Name: マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 学ぶマウス大腸求心性終末の単繊維電気生理学的記録法。機械刺激と化学刺激への応答特性を解析し、5つの機械感受性終末クラスと無感受性傷害受容器を同定する神経科学的手法です。

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NIH award R01 DK093525 (GFG) によってサポートされています。私たちは、アンバー・シェイファー博士(ピッツバーグ大学)による原稿の科学的なレビューと文法的な編集に大いに感謝し、図の作成に協力してくれたマイケル・バーチャムに感謝します。

注：このプロトコルを見直し、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。 修正クレブス溶液と試験薬品アリコートの調製<ol><li> 117.9のNaCl、4.7のKCl、25のNaHCO 3、1.3のNaH 2 PO 4、1.2をMgSO 4、2.5のCaCl 2、11.1 D-グルコース、2酪酸ナトリウム、20酢酸ナトリウム（単位はmM）を含有する改変クレブス液を6 Lを作る0.004ニフェジピン（自発的な筋収縮をブロックする）、及び0.003インドメタシン（内因性プロスタグランジンの合成をブロックする）。それぞれ、組織切開とシングルファイバー記録に氷のように冷たいと暖かいクレブスのソリューションを使用してください。 </li><li>任意の化学溶液を調製する（ 例えば、IS、カプサイシン、ATP）は、所望の濃度の分量で。 </li></ol>結腸直腸-神経組織の2解剖<ol><li>中（30グラム - - 8週齢、20 6）雄マウスを麻酔し、安楽死させるマウスは、胸部の動きの欠如によって示されるように、完全に呼吸が止まるまで、毎分チャンバ容積の30％ - 10を変位させる流量でCO 2室。 </li><li>直ちに、胸部室切開右心房を穿孔し、氷冷したクレブスの十分な体積（〜500ml）中でのマウスカーカスを浸漬することにより安楽死、放血させると、以下の（4°C）溶液カルボゲン（95％O 2でバブリング、5％CO 2）。 </li><li>慎重にすべての内臓が、コロンと骨盤臓器を取り除く。少し横隔膜より上T12脊髄分節全体の半分にマウスを横断すると氷の寒さを含む解剖室に尾側半分を転送し、クレブス溶液を泡立て。 </li><li>実体顕微鏡下では、尿道への接合部で離断によって膀胱と生殖器官を削除し、それが総腸骨動脈に分岐するまで下行/腹部大動脈を削除します。 PNまたはそれらのsurroundinからLSNを解放鈍的切開によるグラム組織および（PN用）L6とS1脊柱または（LSN用）T13とL1脊柱へのその腹側のエントリポイントまでの腸骨稜の外から神経に従ってください。 </li><li>恥骨結合と左右の寛骨臼関節を切断し、腸骨を取り除く。神経が脊柱に入る場所まで、大腸に近いから添付の筋肉や結合組織からのPNまたはLSNのどちらかを慎重無料。 </li><li>慎重に遠位大腸を露出するように腸骨を切除。連続で添付PNまたはLSNと遠位大腸を解剖。 </li><li>組織室の浴コンパートメントに装着神経と直腸を転送します。さらに切開により過度の結合組織を外し、抗腸間膜の国境に沿って縦方向に大腸を開きます。 </li><li>上に向け粘膜側では、chambeのシリコーンベースに記録コンパートメントに隣接した結腸直腸腸間膜エッジをピンrおよび力アクチュエータに接続されたフックのレーキに大腸のantimesenteric長さを取り付け（ 図1に示され、 図2Aで撮影）。 </li><li>マウスの穴とゲートで風呂コンパートメントに接続されている記録をコンパートメントの中にPNまたはLSNを拡張します。静かに神経接着させるための親水性表面を提供記録コンパートメント、小さなガラスミラーに神経幹を置く。暖かいと一緒にお風呂コンパートメントSuperfuse（30から32°C）を、Krebs溶液を酸素化し、鉱物油との記録コンパートメントを埋める。 </li></ol> 3.シングルファイバーの記録と受容野の局在<ol><li>慎重に高倍率（ - 60X 50）での実体顕微鏡下でPNまたはLSNから神経上膜（神経鞘）をバックはがします。 〜100μmの厚さの8神経束 - 細かい鉗子を使用して、5に神経幹をいじめる。 </li><li>白金 - イリジウムリファレンスを置き組織チャンバ内のクレブス溶液と接触する電極。順次同一の材料からなる記録電極上に個々の神経束を置く。 </li><li>穏やかになでることで大腸表面下大腸求心性神経からのAPを呼び起こすために柔らかいペイントブラシを使用してください。検出可能なAP（活動電位）の録音を通じてコロンを支配する神経束（s）を見つけます。 注：PNとLSNも膀胱や他の骨盤内の臓器を支配する。 </li><li>さらに〜10μmの厚さの細い束のフ​​ィラメントに神経束を分割し、記録電極上に個々のフィラメントを配置するために30 G針先端のペアを使用してください。 </li><li>電気的に現在のスプレッドの〜2mmの半径を生成閾値上の刺激強度（10ミリアンペアの大きさ、0.3 Hzの@ 0.5ミリ秒の持続時間）、での求心性終末を励起するために粘膜表面に垂直なラウンドが先端に付いた同心円状の電極を配置します。