マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

次の実験の全体的な目標は、in vitroでマウスの直腸における外因性求心性神経終末を機能的に特徴付けることです。これは、結腸直腸と付着した骨盤または腰椎のSplunk首神経を連続体で採取し、組織をin vitro記録チャンバーに配置することによって達成されます 第2のステップとして、骨盤または腰椎のSplunk首神経幹を細いフィラメントに分割して、個々の神経軸索から単繊維電気生理学的記録を行うことができます。次に、個々の結腸直腸神経終末は、受容野の偏りのない電気刺激によって特定され、3つの異なる機械的刺激に対する応答プロファイルに基づいて機能的に分類されます。

さらに、神経終末に適用される化学物質に対する反応は、真鍮のチューブで受容野を分離し、溶液を化学物質または化学物質の混合物を含む溶液に置き換えることによってテストできます。結果は、マウスの結腸直腸が5つの異なるクラスの機械感受性ensによって神経支配されていることを示しています。さらに、結腸直腸のensの約25%は、機械的に鈍感であるか、サイレント侵害受容器です。

この方法は、結腸直腸の感覚神経支配を研究するために私たちや他の人々によって使用されます。多くの胃腸障害は、感覚神経支配の感作または興奮性の変化に関連しているため、この研究アプローチを使用することに関心があります。感作のメカニズムを理解することへの私たちの関心は、過敏性腸症候群などのこれらの胃腸障害に通常関連する痛みや不快感を調整するのに役立つ可能性のある治療戦略の開発を支援したいという私たちの願望に関連しています。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、組織の解剖と神経分裂のステップを習得するのが非常に難しいため、非常に重要です。神経が革新する。遠位結腸直腸は、解剖中に容易に損傷を受ける可能性があります。

したがって、慎重な解剖と分割ステップがあることは、この実験を再現したい人にとって非常に重要です。マウスを安楽死させた直後に、それを放血し、胸腔を切り開き、右心房を穿孔し、マウスの死体を浸し、約半リットルの氷冷したクレブ溶液を浸します。次に、結腸と骨盤内臓器を除くすべての内臓を慎重に取り除きます。

次に、マウスの体を胸部横隔膜の少し上の約T 12で横断し、体の半分のコドルを氷冷泡クレブス溶液を含む解剖チャンバーに移します。ステレオスコープの下で、膀胱と生殖器官の接合部を尿道に横断することにより、膀胱と生殖器官を切除します。また、下行大動脈が総腸骨動脈に分岐するまで下行大動脈を切除します。

次に、骨盤または腰椎の扁桶頸部の神経を周囲の組織から解放します。腸骨稜の外側から神経をたどり、脊柱への入り口まで進みます。骨盤神経はL、6、S、椎骨1本、腰部潘神経はT13、L1に入ることが実証されています。

こちらが左右の骨盤神経の解剖です。次に、恥骨合成を切断し、左右の寛骨臼関節を切断します。次に、腸骨を取り除きます腸骨を取り除いた後、付着した神経で遠位結腸直腸を解剖します。

周囲の筋肉や結合組織から付着した神経。神経は機械的な損傷を受けやすいです。私たちは周囲の組織から解放されているので、神経を引っ張ったり挟んだりしないように特別な注意を払う必要があります。

次に、神経が付着した結腸直腸を組織室に移します。結腸直腸を抗腸間膜境界に沿って縦方向に開き、結腸直腸粘膜側を上に配置します。次に、神経を記録コンパートメントに拡張し、記録コンパートメントはマウスの穴とゲートでバスコンパートメントに接続されています。

神経幹を小さなガラスの鏡の上に置きます。鏡は親水性で、神経がそれに付着します。次に、記録コンパートメントの隣に、結腸直腸の腸間膜の端を固定します。

次に、バスコンパートメントを温かい酸素化されたCreb溶液とスーパーフュージングし、録音コンパートメントにミネラルオイルを充填してセットアップを完了します。結腸直腸の抗腸間膜の長さを、実体顕微鏡下の力アクチュエータに接続されたフックのレーキに高倍率で取り付けます。細い鉗子を使用して、孤立した骨盤または腰椎の板首の神経から神経鞘を慎重に剥がします。

神経幹を5〜8個の神経束にからかい、それぞれ約100ミクロンの厚さにします。次に、参照電極を組織チャンバー内のクレブス溶液と接触させます。次に、個々の神経束を記録電極に順次配置して、結腸直腸膜から活動電位を呼び起こします。

柔らかい絵筆を使用して結腸直腸の表面をやさしく撫でます。したがって、結腸を神経支配する神経束を特定します。次に、30ゲージの針先を使用して、神経束をさらに10ミクロンの厚さのフィラメントに分割し、フィラメントの1つを記録電極に挿入します。

