解剖と実装ショウジョウバエ蛹アイディスク
2014年11月9日
この技術の目標は、研究者があらゆる年齢のショウジョウバエの眼板の解剖、免疫染色、および装着を行うことを可能にすることです。
瞳孔の眼椎間板の解剖とショウジョウバエメラノガスターの取り付けへようこそ。適切なHDの蛹を選択する必要があります。解剖は、瞳孔ケースを穿孔し、ケースから蛹を取り除くことから始まります。
蛹の胸部中央部に斜めに切り込みを入れます。蛹を切断した後、脳とiisを分離して処理してからiisを装着します。顕微鏡検査が解剖プロセスを開始し、適切に年齢の蛹が選択されます。
解剖皿の上のPBSの大きな滴に蛹を置きます。ベストプラクティスは、マウスフックを下に向けて蛹を向けることです。これらは、マウスフックを下に向けてマウスフックです。
1対の鉗子で蛹を優しくつかみます。鋭い鉗子で瞳孔ケース内の発育中の蛹を強く押し込まないように注意してください。瞳ケースに穴を開け、4つのステップを広げて端を引きちぎります。
中に手を伸ばして、できたばかりの穴から発育中の蛹をつかみます。次に、はさみを取り、蛹を胸部の中央あたりで切ります。対角線上にカットします。
次に、破片を取り除くか、PUをPBSの新しいドロップに移すのが最善です。クリーニングはピペットブロワーチューブを使用して行うことができ、必要に応じて追加のPBSを追加して、脱水症状を避けるようにする必要があります。次に、瞳孔の頭のキューティクルの上部を鉗子でしっかりとつかみます。
ブロワーチューブの先端を使用してキューティクル内の組織をつかまないように注意してください。瞳孔ケースをそっと押して脳を押し出し、瞳孔ケースから眼板を取り付けます。このプロセスを支援するために、ブロワーチューブ内のPBSを使用して、ヘッドケースからここに見られるように破片を穏やかに吹き飛ばし、脳とIディスクの明確な分離と識別を可能にします。Iディスクは、脳とIディスクが周囲の組織から分離され、簡単に識別されるまで、必要に応じて押したり吹いたりするこのプロセスで継続しますIディスクは、ここで見ることができ、この蛹の色素沈着がありますすでに始まっており、Iディスはわずかに色があります。
目のディスは赤で縁取られ、その間に脳が強調表示されます。高倍率では、各Iディスクを簡単に識別できます。ここでも、Iディスクは赤で輪郭が描かれており、その間に脳があります。
脳とI.Discsは、鉗子とブロワーチューブを最適に使用して、残りの組織から洗浄および分離し続ける必要がありますが、眼椎間板と脳は、将来の操作のための鉗子のハンドルとして機能するように、頭のキューティクルに付着したままにする必要があります。吹き飛ばしたり押したりするプロセスを通じて、脳と目の椎間板を頭のキューティクルから取り除くのが一般的です。I disと脳を慎重に分離した後、組織を固定溶液に静かに置きます。
最初に、Iディスクをフィックスの上に浮かせて、それ自体が崩壊して固定されないようにします閉じた向きでは、Iディスクを解剖してフィックスに浮かべることをお勧めします。次のIディスクのセットが解剖される間、それらは浮いたままであり、その後、Iディスクの固定後に固定に沈められます。必要に応じて免疫染色などの処理を行い、スライドにマウントして可視化します。
これは、脳がまだPBSの大きな滴に付着している固定瞳孔I椎間板です。グリセリンの搭載は非常に困難ですが、iisと50%グリセロール、PBSの搭載に成功しています。PBSでマウントする場合は、脱水症状を避けてください。
頭のキューティクルが取り除かれていることに注意してください。赤枠で囲まれているのは各Iディスクです。その間に脳が強調表示されます。
鋭い鉗子を取り、目の椎間板と脳の間の接続を切断します。これは、脳を保持し、鋭い鉗子をここの接続部に配置することによって達成されます。これは非常に難しい場合があります。
鋭い鉗子を使用すると、このプロセスがはるかに簡単になるため、使用することが重要です。また、細かい解剖針を使用してこの分離を行うことも可能です。時には、接続部で眼板を安定させながら脳を引き抜く方が簡単な場合があります。
この眼椎間板にはかなりの量の無関係な組織が残っていますが、I椎間板が顕微鏡スライドに取り付けられ、この面が上を向いている限り、眼椎間板のイメージングに影響を与えないはずです。これにより、Iディスクの頂端面を顕微鏡スライド上で平らにすることができます。この組織をさらに除去すると、通常、I椎間板の組織損傷につながることがわかりました。
したがって、この組織をオンのままにして、イメージング段階で避けることが望ましいです。脳を切除する別の手法は、ここに見られるように、解剖針または鋭利な鉗子のいずれかで眼椎間板を接続部に固定し、脳を引き離すことです。この剥離は、Iディスクに残る組織が少なく、はるかにきれいでした。
すべてのIディスクの準備が完了したら、オプティカルトラックを上に向けて一列に並べます。PBSを取り外し、VTAシールドまたはその他の封入メディアと交換し、カバースリップで覆います。これで、Iディスクは、詳細な免疫染色プロトコルとともに、ここで説明する技術を使用してイメージングする準備が整いました。
この原稿では、Iディスクを共焦点顕微鏡で可視化して、ホスホチロシン染色で見られるように形態学的特性を得ることができ、Iディスクのオメル細胞の頂端形態を明らかにしています。他の抗体および遺伝的手法を用いて、Iディスクの錐体細胞における切断転写因子の発現についてここで見られるように、細胞パイプおよび発現パターンを同定することができる。このビデオは、このテクニックを学部生に指導するために制作されたトレーニングビデオをリマスターしたものです。
私たちの学生の多くは、このビデオを使用してこのテクニックのトレーニングに成功しており、それがあなたにも役立つことを願っています。私たちはあなたの実験で幸運を祈り、この技術があなたにとって有益であることを願っています。
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概要
この記事では、ショウジョウバエの蛹の眼盤を解剖、免疫染色、および実装するための技術を概説します。このプロセスは、適切な年齢の蛹の選択から始まり、さらなる分析のために必要な構成要素を分離する慎重な解剖を含みます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 遺伝学
背景
- ショウジョウバエは、生物学研究で広く使用されているモデル生物です。
- 蛹の眼盤は、眼の発生と機能を研究するのに重要です。
- 免疫染色技術により、組織内の特定のタンパク質の視覚化が可能になります。
- 解剖技術は、さらなる研究のために組織を分離するために不可欠です。
研究の目的
- ショウジョウバエの眼の発生に関する詳細な研究を研究者が行うことを可能にします。
- 眼盤の解剖と実装の標準化された方法を提供します。