体系的に電極を移動（〜1.5ミリメートルステップ）受容語尾をローカライズする扁平な大腸の長さと幅に沿って。 </li><li>求心性エンディングが励起されると、最小刺激強度（刺激しきい値）を必要とする活性化（受容野、RF）のサイトを特定するための電極位置を調整します。 &gt; 3ミリアンペア19刺激閾値と語尾を破棄。 </li><li>刺激アーチファクトと活動電位の開始との間の受容野（RF）での刺激電極と記録部位および2）伝導遅延（ 例えば、 図2B）との間の距離）1から伝導速度（CV）を計算する。 CV（10m /秒）=距離（mm）/伝導遅延（ミリ秒）。 </li></ol>機械受容大腸求心性神経の4機能分類<ol><li>電気刺激によってRFを見つけた後、RFに、次の3つの機械的刺激を適用します。 <ol><li> Calibraでの先端を押して、プロービング刺激を実施テッド·フォン·フレイのようなナイロンモノフィラメント（0.4および1グラム力）垂直に平坦化された大腸上のRF向けた。 </li><li>穏やかRF小さな表面せん断応力を生成するために細かいナイロンフィラメントストランド（10 mgの力）で大腸粘膜をなでることでなでる刺激を行う。 </li><li> ステップ2.8に記載されてフックのレーキを介して大腸の抗腸間膜縁に沿って円周方向に（ -は5mN /秒で170 MN 0）傾斜伸縮力を提供し、コンピュータ制御の力アクチュエータを用いて円周ストレッチを行う。 </li></ol></li><li>漿膜として、粘膜を（プロービング平滑末端にのみ反応する）求心性神経を分類筋肉（周ストレッチに対応し、プロービング平滑）筋肉/粘膜を（周ストレッチ、粘膜なでるに対応し、プロービング平滑）、または、（なでる粘膜およびプロービング平滑末端に反応する） MIA（三機械的刺激のいずれかに応答しない）。 </li><li>だけで（腸間膜求心性神経のために、電気刺激によって選択的に活性化する腸間膜のプロービング/機械的なストロークによってそれらの受容語尾を見つけることが困難なLSNの神経支配）。 </li><li>ストレッチに敏感な求心性（筋肉と筋肉の粘膜）の場合は、傾斜のストレッチ中に最初のAPを呼び起こす力として定義されている応答閾値を決定する。 </li><li>漿膜求心性神経のために、コンピュータ制御力アクチュエータで駆動される受容野のプロービング点状のレベルを昇順に彼らの応答を記録。 </li></ol> 5.化学アプリケーション/受容性終末のモジュレーション<ol><li>機械的な刺激に対するベースライン応答を記録（ すなわち、傾斜ストレッチ、プロービング点状、または粘膜ストロークへの応答）。 </li><li>コートチューブの一片（真鍮やステンレス鋼、10ミリメートル、高と4×4ミリメートル2正方形または4〜5ミリメートルの直径）の下端ワセリンとし、大腸に受容野の上に置きます。 </li><li>削除するチューブ内部のクレブス溶液、および3の受容エンディングさらす - 試験される化学物質（単数または複数）を含む溶液の170μlに5分。 </li><li>化学アプリケーションの間の求心性の応答を監視します（一部の求心性神経は、化学感受性である）。 </li><li>化学物質の作用を終了させる薬液とチューブを外します。 4内 - 6分、ベースライン応答と同様に機械的刺激への求心性応答をテストします。 </li><li>ウォッシュアウト（&gt; 15分）の十分な期間の後に再び機械的刺激を再適用します。 </li></ol> 6.録音および識別APスパイク<ol><li> 20 kHzで軸索から記録された電気信号をデジタル化し、コンピュータにデータを保存します。オーディオモニターにより、オンラインの信号を監視します。 </li><li>オフラインAPスパイクを分析し、個々のスパイク波形25の主成分分析に基づいて、単一のユニットを区別する。 注：Oneレコードがこれ以上目を含める必要があります2簡単に識別可能なアクティブユニット。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここに記載のインビトロ結腸直腸神経準備がうまく内臓感覚ニューロン上の他の非機能的アプローチ（ 例えば 、細胞、分子、および組織学的研究）を補完する個々の結腸直腸求心性の神経エンコーディング機能（研究するための強力なアプローチであることが証明され）詳細についてはレビュー27を参照してください。痛覚および長期直腸過敏症に寄与神経メカニズムが明らかにされている薬理学的操作は、内臓痛を軽減する可能性の目標を明らかにしたことが行われている。この準備の実装を成功に関連した以下のキーポイントは、以下で説明されています。電気的ノイズの1）削減、信号検出では2）の増加、および求心性エンコーディングの変化を評価するための標準化された刺激の3）選択。また、この技術のいくつかの制限について検討した。 活動電位（APS）propagati130 mVの - 神経軸索に沿って細胞内にngの通常100の膜電位を持っている。しかし、軸索の膜の小さな特定の容量に、この比較的大きな脱分極は、簡単に電気インピーダンスはかなり低く持って周囲の細胞外組織/間質液（に...

