病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

次の実験の全体的な目標は、精製された筋肉細胞をヒト患者の筋生検から分離し、それらを下流の研究のために不死化することです。これは、最初に収集した組織を秤量し、ミンチし、消化して単核細胞を解離させることによって達成されます。第2のステップとして、筋原性細胞は事実によって非筋原性細胞から精製されます。

次に、筋原性細胞をCDK 4とH Tertの両方に感染させて、不死化細胞を生成します。その結果、患者由来の生筋細胞は、細胞融合アッセイ、痙攣する筋管の存在、および筋原性マーカーの発現に基づいて、いくつかの継代で増殖し、分化できることが示されています。この技術の意味するところは、筋肉疾患の診断にとどまらず、薬物スクリーニングや多数の細胞が必要なその他の下流アプリケーションにおいて、筋原性細胞を無制限に提供できる可能性があります。

私は、ダラスのウッディ・ライト博士の研究室の博士研究員であるジェローム・ロビンと一緒に手順を実演します。筋生検を解離して筋原性細胞を精製することから始めます。まず、組織培養バイオセーフティフードで、筋生検の質量を記録します。

次に、10センチの皿で、滅菌メスを使用して組織を細かく刻みます。X-H-B-S-Sを数滴加えて、組織1グラムあたり組織が乾燥しないようにします。3.5ミリリットルのディスクペースト2と3.5ミリリットルのコラゲナーゼD溶液を加えます。

次に、25ミリリットルのピペットで細胞を混合し、プレートを15分ごとにインキュベーターに移します。90分以内に5ミリリットルのピペットで細胞を混合します。完全な組織の解離があるはずです。

組織が解離したら、2容量の増殖培地を加え、100ミクロンのストレーナーでろ過します。ろ液を50ミリリットルのチューブに集めます。.濾液から細胞を329 Gで室温で10分間ペレット

次に、細胞をHBSSに0.5%BS、Aで再懸濁し、カウントします。100マイクロリットルあたり100万個の細胞が得られるように容量を調整します。未染色のコントロールとして250, 000細胞のアリコートを取っておき、単一の染色コントロールのために2つの同様のアリコートを取っておきます。

これらはすべて FAX 分析に必要です。次に、100万細胞あたり5マイクロリットルの抗CD56抗体で細胞を染色し、すべてのサンプルを氷上で30分間インキュベートします。次に、サンプルを10ミリリットルのHBSSですばやく洗浄します。

次に、以前と同様に細胞をペレット化しますが、細胞をペレット化した後は摂氏4度で、上清を廃棄し、細胞ペレットを1ミリリットルあたり500万個の細胞で1つのX-H-B-S-Sに再懸濁します。次に、ヨウ化プロピジウムを最終濃度1ミリリットルあたり1マイクログラムまで加えます。次に、精製プレートに続く事実を使用して、非筋原性細胞から筋原性CD 56陽性細胞を精製します。

筋原性細胞は、0.1%ゼラチン培養物でコーティングされた6つのウェルプレートでウェルあたり50、000で、細胞が付着するまで、その後、不死の細胞株のウイルスに感染します。テキストプロトコルでは、テキストプロトコルに記載されているように、真皮線維芽細胞を精製および培養する方法についての追加レビューがあります。フェニックストロピック細胞をプラスミドPolyJet混合物で一晩インキュベートした後、フェニックストロピック細胞を調製します。

DME M1の4つの部分、培地の一部、1 99および10%の子牛血清からなる新鮮な培地の細胞を給餌します。また、変力剤の包装を準備します。PAは、ウェルあたり約400、000 PA 3 17セルの6ウェルプレートに17セル

12時間後、上清を含むウイルスをフェニックス熱帯細胞上に収集し、0.45ミクロンのフィルターに通します。次に、1ミリリットルの上清を使用してPAに3つの17細胞を感染させ、一晩培養します。翌日、PAからウイルス産生細胞株を3つの17細胞に選択し、細胞が共流暢に近いときに培地に0.5ミリグラム/ミリリットルの抗生物質を塗布し、12時間間隔で3回細胞から上清を採取します。

