Name: 病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学ぶ筋生検からの患者由来筋細胞の単離と不死化手法。FACSによる精製とCDK4・hTERT導入により、筋疾患モデリングや創薬スクリーニングに利用可能な無限増殖細胞を樹立する方法を解説します。

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この出版物は、Association Contre Les Myopathies(AFM)助成金(プロジェクト16297)であるCure CMDと、国立衛生研究所(助成金番号K08 AR059750、L40 AR057721、および2R01NS047727)によって資金提供されています。

注：ヒト組織の収集のためのプロトコルを見直し、制度IRB委員会によって承認されなければならない。廃棄された、デ同定されたヒト組織の収集は、ボストン小児病院とブリガム·アンド·ウィメンズ病院IRB委員会によって承認されています。以下に記載される方法は、非識別破棄組織からの筋原細胞の単離のために適用されている。記載された方法は同意患者材料から採取した組織にも適用可能である。 1.細胞の単離<ol><li>筋生検と筋原細胞の精製の解離<ol><li>組織培養バイオセーフティーフード内で10cmの組織培養プレートを、予め計量し、解離される組織の量を計算するために筋生検を含む再度計量プレート。 </li><li>細かく、ミンチの筋肉組織を無菌メスを使用し、乾燥から組織を防ぐために、滅菌1X HBSSを数滴を追加します。 </li><li> 3.5ミリリットルのジのそれぞれを追加します。のSPase IIおよび筋組織のグラムあたりのコラゲナーゼDを消化する。無菌の25mlピペットを通して数回に細分化した組織と酵素溶液をピペット。 15分間、5％CO 2、37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートし、スラリーを簡単に無菌の5mlのピペットも通過するまで組織を消化する。 注：組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。詳細は、「代表的な結果」セクションを参照してください。 </li><li> 329 XG（〜1100 rpm）で、室温で10分間50ミリリットルの円錐管とペレットの細胞の上に100μmのセルストレーナーを通して解離した組織、フィルタに滅菌成長培地の2ボリュームを追加します。培地組成のための材料の表を参照してください。 </li><li>滅菌増殖培地の1容積にペレットを再懸濁し、赤血球溶解液を7ボリュームを追加。 40μmのセルストレーナーを通して溶液をフィルタリングし、その後Tペレット329×gで、室温で10分間、彼は細胞。 </li><li>血球計数器で細胞を数え、1×10 6細胞/ 100μlの濃度で1X HBSS、0.5％BSAで細胞を懸濁します。ネガティブ（非染色）を対照として使用される単一の管に置い〜250,000細胞を設定します。脇FACS選別によりCD56陽性細胞の適切なゲーティングのために必要とされるヨウ化プロピジウムおよびCD56のための追加単色染色コントロール管を、設定してください。並べ替えマニュアルを細胞又は適切なコントロールを確実にするために中核施設の専門家をFACSソーティングが含まれていると相談を参照してください。 </li><li>抗CD56抗体の5μlの/ 10 6細胞でソートする細胞を染色する。氷上で30分間（対照を含む）すべてのサンプルをインキュベートする。 </li><li>冷却遠心機中で329×gで（〜1100 rpm）で10分間、10ミリリットル1×HBSS、ペレット細胞における洗浄サンプル、4℃の温度。 </li><li> SORである試料には1μg/ mlの最終濃度でヨウ化プロピジウムを追加死細胞を排除するためのテッド。蛍光活性化セルソーターを使用して非筋原細胞から筋原CD56陽性細胞を精製する。 </li></ol></li><li>皮膚生検の解離 NOTE：筋肉生検を入手できない場合真皮線維芽細胞は、患者からの皮膚パンチから単離することができる。真皮線維芽細胞は、筋原細胞を生成するためのMyoDでの形質導入を含む多くの研究のための生体材料として使用することができます。さらに、真皮線維芽細胞は、さらなる研究のために種々の細胞型に分化させることができるiPS細胞を生成するために用いることができる。 <ol><li>輸送培地中の研究室に皮膚生検を輸送する。サンプルが受信されると、できるだけ早く初代培養を行う。初代培養は、同じ日に確立できない場合、一晩室温で試料を保管。 </li><li>層流フード内で無菌の35mmのペトリ皿に皮膚生検を転送する。 </li><li>無菌の1とペトリ皿に皮膚生検をすすぐX PBSを血液や破片を除去する。滅菌メスで脂肪組織を削除します。 </li><li> 2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を追加し、外科用メスで組織をミンチ、組織の大きさに応じて、1時間に45分間37℃でインキュベートする。 </li><li> 15mlのコニカルチューブに消化された組織を転送回線維芽細胞培養培地2mlでペトリ皿をすすぎ、そして同じチューブに培地を収集する。 </li><li>室温で5分間、200×gで細胞をペレット。 </li><li>上清を捨て、コラゲナーゼを除去するための線維芽細胞培地3mlでペレットを洗浄し、再び細胞をペレット。培地組成のための材料の表を参照してください。 </li><li>ステップ1.2.7 1より多くの時間を繰り返します。 </li><li> T25無菌組織培養フラスコ上に5ミリリットル線維芽細胞培地プレートの細胞ペレットを再懸濁する。 5％CO 2、37℃でフラスコをインキュベートする。 </li><li>次の1〜3日間の線維芽細胞の付着と成長のための文化を評価します。