疼痛および過敏症が明らかに病理学的原因または組織損傷の非存在下で存在する過敏性腸症候群（IBS）を含む機能性胃腸障害に罹患している患者の主な不満である。例えば、IBS患者は、体の紹介（腹部の触診に、すなわち、圧痛）1の直腸バルーン膨満への応答を高め、正常な腸機能の間に感受性の増加、ならびに過敏を含む過敏症を呈する。大腸求心性神経を標的にすること（局所麻酔薬2,3の例、直腸内点滴注入、グアニル酸シクラーゼ-Cアゴニストリナクロチド4-6の経口摂取）をIBS患者の痛みや過敏症を緩和するのに有効であることが証明されているため、理解の向上大腸の求心性神経支配が重要です。 大腸求心性神経を含む内臓求心性神経、化学/ nutrient-および熱モダリティ（ 例えば、7-9）に応答することができる。機械的な刺激（ 例えば、管腔膨満、ストレッチ）は、一般的に不快感や痛み10-16含め意識的な感覚、を生じさせるものであるので、機械的刺激（ すなわち、機械受容求心性神経）への対応内臓求心性神経は、最も徹底的に研究されている。また、内臓はまた、一般的に、機械的に区別しない求心性（MIAs）によって神経支配サイレントまたは眠っ侵害受容器17と呼ばれている。正常な生理的条件下では、MIAsは機械的な刺激に応答したり、持っていない非常に高い応答が18をしきい値が、アクティブになり、病態生理学的状態において機械的感受性を取得し、過敏症に寄与することができる。 ここに記載のインビトロ調製およびプロトコルを使用して、我々は、海に電気刺激戦略を開発し、採用<html>大腸19の両方の機械受容とMIA終末の公平な識別を可能に受容語尾のためRCH。結腸直腸の神経支配は腰部内臓（LSN）および骨盤神経（PN）経路に由来し、5機械受容クラス（漿膜、粘膜、筋肉、筋肉、粘膜、腸間膜）と一つMIAクラス20に分類することができる直腸求心性線維を含む。このインビトロ準備を使用して、我々は大腸MIAs獲得した機械的感受性がLSN経路においてPN経路におけるMIAsの71％とMIAsの23％増感炎症スープ（IS）、への受容野の簡単な露出以下（感作）ことがわかった19。また、（ザイモサン21または2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）22で結腸内処置を受けたマウス、すなわち、）長期間持続する行動内臓過敏の文脈でMIAsの（28日まで）の長期感作を文書化。 機械受容求心性神経のうちjove_content &quot;&gt;、筋肉と筋肉の粘膜求心性は持続的に大腸の周ストレッチをエンコード（ すなわち、ストレッチと小文字が区別されます）と有害な結腸直腸拡張23,24のエンコーディングを補助する唯一のクラスである。コンピュータ制御を使用して、フォースアクチュエータは、均質で、基準を適用し、かつ再現性が平坦化された大腸組織とさらに分類ストレッチセンシティブ求心低閾値および高閾値23の周方向に伸縮性を上げ、また、伸縮性の感作の時間経過を結腸内ザイモサン21またはTNBS 22治療後の感受性求心性内臓痛および過敏でストレッチに敏感な大腸求心性神経の役割を示唆し、行動内臓過敏の発症、持続性、および/ ​​または回復に対応している。

