRNAの特異的な翻訳およびグローバルな翻訳の変化を検出することが可能です。

PolyOneプロファイリングは、どのようなmRNAが選択され、Sストレス下で翻訳されるか、またそれによって細胞がどのようにこれらの条件に適応するのかといった、分子細胞生物学分野における重要な疑問に答えることができます。この手順を実演するのは、研究室の大学院生です。自動グラジエントメーカーを用いてショ糖密度勾配を調製するには、まずグラジエントメーカーの電源を入れ、勾配を保持するプレートを水平にします。プレートの水平出しが完了したら、「完了」をクリックしてください。

次にグラジエントプログラムを選択するため、gradメニューを開き、リストを選択します。SW 41をクリックし、リストをスクロールして10〜50%グラジエント11ステッププログラムが表示されたら、Useを押します。次に、SW 41コニカル超遠心管をマーカーブロックにセットし、付属の細管マーカーを使用して、ブロックの上端に合わせてチューブに線を引きます。

チューブを安定した場所にある適切なラックに設置し、提供された2本のカニューラを2本の10 milliliterシリンジに取り付けます。活性化溶液中のRNAを含む温めた蒸留水を数回ピペッティングして、シリンジを洗浄します。その後、水気を完全に取り除き、10% sucroseとcyclo heideを混合した液を一方のシリンジに満たし、カニューラを超遠心管の底まで挿入します。

気泡が入らないように注意しながら、チューブに付けた印をわずかに超えるまで、溶液をゆっくりと分注します。次に、もう一方のシリンジに50% sucroseおよびcyclo heideを充填し、チューブに付着した余分な液体をワイプで拭き取ります。

カニューラを使用して、50% sucrose溶液をチューブ内にゆっくりと注入します。溶液がマークの高さまで達したところで停止し、速やかにスムーズにカニューラを抜去します。10% sucrose溶液が上昇し、チューブの上端にメニスカスが形成されるはずです。次に、超遠心機用チューブをわずかに傾けて気泡を追い出し、キャップを装着します。マイクロピペットを用いて、キャップのリザーバー内にある余分な液体を取り除きます。

チューブをグラジエントメーカーにセットし、ランボタンを押します。プレートが指定された角度に傾くことに注意してください。5秒間停止した後、グラジエントを形成するための回転が始まります。

約2分後、グラジエントの形成が完了したことを知らせるビープ音が鳴ります。チューブをゆっくりとラックに移し、グラジエントを乱さないよう、キャップを上方へ素早く取り除きます。次に、あらかじめ調製した細胞溶解液を各スクロースグラジエントに260 unitsずつ慎重にロードし、超遠心機を用いて4 °C、260,343 ×gで1.5時間遠心分離します。

勾配分画システムの装置をセットアップするには、まず分光光度計の電源を入れます。次に、フォルダアイコンを2回選択し、続いて戻る矢印を2回選択してホーム画面に戻り、フラクションコレクターをPolyZone法に設定して、フラクションコレクターのバルブが廃棄（waste）に設定されていることを確認します。ゴミ箱アイコンを指す矢印をクリックし、廃棄回収チューブの下に蒸留水を入れた250 mLのMIAフラスコを配置します。

次に、チャートレコーダーで以下の設定を行います。感度ダイヤルをランプおよび光学系の設定に合わせ、ノイズフィルターを1.5に切り替えます。ピークセパレーターダイヤルをoffに、チャート速度ダイヤルを30 cm/hに設定し、分光光度計ユニット上部のベースライン調整ダイヤルを最大（max open）にします。その後、ポンプにシリンジとバレルを装着し、付属のネジと六角レンチを使用して固定します。

revコマンドを高速で実行し、シリンジにチェイス溶液を満たします。次に、ポンプを直立位置に配置し、forwardコマンドを使用してチューブ内の空気を押し出します。続いて、RNaseフリー水を満たした超遠心チューブをホルダーに設置し、2つの黒い印が見えるまでカニューレでチューブを刺します。

分注孔は2つのマークの間にあります。シリンジポンプをフォワードマニュアルモードで6.0 milliliters per minuteで開始します。チェイス溶液がチューブの3分の1まで満たされたら、速度をバリアブルに切り替え、流量を1.0 milliliters per minuteにします。

次に、分光光度計のベースライン調整ダイヤルを回し、チャート上の電圧がゼロになるようにします。すると、廃液チューブからel Myaフラスコへ水が出始めます。その後、希望の感度を1.0 auに設定してください。

感度の調整が完了したら、「baseline」ボタンを押し、レコーダーのオフセットダイヤルを回して、チャートレコーダー上のベースライン設定を10%の目盛りに合わせて調整します。ベースラインが安定したら、ポンプスイッチとチャート速度ダイヤルをオフにします。ポンプが停止したら、スイッチを「rev」の位置に切り替え、チェイス溶液を穿刺カニューレの最初の目盛りまで回収します。

次に、遠心管を取り出し、少量のチェイス溶液を用いてカニューラ内の気泡を分散させ、グラジエントを分画する際にフローセルから漏出した可能性のある残留水を清掃します。続いて、ショ糖密度勾配を含む遠心管をホルダーに取り付け、カニューラでチューブに穴を開けます。その後、10本の2 mLマイクロ遠心チューブを分画コレクターのトレイの2番から11番のポジションに配置し、1番のポジションにウェストチューブを配置します。この際、キャップが上に突き出ないようにしてください。

ポンプ制御ダイヤルをマニュアルに設定し、シリンジポンプの流量を6.0 milliliters per minuteに設定します。その後、アームが最初のチューブに到達した直後に、フラクションコレクターの再生ボタンを押します。一時停止ボタンを押し、アームの位置を調整して、フラクション分注バルブを開きます。

次に、forwardコマンドを使用してポンプを始動させ、チャートレコーダーのペンを監視します。ペンが上方に振れ始め、サンプルがフローセルを通過していることが確認されたら、速やかに廃棄チューブをチューブ1に交換します。最初の液滴が回収された時点で、速やかにコマンドをリモートスタート、ストップ、および variable 1.0 milliliters per minute に切り替え、再生ボタンを押して、フラクションコレクターインターフェースに1分ごとに1 milliliterの分画を回収させます。

最後に、青色の追液が最後のチューブに入ったら、ストップを押します。PolyZoneプロファイリングは、IRAsを介した翻訳におけるPDCD4の特異的な関与を実証するための重要な手法です。例えば、本実験では、HEK 293細胞を一過性に・トランスフェクションして内因性PDCD4レベルを枯渇させ、その後PolyZoneプロファイル分析に供しました。

PolyZoneプロファイルの解析において変化が見られなかったことから、PDC D fourのレベルを低下させても、遺伝子の全般的な翻訳は阻害されなかった。SIコントロール群とIPD CD four処理群を比較したところ、非IRAs変異体であるXIAPのポリソーム分布は、処理群と未処理群の間で変化していなかった。対照的に、ISを保持する2つのmRNAであるXIAPおよびBCL XLのポリソーム分布は、著しく変化していた。

PD CD4が欠損している場合、これら2つのmRNAの分布はヘビーリボソーム側へとシフトしました。XIAPおよびBCL XL mRNAの定常状態レベルに変化が伴っていないことから、これらの結果は、PDC D4レベルが低下した細胞においてXIAPおよびBCL XLの翻訳が促進されることを示しており、これはウェスタンブロッティングによってさらに確認されました。このビデオを視聴することで、ショ糖密度勾配を調製し、超遠心分離によってポリソームを分離することで、mRNAの翻訳効率を測定する方法について十分に理解できるはずです。