&lt;BR /&gt;注：一部の小規模な組織片を、プレートに取り付けることができ、線維芽細胞は、これらの組織片の外に移動する。 </li><li>線維芽細胞が約80％コンフルエンスまで増殖させるまで、同様の条件下で培養を維持する。 </li><li>トリプシン処理により繊維芽細胞を収集し、追加の拡張のために新鮮な培養フラスコに移す。のCa ++およびMg ++を含まない培養液を1×PBSで3回洗浄することによりトリプシン処理を実行します。 37℃で2分間細胞（2ミリリットル/ T25フラスコ）にトリプシン-EDTAを（材料表を参照）を追加します。 </li><li>追加のフラスコに剥離した細胞を分割。いくつかの組織片は、元のT25フラスコに取り付けたままにした場合、このフラスコに5ミリリットルの新鮮な培地を追加し、より多くの線維芽細胞は、継続的に行わ移行する。 注：拡張され線維芽細胞培養は、P1として凍結し、および将来の実験のために液体窒素中で保存することができる。 </li></ol></li></ol>筋原細胞の2不死<ol><li&gt;を一晩4の比率のDMEMと培地199 10cmの滅菌組織培養プレート中にプレート500万フェニックス同種指向性パッケージング細胞（PE）：10％ウシ血清を補充した1、。 </li><li> 10 mMのカフェインを補足した新鮮な培地の5ミリリットルを用いたトランスフェクションの30分前にフィード細胞。 </li><li>ミディプレップ（CDK4またはhTERTのプラスミド）およびpolyjetからのプラスミドDNAを2μgの混合物を均質化し、製造業者によって推奨されるように、15分間室温でインキュベートする。 </li><li>一晩PE細胞にプラスミド/ polyjet混合物を追加します。 </li><li>新鮮な培地を供給した細胞（DMEMと4の割合で199培地：10％ウシ血清を補充した1）。 12時間後、ウイル​​ス含有上清を収集し、0.45μmの孔径のフィルターを通して濾過する。 </li><li> G41（いずれかの0.5mg / mlのネオマイシンを選択した後、一晩両栄養性パッケージング細胞系統PA317 5に感染し 、安定なウイルス産生細胞株を得るために収集された上清1mlを使用8）CDK4または0.5ミリグラムのために/ hTERTのためのmlハイグロ。 </li><li> 3収穫のために毎朝、夕方と朝の上清を収穫その後、近くに密集するまで安定したパッケージング細胞を増殖させることによって作業ウイルス上清を準備します。 </li><li>ウイルス上清を濾過し、直接、後で使用するために-80℃で1ミリリットルのアリコートとストアに使用したり、それらを分ける。ウイルス上清は、それぞれの凍結融解で50％の感染効率を失うことに注意してください。ウイルス粒子に触れたすべてのものを廃棄する前に洗浄を漂白することを忘れないでください。 注：安定PA317ウイルス産生細胞株は、（凍結培地は、10％のDMSOで90％血清）永久記憶のために-150℃で凍結させ、維持することができる。 </li><li>プレートFACS精製筋原細胞/ウェル、0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレート中で5×10 4細胞の密度で（1.1から1.9のステップで説明する）。細胞がウイルス感染を進める前に、プレートに接続されていることを確認。 </li><li> F、フィルタ400μLを追加reshly（コントロールとして2つのウェルを維持する）一晩各6ウェルプレートにウイルス上清または冷​​凍アリコートを生産した。 </li><li> 2.5ミリリットル/ウェルの新鮮筋肉メディア（4で細胞を供給することにより、培地を変更します; 0.02 M HEPES緩衝液、1.4 mg / LのビタミンB12; 15％ウシ胎児血清を補充した1ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および培地199 0.03ミリグラム/ LのZnSO 4、0.055 mg / Lのデキサメタゾン、2.5μg/ Lで、肝細胞増殖因子および10μg/ L塩基性線維芽細胞成長因子）。漂白剤容器内にウイルス粒子を含む培地とピペットを捨てます。どちらを400μg/ mlのネオマイシン（CDK4感染症）または300 / mlのハイグロ（hTERTの感染）を使用して、選択のための治療、その後、感染から回復するために3日間同じ培地中の細胞のままにしておきます。 </li><li>制御皿ダイ内の細胞（1〜2週間）まで、薬剤選択の下で細胞を維持する。 </li><li>さえのSelectI中に、（EDTA、トリプシン、0.05％を使用して60〜80％の集密度）、継代細胞コンフルエントになる前に期間に。選択薬剤を補った新鮮な筋芽細胞培地で複数の10センチメートル皿でReplate細胞（2.11に記載されている）。完全に均一に遺伝的背景（すべてのセルにおける導入遺伝子の同じ挿入）を取得するために不均一集団またはクローンなどの不死化、選択したセルを維持します。 </li><li>次の手順を使用してクローン選択を実行します。 <ol><li> （10cmの皿で例えば 300から500細胞）の低密度で細胞を播種し、小さなコロニーは（10〜20セル）が形成されるまで、約2週間のためにそれらを維持する。 </li><li>乾燥から細胞を防ぐために、薄膜のみを残して、この時点で、培地のほとんどを除去する。 </li><li>各所望のクローンの上（一端とシリコーン真空グリースに浸し）クローニングリングを配置し、トリプシン/ EDTAの数滴を追加します。 </li><li>収穫細胞は、彼らは慎重に1ミリリットルチップまたはパスツールピペットを用いて細胞を吸引し、最小の利用可能なマルチウェルPLAにそれらを転送することによって丸くなるたらTE（96または48、24または12ウェルプレート）。 </li><li>地元の集密度を防ぐために、必要に応じてクローンを展開します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