<table><tbody><tr><td>ライカMZ16実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ IC D カメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>・ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社</td><td>SYS-DAM80</td><td>低ノイズ差動増幅器</td></tr><tr><td>2コンパートメントティッシュチャンバー</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>データ収集、アナログ信号入出力</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Power1401</td></tr><tr><td>オーディオモニター</td><td>Natus</td><td>Amと連携するソフトウェアパッケージ</td><td></td>8</tr><tr><td>方形パルス刺激装置</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>電気刺激を与える</td></tr><tr><td>光電絶縁ユニット</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>ノイズを低減する刺激絶縁</td></tr><tr><td>同心円状バイポーラ微小電極</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>電気刺激を届ける</td></tr><tr><td>デュアルモードレバーシステム</td><td>オーロラサイエンティフィック株式会社</td><td>シリーズ300C</td>は<td>、機械的な刺激を与えるために</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td>細かい先端を持つ鉗子</td></tr></tbody></table>

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

このビデオでは、詳細に、マウスの大腸-神経準備を用いたin vitroの単繊維電気生理学的記録プロトコルを示しています。アプローチは公平な識別と個々の大腸求心性の機能解析を可能にします。 1または少数の求心性から生じる伝播し活動電位（APS）の細胞外記録は（ すなわち、単一ファイバ）大腸内受容野（RFS）はからかわ神経線維線維束から作られています。大腸は、骨盤（PN）または腰椎内臓（LSN）神経取り付けられており、縦方向に開いたのいずれかで削除されます。組織は、記録チャンバーに入れ、平らに固定し、酸素化クレブス溶液で灌流される。フォーカル電気刺激は、機能的に5 mechanosensiに求心性神経を分類するために、さらに三つの異なる機械的刺激によってテストされている大腸求心性終末を、（プロービング、粘膜なでると周ストレッチを鈍ら）を見つけるために使用されます電性のクラス。これらの機械的刺激のいずれにも応答エンディングは、機械的に小文字を区別しない求心性（MIA​​s）に分類される。機械受容およびMIAs両方は、化学物質へのRFの局所露光部（ 例えば、炎症性スープ（IS）、カプサイシン、アデノシン三リン酸（ATP））によって（ すなわち、強化された応答を低減閾値、および/ ​​または機械的感受性の取得）感作のために評価することができる。私たちは、機器や結腸直腸-神経録音の準備、添付のPNまたはLSNと大腸の収穫、大腸内のRFの識別、神経線維束から単心記録、およびRFへの化学物質のローカライズされたアプリケーションを記述する。また、標準化された機械的な刺激の準備とアプリケーションの課題も議論されている。

セットアップは、 図1に示されている。これは、シリコーン裏打ち浴区画と隣接する鉱物油が充填されたコンパートメントで取り付け神経における大腸を収容するカスタムメイドの組織チャンバを含む。二区画室は、CNC機によるアクリルプラスチックの固体ブロックから機械加工された。両方の区画の底部は、その後の結腸直腸組織の下に簡単にピンを許可するようにしっかりとシリコンが並んでました。いじめ神経線維束から外APは高コモンモード除去比（CMRR〜60デシベル）で低ノイズ、バッテリ駆動の差動増幅器を使用して記録されている。増幅器の利得は0.3〜10 kHzでx10,000バンドフィルタの範囲に設定されている。結腸直腸の電気刺激は、結腸直腸粘膜に接触して同心円状の電極を介して定電流モードで光学的に結合された刺激装置によって送達される。機械的刺激（大腸ストレッチと点状のプロービング）は交流によって配信されるomputer制御力アクチュエータ。 AD変換器および適切なソフトウェアは、機械的および電気的刺激、ならびに記録を開始するために、電圧指令の出力を送信し、差動増幅器から外AP信号をデジタル化することによって、両方の刺激および記...