このステップでは、高いレベルの目の手の協調性と器用さが必要です。次に、求心性神経終末を電気的に興奮させるために、丸い先端の同心円電極を粘膜表面に垂直に配置し、上閾値強度で刺激します。これにより、半径2mmに広がる電流が生成されます。

受容終末を見つけるには、扁平になった直腸の長さと幅に沿って電極を1.5ミリメートル刻みで体系的に動かします。求心性終末が興奮している場合は、電極の位置と刺激強度を調整して、応答するのに最も刺激強度を必要としない受容野を特定します。刺激の閾値が3ミリアンペアを超える場合は、その神経終末を捨てて、別の神経フィラメントの研究に進みます。

次に、受容野の刺激電極と記録部位との間の距離、および刺激アーチファクトと活動電位の開始との間の伝導遅延から、伝導速度を計算します。電気刺激によって受容野を特定した後、3つの機械的刺激を加えます。まず、ナイロンモノフィラメントのように、扁平化された結腸直腸の受容野に向かって垂直に、較正されたフォンフレイの先端を押して、プローブ刺激を適用します。

0.4グラムと1グラムの力を生成するモノフィラメントを使用してください。次に、結腸直腸粘膜を細いナイロンフィラメントストランドで優しくなでることで、撫でる刺激を生み出し、受容野に小さな表面せん断応力を発生させます。第三に、コンピュータ制御の力アクチュエータを使用して円周方向のストレッチを行います。

結腸直腸の抗腸間膜エッジに沿って円周方向に引き伸ばされた力をランプに送ってください。次に、ENS を漿液性粘膜、筋肉性筋性粘膜、または MIAA 機械的に鈍感な求心性薬として分類します。3つのテストの結果に基づきます。

まず、前のセクションと同様に、化学的感受性をテストするために、傾斜した円周方向、伸張方向、または垂直な機械的プローブによって、機械的刺激に対するベースライン応答を記録することから始めます。まず、真鍮またはステンレス鋼のチューブの下端を石油でコーティングし、結腸直腸の受容野の上に置きます。次に、チューブの内側からクレブス溶液を吸引し、溶液を170マイクロリットルの試験溶液と交換します。

求心性神経の応答を監視しながら、チューブを所定の位置に3〜5分間放置します。チューブを取り外した直後から4〜6分以内に、ベースライン応答と同じ機械的刺激に対する求心性反応をテストします。15分以上経過すると、試薬は洗い流されたと見なすことができます。

次に、機械的刺激が再び加えられます。ベースラインのアリと比較するために、解剖された神経を刺激して受容野を見つけました。受容野は、活動電位の伝導遅延を用いた活動電位応答によって同定された。

計算された伝導速度は秒速43メートルで、無髄C線維の範囲に十分収まっています。受容野を特定した後、モノフィラメントのようなハンドヘルドフォンフレイによって垂直にプローブされ、さらにハンドヘルドの細いナイロンフィラメントによって穏やかに撫でられました。プロービングに対するAFRの応答は、結腸直腸の同じ部位に、正確にタイミングを合わせて再現可能な一連の機械的力を伝達するコンピューター制御の力アクチュエータによっても評価されました。

同様に、結腸直腸の円周方向の伸びは、同じアクチュエータの努力によってもたらされました。応答は、5分間隔で3つの連続した円周方向のストレッチによって誘発されたストレッチ感受性求心性神経からのプローブ、ストローク、およびストレッチ応答に対する応答に基づいて区別できます。スパイク番号は均等にピン留めされ、刺激応答関数として表示され、高い再現性と応答の大きさと応答閾値の両方を明らかにしました。

次に薬品を塗布しました。ensの直接活性化は、機械的に鈍感な求心性動物に炎症性スープを適用した後、酸性高張溶液を適用した後に発生しました。.語尾の活性化は起こらなかったが、メノ感度の獲得は明らかであった。

ストレッチ感受性、メノ感受性求心性神経は、炎症性スープの適用後に受容野の機械的伸張にも感作されました 一度習得すると、組織解剖を完了し、単一繊維記録を達成するのに通常3〜4時間かかります。一般的な実験は、開始から終了まで丸一日かかります。このビデオを見た後、神経が付着した結腸直腸を外科的に除去して収穫する方法を理解する必要があります。

次に、骨盤神経または腰椎扁平神経のいずれかで単一のアハーン線維から記録し、偏りのない電気的検索戦略を使用して結腸を神経支配することができます。その後、直腸内の受容終末を特定し、受容終末に直接化学物質を適用することにより、機械的な感受性と化学療法の感受性をテストできるはずです。この製剤は、結腸直腸の病態生理学的メカニズムと基本的な生理学的問題を研究できる強力な製剤です。