便利な資源としての細胞疾患のインビトロモデルにおけるまたは疾患の表現型を確立する際に筋原細胞集団の単離および文化は極めて有用である。ここで説明する筋原細胞単離手順は、次に、伝播分化、またはすぐに分析することができる骨格筋標本からの筋芽細胞および線維芽細胞の単離を可能にする。筋芽細胞の構造および機能は、細胞生存、細胞融合の評価の評価、ま​​たはRNAもしくはタンパク質発現の分子的研究を介して、顕微鏡検査を介して評価することができる。さらに、筋芽細胞は、組織損傷後の筋肉の発達及び回復の文脈における筋芽細胞機能の直接的な評価を可能にする、未成熟筋線維の多くの特徴を共有して筋管に分化させることができる。これらの表現型の全ては、筋原細胞の初期の継代ではかなり再現性がある傾向があるが、多くの主要メートルの挙動yogenic細胞株は、多くの継代にわたって変更することができる。その結果、より長期間にわたって培養の確立を容易にし、再現性のある結果の生成を容易にすることができる特定の筋原細胞株（ここで説明したように）、不死化することが望ましい場合がある。 <...

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Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

分子診断は過去20年間で劇的に進化しました。 ゲノムDNAは、以前は採血が必要だったが、現在では喀痰や頬のぬぐい液から日常的に分離されている。 現在の迅速なターンアラウンドタイムと遺伝子シーケンシングの容易さにより、多くの疾患の突然変異は、追加の検査を必要とせずに日常的に特定されています。 筋疾患の診断の場合、過去10年間に筋ジストロフィーまたはミオパチーの原因となる数十の新しい遺伝子が同定されたことで、これらの疾患の診断方法が劇的に変化しました1,2。 現在、筋ジストロフィーや先天性ミオパチーの原因として特定されている遺伝子は数十種類ありますが、これらの遺伝子の多くが疾患を引き起こすメカニズムは不明のままです。 特に、希少疾患は、患者集団の規模が小さいため、課題となっています。 これらの症例や、より一般的な疾患については、病因のメカニズムや治療薬のスクリーニングに関する研究を容易にする安定したツールの生成が非常に望ましいです。
DNA診断の劇的な進歩にもかかわらず、一次診断を確立するために筋生検が依然として行われています。これは、原発性代謝疾患または筋疾患が疑われる多くの患者において行われます。 筋生検が必要な場合、患者にとって追加の罹患リスクを最小限に抑えながら、追加の診断および研究組織を収集する機会を提供します。 各組織標本には多くの用途があるため、手術用組織を使用した初代細胞培養の技術は、簡単で効率的で、必要な組織量が最小限に抑えられることが非常に望ましいです。 組織からの初代細胞の分離を最大化し、生物質を長期保存するには、筋肉生検または皮膚生検の適切なトリアージが必要です。 さらに、幹細胞研究と薬物スクリーニングは、細胞ベースのアッセイ3,4を使用して多くの疾患の治療法を開発するために大きな期待を寄せています。
ここでは、ヒトの筋肉または皮膚の生検から初代細胞を単離する方法を説明します。 さらに、筋原性細胞の不死化のためのプロトコルが含まれており、これは個体から多数の細胞を生成するのに役立ちます。 これらの細胞は、一次組織から得られる細胞の数が全体的に少ないため、他の方法では達成できないカスタムドラッグスクリーニングなどのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

<table><tbody><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ&nbsp;文化用バイオセーフティフード</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>モデルSterilGuardフード</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機、ベックマンモデル&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>モデル アレグラ 6R</td><td>細胞選別を行う場合は、冷蔵式の遠心分離機が望ましい</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>モデル エクリプス TS100</td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター、CO2に接続 ソース</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>シリーズII</td><td></td></tr><tr><td>蛍光活性化セルソーター(FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>組織からの</td><td></td><td></td><td></td>一次筋芽細胞の単離用試薬</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>コラゲナーゼD&nbsp;</td><td>ロシュ・アプライド・サイエンス</td><td>#088882001</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Sterile Hank' の原液を調製します。s バランス生理食塩水 (HBSS)、カルシウムおよびマグネシウムフリー</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクション V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>FACSソーティング用の1X HBSS 0.5% BSAの無菌溶液を準備し</td></tr><tr><td>ます 筋芽細胞用の無菌増殖培地:ダルベッコのモディファイドイーグル」高グルコース(4.5g)を添加した培地(DMEM)に30%ウシ胎児血清を添加</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>L-グルタミン</td></tr><tr><td>RBC溶解液</td>を含む <td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウムストック 10mg/ml</td><td>シグマ</td><td>P4170</td><td>滅菌蒸留水で粉末を希釈してストック溶液を調製</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー用抗ヒトCD56抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>318310</td><td>APC標識抗体、その他のラベルは</td></tr><tr><td>、初代筋芽細胞の不死化のための試薬です</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エコトロピック包装細胞株 PE</td><td>細胞バイオラボ</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>両性包装細胞株 PA3174</td><td>細胞バイオラボ</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>豚皮ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G1890-500g</td><td>0.1%ゼラチンを水に溶かした原液を調製します。