このビデオは、in vitroマウスの結腸直腸神経製剤で単繊維電気生理学的記録を行うためのプロトコルを示しています。

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

本実験の全体的な目的は、マウスの結腸直腸における外因性求心性神経終末をin vitroで機能的に特性解析することである。まず、結腸直腸およびそれに付随する骨盤または腰髄の splanchnic nerve を一続きの状態で採取し、組織をin vitro記録チャンバーに配置することでこれを実現する。次に、骨盤または腰髄の splanchnic nerve 幹を細いフィラメントに分割し、個々の神経軸索から単一線維電気生理学的記録を行えるようにする。その後、受容野への非偏向的な電気刺激によって個々の結腸直腸神経終末を同定し、3種類の異なる機械的刺激に対する反応プロファイルに基づいて機能的に分類する。さらに、真鍮製のチューブで受容野を隔離し、溶液を化学物質または化学物質の混合物を含む溶液に置き換えることで、神経末端に適用した化学物質への反応を試験することができます。その結果、マウスの大腸は5つの異なるクラスの機械刺激感受性末梢神経によって支配されていることが示されました。加えて、大腸の末梢神経の約25%は、機械刺激に不感であるか、あるいは静止性侵害受容器であることが分かりました。この手法は、結腸直腸の感覚神経支配を研究するために、我々や他の研究者によって用いられています。多くの胃腸疾患は、感覚神経支配の感作や興奮性の変化に関連しているため、我々はこの研究アプローチに関心を持っています。感作のメカニズムを理解することへの関心は、過敏性腸症候群などの胃腸疾患に典型的に伴う痛みや不快感を調節するために有用となる治療戦略の開発に寄与したいという願いに基づいています。組織の剥離および神経の分離ステップを習得することは非常に困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。剥離中に、結腸直腸遠位部を支配する神経が容易に損傷する可能性があります。したがって、本実験を再現しようとする場合、慎重な解剖とそれに続く分切ステップが極めて重要となります。マウスを安楽死させた直後に放血し、胸腔を切開して右心房を穿刺し、マウスの死骸を約500 mLの氷冷Creb溶液に浸します。次に、結腸と骨盤内器官以外のすべての内臓を慎重に除去します。次に、マウスの体を胸横隔膜のわずか上方のT 12あたりで切断し、尾側半身を氷冷したbubble crebs溶液が入った解剖チャンバーに移します。ステレオ顕微鏡下で、尿道との接合部を切断して、膀胱と生殖器官を取り出します。また、下行大動脈を総腸骨動脈に分かれるまで取り出します。次に、骨盤神経または腰部内臓神経を周囲の組織から剥離します。腸骨稜の外側から、脊柱への進入点まで神経を追います。骨盤神経はL6およびS1の脊柱に入り、腰部内臓神経はT13およびL1に入ることが示されています。ここでは、左右の骨盤神経を解剖しています。次に、恥骨結合を切断し、左右の寛骨臼関節を切断します。その後、腸骨を除去します。腸骨を除去した後、付着している神経を遊離させながら、直腸遠位部を解剖して取り出します。周囲の筋肉や結合組織から付着している神経を分離します。神経は機械的な損傷を受けやすいため、周囲の組織から剥離する際は、神経を引っ張ったり挟んだりしないよう十分な注意が必要です。次に、神経が付着した大腸を組織チャンバーに移動させます。大腸を腸間膜反対側に沿って縦方向に切り開き、粘膜側を上にして配置します。その後、マウスホールとゲートでバスチャンバーに接続されている記録コンパートメントまで神経を伸ばします。神経幹を小さなガラス鏡の上に配置します。鏡は親水性であるため、神経が付着します。次に、記録室の横で、結腸の腸間膜縁をピンで固定します。次に、浴槽室に温めて酸素飽和させたCreb溶液を超灌流し、記録室にミネラルオイルを満たしてセットアップを完了させます。実体顕微鏡の高倍率下で、結腸直腸の腸間膜対側を、フォースアクチュエータに接続されたフックラックに固定します。微細ピンセットを用いて、単離した骨盤または腰部の内臓神経から神経鞘を慎重に剥離します。神経幹を、それぞれ厚さ約100 µmの5〜8本の神経束にほぐします。次に、組織チャンバー内のKrebs溶液に参照電極を接触させます。その後、個々の神経束を順次記録電極上に配置し、結腸直腸のensから活動電位を誘発させます。柔らかい絵筆を用いて、大腸の表面を優しく撫でます。これにより、結腸に分布する神経束を特定します。次に、30ゲージの針先を2本使い、神経束をさらに厚さ10 micronのフィラメント状に分離し、そのフィラメントの1本を記録電極の上に載せます。この工程では、高度な手先の器用さと眼手協調性が求められます。