各収穫後にコレクションをフィルタリングします。濾液は、働くウイルス上清です。それを1ミリリットルに分けます。アリコート。

すぐに使用できるように、いくつかのアリコートを取っておきます。余分なアリコートは摂氏マイナス80度で保存できますが、凍結融解サイクルごとに効率が50%低下します。プロセス全体を通して、ウイルス粒子に触れた機器は、ゴミ箱に捨てる前に漂白剤を洗浄する必要があることに注意してください。

安定なPA three 17ウイルス産生細胞株を永久保存するには、細胞を10%DMSO 90%血清中で凍結し、ファックス精製細胞の各ウェルにマイナス150°Cで保存します。6ウェルプレートに、新たに製造したウイルス上清400マイクロリットルを加えます。ウイルスを含まない2つのウェルをコントロールとして残します。

プレートを一晩インキュベートし、翌日、各ウェルの培地を2.5ミリリットルの新鮮な筋肉培地に変更します。ウイルス粒子を含む培地やピペットは、必ず漂白剤容器に捨ててください。細胞を新鮮な筋肉培地で3日間インキュベートします。

次に、CDK 4感染の場合は1ミリリットルあたり400マイクログラムのネオマイシン、ヒトテロメラーゼの場合は1ミリリットルあたり300マイクログラムのハイグロマイシンを使用して、抗生物質耐性の細胞を選択します。逆転写酵素感染を1〜2週間。細胞とコントロールウェルがすべて死ぬまで、細胞を選択的条件下で維持します。

選択中であっても、細胞がコンフルエントになる前に常に細胞を継代し、60〜80%Coの流暢さに達した場合は、0.05%tripsin EDTA溶液を使用して細胞を収集し、通過させます。細胞を新鮮な筋芽球、抗生物質を中程度に含んだ10センチメートル皿に細胞を通します。まず、10センチメートルの皿あたり3〜500の非常に低い密度で細胞に播種します。

小さなコロニーが明らかなときに10〜20個の細胞の小さなコロニーが形成されるまで、これらの皿の細胞を約2週間維持します。細胞が乾燥するのを防ぐために、ほとんどの培地を取り除き、培地の薄いフィルムだけを残します。次に、クローニングリングの片側をシリコン真空グリースに浸し、リングを目的のクローンの上に置きます。

各リング内の目的のクローンごとに異なるリングを配置します。トリプシンEDTA溶液を数滴加えます。細胞が丸くなったら、顕微鏡を使用して、細胞の各ボールを200マイクロリットルのピペットチップに慎重に吸引します。

セルボールを利用可能な最小のマルチウェルプレートのウェルに移します。次に、必要に応じて各クローンを展開して、同時の流暢さを防ぎます。記載されたプロトコルを使用して、筋原性細胞を線維芽細胞、脂肪形成細胞、およびおそらく免疫細胞と共に単離し、次いで事実によって精製した。

次いで、サイクリン依存性キナーゼ4、CDK4、およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素hタートを発現するウイルスを用いて、記載されたように細胞を不死化した。分化プログラムに参加してミオチューブを形成し、不死化されていないコントロール細胞と不死化細胞のミオチューブの形成と収縮を比較することができるため、各ステップでディッシュを同時流暢さ未満に保つことが重要でした。違いは見られませんでした。

細胞株の不死化は、テロメアの長さとテロメア活性を測定することにより確認されました。不死性は、細胞の成長曲線からも明らかでした。このビデオを見れば、患者の生検から原発筋細胞を解離する方法を十分に理解できるはずです。

一次筋芽細胞を不死化し、不死化筋原性クローンを分離して選択します。ウイルスを扱うには、特定の組織培養と安全な換気システムを使用する必要があることを忘れないでください。さらに、ピペット、チップ、皿、注射器、フィルターなど、ウイルスの操作に関与するすべてのものを漂白して、不要な汚染を防ぐ必要があります。

ウイルス粒子は危険な場合があるため、この手順を実行する際には常に予防措置を講じる必要があります。