皿を37°Cの溶液でコーティングします。Cを1時間。溶液を取り出し、培地を追加します。</td></tr><tr><td>ポリジェット&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418 Fisher</td><td></td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT</td><td>not commercially available</td><td></td><td>Stadler et al, 2013</td></tr><tr><td>Qiagen plasmid midiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>ミディアム 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>ミックス 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>筋芽細胞増殖培地: 4:1 ダルベッコ's modified Eagle Medium (DMEM) および Medium 199 に 15% ウシ胎児血清を添加しました。0.02 M HEPESバッファー;1.4 mg / LビタミンB12;0.03 mg/L ZnSO4、0.055 mg/L デキサメタゾン、2.5 &mu;g/L 肝細胞増殖因子と 10 &mu;g / Lベータ線維芽細胞成長因子。</td><td>ライフテクノロジー(DMEM、F199);アトランタバイオロジカル(FBS);インビトロジェン(Hepes);フィッシャー(硫酸亜鉛);シグマ(Vit.B12、デキサメタゾン);ケミコンインターナショナル(HGF);バイオパイオニア(betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (ヘペス); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12、Dex);GF116(HGF);HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>培地と原液Vit.B12(20mg / ml)を調製します。硫酸亜鉛(60&micro;g/ml);デックス(55&micro;g/&micro;l)使いやすくするために別途。HGFストック溶液(5μ;g/ml)およびFGF(20μ;g / ml)は、最終作業濃度で毎週新たに追加する必要があります。</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>免疫染色用ミオシン重鎖抗体</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF20</td><td>Clone MF20</td></tr><tr><td>Desmin 免疫染色用抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Clone D33</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>一次皮膚線維芽細胞単離用試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>輸送培地:RPMI 1640 10% ウシ胎児血清と 0.2% ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>RPMI 培地 1640:GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>ヒト初代線維芽細胞培地:RPMI 1640 10% ウシ胎児血清と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン</td> ウ<td>シ胎児血清:Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ溶液:コラゲナーゼ2型(100mg)を12.5 mlの線維芽細胞培養培地およびフィルター滅菌に再懸濁</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)カルシウムおよびマグネシウムフリー</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>一次筋芽細胞</td><td></td><td></td><td></td>の単離用材料</tr><tr><td>50 mlおよび15 mlの滅菌コニカルチューブ</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4(50ミリリットル);C3394-1 (15 ml))</td><td></td></tr><tr><td>滅菌メス</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 5、10、25 ml ピペット</td><td>Bellco glass</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)</td><td>再利用可能なピペットは、使用前に洗浄、綿の差し込み、オートクレーブ滅菌</td></tr>されます <tr><td>滅菌組織培養処理プラスチック皿 (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ナイロン細胞ストレーナー (100 & マイクロ;mおよび40 &micro;mサイズ)</td><td>BDファルコン</td><td>352340(40&micro;m);352360 (100&micro;m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;筋芽細胞の不死化</td><td></td><td></td><td></td>のための材料</tr><tr><td>Sterile 0.45 &micro;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Cloning rings</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>使用前後の洗浄とオートクレーブ</td></tr>滅菌 <tr><td>線維芽細胞株用材料&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌35 mm組織培養処理プラスチック皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>滅菌メス</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>滅菌T25組織培養フラスコ</td><td>テクノプラスチック製品、TPP</td><td>90026</td><td>MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLEエクスプレス</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr>によって米国で販売され</tbody></table>ています