次に、求心性神経終末を電気的に興奮させるため、円錐形の同心電極を粘膜表面に対して垂直に配置し、閾値上の強度で刺激します。これにより、半径2mmの範囲に電流が広がります。受容末端を探索するため、平坦化したco rectumの長辺および短辺に沿って、電極を1.5 millimeter刻みで系統的に移動させます。求心性末端が興奮した場合は、電極の位置と刺激強度を調整し、応答に最小の刺激強度を必要とする受容野を正確に特定します。刺激閾値が3 milliampsを超える場合は、その神経末端は除外して、別の神経フィラメントの検討に移ってください。次に、受容野にある刺激電極から記録部位までの距離と、刺激アーチファクトから活動電位の立ち上がりまでの伝導遅延から、伝導速度を算出します。電気刺激によって受容野を特定した後、3回の機械的刺激を加えます。まず、校正済みvon fray（ナイロンモノフィラメントなど）の先端を、平坦化した結腸直腸の受容野に向かって垂直に押し込み、プロービング刺激を与えます。0.4 gおよび1 gの力を発生させるモノフィラメントを使用します。次に、受容野に小さな表面せん断応力を生じさせるため、10 mgの力を発生させる細いナイロンフィラメントを用いて結腸直腸粘膜を軽く擦り、ストローキング刺激を与えます。第三に、コンピュータ制御のフォースアクチュエータを用いて、円周方向の伸展を行います。大腸の腸間膜対側縁に沿って、円周方向にランプ伸展力を加えます。次に、3つのテストの結果に基づいて、ENSを漿膜側、粘膜側、筋層側、またはMIAA（機械的に不感な求心性神経）に分類します。前節と同様に、ランプ状の円周方向、伸展、または垂直方向の機械的刺激を用いて、ベースライン反応を記録し、化学感受性をテストします。まず、真鍮製またはステンレス製のチューブの底端に petroleum を塗布し、結腸直腸の受容野の上に配置します。次に、チューブ内部から Krebs 液を吸引し、170 µL のテスト溶液に置換します。求心路の反応をモニタリングしながら、チューブを3〜5分間そのままにします。チューブを留置してから4〜6分後に直ちにチューブを取り除き、ベースライン応答時と同じ機械的刺激に対する求心路の反応をテストします。15分以上経過すれば、試薬は洗浄されたとみなせます。その後、再び機械的刺激を与えます。ベースラインの個体と比較するため、解剖した神経を刺激して受容野を特定します。受容野は、活動電位の伝導遅延を用いて、活動電位応答によって同定されました。算出された伝導速度は0.43 m/sであり、これは無髄のC線維の範囲内に十分に収まっています。受容野を特定した後、手持ちのvon Frey様のモノフィラメントを用いて垂直に刺激し、また手持ちの細いナイロンフィラメントで軽く撫でました。刺激に対するAFR反応は、結腸直腸の同一部位に、正確にタイミングを合わせた再現性のある一連の機械的力を加えるコンピューター制御のフォースアクチュエーターによっても評価されました。同様に、同一のアクチュエータ動作によって結腸の円周方向へのストレッチを加えました。応答は、プローブ刺激への応答、ストローク刺激への応答、およびストレッチ感受性求心神経からのストレッチ応答に基づいて区別でき、これらは5分間隔で3回連続で加えた円周方向へのストレッチによって誘発されました。スパイク数は均等にプロットされ、刺激応答関数として表示され、高い再現性と、応答強度および応答閾値の両方が明らかになりました。次に以下の化学物質を投与した。機械的に不感受な求心性繊維に炎症スープを投与した後、酸性高張液を投与したところ、ensの直接的な活性化が認められた。末端の活性化は起こらなかったが、meno感受性の獲得が明らかであった。炎症性スープの投与後、受容野への機械的な伸展に対しても、伸展感受性および圧感受性求心性ニューロンが感作されました。この手技に習熟すれば、通常、組織の解剖から単一ファイバー記録の達成まで3〜4時間で完了します。典型的な実験では、開始から終了まで丸一日かかります。このビデオを視聴することで、神経を付着させたまま大腸を外科的に摘出し、回収する方法を理解できるはずです。次に、偏りのない電気的探索戦略を用いて、骨盤神経または腰部内臓神経にある、結腸を支配する単一のアーン繊維から記録を行います。これにより、結直腸内の受容末端を特定し、受容末端に化学物質を直接投与することで、機械的感受性および化学的感受性を試験することが可能になります。この標本は、結直腸における基本的な生理学的問題だけでなく、病態生理学的メカニズムを研究することを可能にする強力な手法です。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、マウス近位結腸ループまたはpcLoopセグメントを生成する外科的処置と、その後に蛍光マーカーをセグメントに注入して腸上皮透過性を研究する手順について説明します。...