- 細胞構成要素の視覚化を強化するための免疫染色手順を容易にします。
使用された方法
- 解剖のために適切な年齢の蛹の選択。
- 蛹を抜き出すための瞳孔ケースの穿刺。
- 内部構造にアクセスするための胸部に斜めの切り込みを入れます。
- 脳と眼盤を実装と分析のために分離します。
主な結果
- 蛹の眼盤の解剖と分離の成功。
- タンパク質の視覚化に効果的な免疫染色技術の実証。
- 研究の再現性を確保するための標準化された方法の確立。
- ショウジョウバエの発生過程の理解の強化。
結論
- この技術は、眼の発生を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 免疫染色は細胞構成要素の視覚化能力を高めます。
- これらの方法は、発生生物学のさまざまな研究課題に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Dissection and mounting of Drosophila pupal eye discs enables high-resolution visualization of cellular architecture and protein expression in a genetically tractable model system. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of developmental processes. The technique enhances predictive confidence for pathway interrogation and phenotypic screening in neurobiology and genetics research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of ommatidial cell differentiation and protein localization.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible method for isolating pupal eye discs for downstream analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative imaging data for assessing morphological and molecular phenotypes in genetic or pharmacological screens.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent tissue preparation and mounting procedures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cellular phenotypes in a disease-relevant system.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation via standardized immunostaining and imaging workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing biologically relevant, quantifiable outputs for hypothesis testing and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct visualization of photoreceptor and support cell development.
- Screening: Enables assay readiness via reproducible tissue isolation and mounting for imaging-based readouts.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence and morphological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conserved developmental pathways applicable to human disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurogenetic and developmental biology projects across discovery stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through high-resolution phenotypic analysis.
- Operational Value: Standardization and scalability of tissue preparation for imaging pipelines.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced mechanistic ambiguity in early-stage targets.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, reproducible developmental readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on fluorescence microscopy and immunostaining infrastructure for data generation.
- Necessitates standardization of fixation, mounting, and imaging protocols across teams.
- Adaptation considerations include variations in pupal age and genetic background affecting disc morphology.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential for imaging artifacts from residual cuticle.