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

患者特異的な細胞株の生成は、診断研究やトランスレーショナル研究のための非常に貴重なツールであり、これらの細胞は患者の診断精密検査中に利用可能な皮膚または筋肉生検組織から収集することができます。 このプロトコールでは、初代細胞培養のための少量の筋肉または皮膚組織からの生細胞単離の技術について説明します。 さらに、初代細胞からの筋原性細胞株および線維芽細胞株を不死化する技術を提供します。 細胞株が不死化されると、患者由来の細胞の大幅な増殖を達成できます。 不死化細胞は、薬物スクリーニングや遺伝子変異のin vitro修正など、多くのダウンストリームアプリケーションに適しています。全体として、これらのプロトコルは、ダウンストリームアプリケーション用の患者由来細胞を生成および保存するための信頼性の高いツールを提供します。

図1は、一次組織解離に関与する重要なステップのいくつかを示しています。組織の正確な量は、無菌組織培養シャーレ（ 図1A、B）に秤量する。組織スラリー（ 図1C、D）が得られるまで、次に組織を微細に、無菌の外科用メスを用いて細かく切り刻まれる。消化酵素を添加した後、一次筋組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。組織消化の進行は、典型的には、過剰消化し、細胞死を防ぐために、すべての15〜20分を監視している。酵素消化を穏やかに15〜20分毎に数回ピペッティングし、混合することができる。消化工程の最後に、細胞は、100μm（ 図1E、F）、次いで40ミクロンのフィルターを通して濾過する。解離した一次セル、筋肉組織の出発量を、サンプルが軽度または重度の影響を受けた筋肉から得られるかどうかに応じてlsが不均質になる。 図1Gは、図1Hは組織培養皿中で消化し ​​、プレーティングの解離した一次細胞で3-6時間の例を示してすぐに、消化後に懸濁液中の単...