マウス近位結腸ループモデルの生成:管腔内注射後の血清中の蛍光マーカーの検出により、近位結腸ループを生成し、腸の透過性を測定する外科的処置

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Ex Vivoラット結腸における結腸求心性神経からの電気生理学的記録

このビデオは、解剖されたマウス空腸セグメントで腸間膜求心性神経からの電気信号を記録するプロセスを示しており、組織の圧力と運動の変化が求心性神経活動に及ぼす影響を研究しています。...

Ex Vivoマウス空腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動の記録

出典:Fried, D. E., Gulbransen, B. D.In Situ Ca2+ 腸神経系のイメージング J. Vis. Exp.

マウス大腸筋神経叢における腸内ニューロンとグリア活性のカルシウムイメージング

腸神経系のニューロンおよびグリア成分を直接研究するための細胞培養プロトコルを実演します。成体マウスの筋神経叢から、電気生理学、免疫組織化学などにより個々のニューロンとグリアの機能を調べる能力を提供する、カバースリップ上のニューロン/グリア混合培養物。...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

過去数年間、新世代内視鏡は、ネズミ大腸炎および結腸直腸腫瘍を評価するための重要な診断研究助剤として浮上している。私たちはここに、マウスにおける炎症と大腸腫瘍の内視鏡的な評価だけでなく、大腸炎および大腸腫瘍の内視鏡的重症度を記録するために小数の識別子を使用して新たなスコアリングシステムのための詳細なプロトコルを提示する。...

検証済みの内視鏡スコアリングシステムを使用して、大腸炎および結腸直腸腫瘍の重症度を評価するためにマウスでの柔軟な大腸内視鏡検査

私たちは、硬性内視鏡を使用してマウスの結腸病理の治療薬の有効性を縦断的にモニタリングする方法を記述します。このプロトコルは、生きたマウスの個々の腫瘍の治療応答の特性評価や、潜在的な疾患の再発のモニタリングに容易に使用できます。...

生きたマウスのシリアル内視鏡イメージングを使用して、腸の異常のための新しい治療の有効性の非侵襲的評価

この記事では、成体マウスの結腸運動性の神経調節の変化を特定するためのビデオイメージング技術と高解像度の時空間マッピングについて説明します。このアプローチを用いて、単離された組織調製物を用いて胃腸(GI)機能に対する微妙な影響を検出することができ、消化管疾患の理解を深めることができます。...

マウスにおける胃腸の運動を分析するためにビデオ画像と時空間マップ

腸間膜求心性神経は、正常な恒常性と病態生理学に関する情報を消化管から脳に伝えます。胃腸求心性神経活動は、求心性神経が付着した孤立した腸管セグメントを臓器浴に取り付け、神経を分離し、基礎活動と刺激活動を評価することで評価できます。...

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

感覚機能の異常は、内臓の痛みや機能および炎症性腸病気の他の症状に基づいています。に備えて、前のヴィヴォラット大腸結腸求心性神経の電気生理学的記録のためのプロトコルを次に示します。...

体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価

(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC...

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

学ぶマウス大腸求心性終末の単繊維電気生理学的記録法。機械刺激と化学刺激への応答特性を解析し、5つの機械感受性終末クラスと無感受性傷害受容器を同定する神経科学的手法です。

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

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