このプロトコルは、筋肉または皮膚組織からの筋原性および線維芽細胞株の生細胞単離および初代培養の技術について説明しています。 これらの細胞株を不死化するための技術についても説明する。 全体として、これらのプロトコルは、ダウンストリームアプリケーション用の患者由来細胞を生成および保存するための信頼性の高いツールを提供します。

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

本実験の全体的な目的は、ヒト患者の筋生検組織から精製された筋細胞を単離し、その後の研究に向けて不死化させることです。まず、採取した組織を計量して細切し、消化することで単核細胞を分散させます。次に、FACSを用いて筋原性細胞を非筋原性細胞から精製します。次に, 不死化細胞を生成するために, 筋原性細胞にCDK4とhTERTの両方を感染させます。その結果, 患者由来の生存筋細胞を数代にわたって継代・拡大させることができ, 細胞融合アッセイ、収縮する筋管の存在, および筋原性マーカーの発現に基づいて分化させることが可能であることが示されました。この技術の意義は筋疾患の診断にとどまらず, 薬剤スクリーニングやその他の大量の細胞を必要とするダウンストリームアプリケーションに, 無制限の筋原性細胞を提供できる可能性がある点にあります。ダラスのWoody Wright博士の研究室のポストドクターであるJerome Robbinと共に、本手順を実演します。まず、筋原細胞を精製するために、筋生検組織の解離から開始します。まず、組織培養用バイオセーフティキャビネット内で、筋生検組織の質量を測定します。次に、10 cmのディッシュ内で、滅菌スカルペルを用いて組織を細かく刻みます。組織1 gあたり数滴の1 X-H-B-S-Sを加え、組織が乾燥しないようにします。ここに、ディスクペースト2を3.5 mL、およびコラゲナーゼD溶液を3.5 mL加えます。次に、25 mLピペットで細胞を混合し、15分ごとにプレートをインキュベーターに戻します。90分以内に5 mLピペットで細胞を混合します。これにより、組織が完全に解離しているはずです。組織の分散後、2倍量の増殖培地を加え、100 micronのストレーナーでろ過します。ろ液を50 milliliterチューブに回収します。ろ液から細胞を室温で329 G、10分間遠心分離してペレット化します。次に、細胞を0.5% BSおよびAを含むHBSSに再懸濁し、細胞数をカウントします。100 µLあたり100万個の細胞数になるよう液量を調整します。25万個の細胞を分注して未染色コントロールとして取り分けておき、同様に2つの分注量をシングル染色コントロールとして取り分けておきます。これらはすべてフローサイトメトリー解析に必要です。次に、細胞100万個あたり5 µLの抗CD 56抗体で細胞を染色し、すべてのサンプルを氷上で30分間インキュベートします。その後、10 mLのHBSSでサンプルを速やかに洗浄します。その後、前述と同様に細胞をペレット化しますが、この際は4 °Cで行います。細胞をペレット化した後、上清を除去し、細胞ペレットを1X HBSSで1 mLあたり5 × 10⁶個の濃度で再懸濁します。次に、最終濃度が1 µg/mLとなるようにプロピジウムヨードを添加します。これで、精製プレートを用いてFACSにより、非筋原性細胞から筋原性CD56陽性細胞を精製します。0.1%ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートに、筋原性細胞を1ウェルあたり50,000個で播種し、細胞が付着するまで培養した後、細胞株を不死化させるためにウイルスを感染させます。テキストプロトコルには、皮膚線維芽細胞の精製および培養方法に関する詳細な手順が記載されています。PolyJetプラスミド混合液とともにフェニックス・トロピック細胞を一晩インキュベートし、細胞を調製します。DME M1、medium 1 99、および10%牛血清を各1等量ずつ混合した新鮮な培地を細胞に添加します。また、等張性パッキング溶液を準備します。6ウェルプレートに、1ウェルあたり約400,000個のPA3-17細胞を播種します。12時間後、Phoenix tropic細胞の上清からウイルスを回収し、0.45 micronフィルターでろ過します。次に、この上清を1 milliliter使用してPA three 17細胞に感染させ、一晩培養します。翌日、細胞がほぼコンフルエントになった時点で、培地に0.5 milligrams per milliliterの抗生物質を添加してPA three 17細胞からウイルス産生細胞株を選別し、12時間間隔で3回、細胞から上清を回収します。各回収後にコレクションをろ過してください。ろ過液をウイルス含有上清として使用します。これを1 mLずつ分注してください。いくつかの分注サンプルを直ちに使用するために取り分けておきます。予備の分注サンプルは-80°Cで保存可能ですが、凍結融解サイクルを1回繰り返すごとに効率が50%低下します。全工程を通じて、ウイルス粒子に接触した器具は、廃棄箱に捨てる前に次亜塩素酸ナトリウムで洗浄する必要があることに留意してください。安定したPA three 17ウイルス産生細胞株を永久保存するには、10% DMSOおよび90%血清で細胞を凍結し、各ウェルに精製細胞を分注して-150 °Cで保存してください。6ウェルプレートに、調製したばかりのウイルス上清を400 µLずつ加えます。対照として、2つのウェルにはウイルスを加えないでください。プレートをオーバーナイトでインキュベートし、翌日、各ウェルの培地を2.5 millilitersの新しい筋肉用培地（muscle media）に交換します。ウイルス粒子を含む培地およびピペットは、必ず漂白剤入りの廃棄容器に廃棄してください。その後、細胞を新しい筋肉用培地で3日間インキュベートします。次に、CDK4感染には1 mLあたり400 µgのネオマイシンを、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素感染には1 mLあたり300 µgのハイグロマイシンを用いて、抗生物質耐性細胞を選択します。この選択を1〜2週間継続します。細胞とコントロールウェルのすべてが死滅するまで、選択条件下で細胞を維持してください。細胞がコンフルエントになる前に必ず継代してください。選択期間中であっても、コンフルエンシーが60から80%に達した時点で、0.05% trypsin EDTA溶液を用いて細胞を回収し継代します。抗生物質を含む新鮮なmyoblast mediumを用いて、10 centimeterディッシュに継代してください。初回は、10 centimeterディッシュあたり3〜5×10⁵個という非常に低い密度で細胞を播種します。これらのディッシュ内で細胞を約2週間維持し、10から20個の細胞からなる小さなコロニーが形成され、それが明確に観察されるまで培養します。培地の大部分を取り除き、細胞の乾燥を防ぐために薄い膜状の培地だけを残します。次に、クローニングリングの一方をシリコン真空グリースに浸し、目的のクローンに合わせてリングを配置します。各リング内の目的とする各クローンを個別のリングで囲みます。トリプシンEDTA溶液を数滴加えます。細胞が丸くなったら、顕微鏡を用いて各細胞塊を200 µLピペットチップで慎重に吸引します。細胞塊を、使用可能な最小サイズのマルチウェルプレートのウェルに転移させます。その後、共流動を防ぐために、必要に応じて各クローンを拡大培養します。上述のプロトコルを用い、筋原性細胞を線維芽細胞、脂肪原性細胞、およびおそらく免疫細胞と共に単離し、その後 FACS によって精製しました。その後、サイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）を発現するウイルスを用いて、記述された方法で細胞を不死化させた。各工程において、細胞が分化プログラムに入り筋管を形成する可能性があるため、ディッシュ内の細胞密度をコンフルエント以下に維持することが極めて重要であった。非不死化コントロール細胞と不死化細胞における筋管形成および収縮を比較した結果、差異は見られなかった。テロメア長およびテロメア活性の測定により、細胞株の不死化が確認されました。また、細胞増殖曲線からも不死化が認められました。このビデオを視聴することで、患者の生検組織から一次筋細胞を分離する方法について十分に理解できるはずです。初代筋芽細胞を不死化し、不死化した筋原性クローンを単離および選択します。ウイルスの取り扱いには、専用の組織培養フードと安全な換気システムの使用が必要であることに留意してください。さらに、不要な汚染を避けるため、ピペット、チップ、ディッシュ、シリンジ、フィルターなど、ウイルスの操作に使用したすべての器具を次亜塩素酸ナトリウムで消毒する必要があります。ウイルス粒子は危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する際は常に予防措置を講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

このプロトコルは、エレクトロポレーションを利用して、マウスの筋線維に蛍光標識タンパク質を導入し、発現させます。エレクトロポレーション後の回収後、繊維は分離されます。次に、個々のファイバーを高解像度共焦点顕微鏡を使用して画像化し、筋肉構造を視覚化します。...

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。...

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。...

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。...

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。...

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶ筋生検からの患者由来筋細胞の単離と不死化手法。FACSによる精製とCDK4・hTERT導入により、筋疾患モデリングや創薬スクリーニングに利用可能な無限増殖細胞を樹立する方法を解説します。

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

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