Name: リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶLCGソフトウェアを用いたラット体性感覚皮質ニューロンのダイナミッククランプ法。自動電気生理プロトコルで細胞特性を評価し、シナプスイベントのシミュレーションにより皮質細胞のゲイン調節を解析する。

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フランダース研究財団FWO(契約番号12C9112NからDL)からの財政支援、欧州委員会の第7次フレームワークプログラム（Marie Curie Network "C7", contract n. 238214;ICT未来新興技術「啓蒙」プロジェクト、契約番号306502)、ベルギー科学政策局が開始した大学間アトラクションポールプログラム(契約番号IUAP-VII/20)、およびアントワープ大学に感謝します。

<ol><li>Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+visual+motion+and+locomotion+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex.</a> Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).</li>
<li>Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+neuronal+dynamics+during+motor+adaptation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish.</a> Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).</li>
<li>Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-loop+optogenetic+control+of+thalamus+as+a+tool+for+interrupting+seizures+after+cortical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury.</a> Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).</li>
<li>Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+response+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Neuronal response clamp.</a> Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3(2011).</li>
<li>Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Command-line+cellular+electrophysiology+for+conventional+and+real-time+closed-loop+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments.</a> Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).</li>
<li>Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).</li>
<li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).</li>
<li>Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+the+persistent+Na%2B+current+on+neuronal+excitability+and+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing.</a> Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).</li>
<li>White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+from+voltage-gated+ion+channels+may+influence+neuronal+dynamics+in+the+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex.</a> Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).</li>
<li>Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+synaptic+conductances+recreate+in+vivo-like+activity+in+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons.</a> Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).</li>
<li>Fellous, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Persistent+Activity+by+Background+Inhibition+in+an+In+Vitro+Model+of+a+Cortical+Microcircuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit.</a> Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).</li>
<li>Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+excitability+over+extended+timescales+in+cultured+cortical+neurons.+The+Journal+of+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience.</a> the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological+and+molecular+properties+of+Martinotti+cells+in+the+somatosensory+cortex+of+the+juvenile+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat.</a> The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+molecular+and+circuit+properties+of+nest+basket+cells+in+the+developing+somatosensory+cortex%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex).</a> Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).</li>
<li>Brette, R., Piwkowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intracellular+recordings+using+a+real-time+computational+model+of+the+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode.</a> Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).</li>
<li>Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+closed-loop+presentation+of+sensory+stimuli+conditional+on+the+internal+brain-state+of+awake+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals.</a> Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).</li>
<li>Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).</li>
<li>Graham, L., Schramm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamic-Clamp+Manipulation+of+Extrinsic+and+Intrinsic+Conductances%3A+Functional+Roles+of+Shunting+Inhibition+and+I+BK+in+Rat+and+Cat+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Dynamic+Clamp%3A+From+Principles+to+Applications%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex.</a> Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. , (1995).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%22">Patch Clamping</a>. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).</li>
<li>Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li>
<li>Gold, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+R+%22The+Axon+Guide+for+Electrophysiolog.%2C+%26+Biophysics+Laboratory+Techniques..%22">The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques..</a>. , (2007).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li>
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<li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li>
<li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+networks+with+dynamic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+computation%22%5BJournal%5D)">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li>
<li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このテキストリアルタイムの実施のための完全なプロトコルでは、閉ループ単一細胞電気実験はパッチクランプ法とLCGと呼ばれる最近開発されたソフトウェアツールボックスを使用して、説明しました。録音の品質を最適化するためには、記録の設定が正しく、接地シールドと振動しないことが重要である：これは、一緒に刺激プロトコルのセクション全体を自動化する可能性のある細胞への安定と持続的な細胞全体のアクセスを、確実に、実験のスループットの最大化を可能にします。 LCGを適用することができる2つの場合には、 インビボ様すなわちニューロンの活性な入出力関係の高速計算を含めた電気生理学的特性（ 図1）の点で細胞の特徴付け、およびでのレクリエーションを提示されています脳切片における活性（ 図2）。 SUCHアプリケーションは、異なるプロトコルを構築する方法を示し、LCGの最も顕著な特徴のいくつかを強調し、そのコマンドライン·インタフェースは、スクリプトを実行しても、それが適しています、プロトコルの一連の自動...

<html>近年、携帯電気生理学は、近代的な閉ループプロトコルに電圧および電流クランプ実験に用い、従来のオープンループパラダイムから進化してきました。最もよく知られている閉ループ技術は、おそらく神経細胞膜電位8を決定するために人工的な電位依存性イオンチャネルの合成注入を可能に動的クランプ6,7であり、非決定論的には、フリッカの影響の詳細な研究神経応答のダイナミクス9、ならびにシナプス背景活動10のようなvivo-で現実的なのin vitroでのレクリエーションのイオンチャネル。 提案されている他の閉ループパラダイムは、 インビトロ自立持続的活動の発生、及び応答は細胞機構を下にある神経細胞の興奮性を調査するために、4,12をクランプを研究するために、反応性クランプ11を含みます。 ontent &quot;&gt;ここでは、急性脳スライスで行われる全細胞パッチクランプ記録のコンテキストで閉ループ電気生理学の様々なプロトコルを適用することができる強力なフレームワークを記述している。我々は、パッチクランプ記録を用いて体細胞膜電圧を記録する方法を示しています若年ラットの体性感覚野からの錐体ニューロンでLCG、理論神経生物とNeuroengineeringの研究室で開発されたコマンドラインベースのソフトウェアツールボックスを使用して、3つの異なる閉ループプロトコルを適用します。 簡単に言えば、記載されたプロトコルは、アクティブおよびパッシブ膜特性の大きな集合の特性に関連する、電流クランプ刺激波形のシリーズの最初の自動注入されています。これらは、刺激波形の定型一連の応答特性の点で細胞の電気生理学的表現型を捕捉するために提案されています。セルの電子コードとして知られている（ 例えば 、参照してください＆＃160; 13,14）が 、電気的応答のようなコレクションは、客観的に、それらの電気的特性に基づいて神経細胞を分類するためにいくつかの研究室で使用されます。これは、比例積分微分（PID）コントローラにより発火の速度の閉ループリアルタイム制御を含む革新的な技術によって、固定入出力伝達関係（FI曲線）の分析が含まれ、第二のインビトロ製剤10と、コンピュータでシミュレートされた仮想のGABA作動性介在ニューロンの手段により2同時に記録錐体ニューロンのリアルタイムで第人工接続で現実的なインビボの様な背景シナプス活性のレクリエーション。 さらに、LCGは、単一の電極を用いたダイナミッククランププロトコルを実装することができ、活性電極報酬（AEC）15、として知られる技術を実装しています。これは望ましくない影響を補償することができます（Aそれは、細胞内刺激を送達するために使用される場合に生じる記録電極のrtifacts）。この方法は、記録回路の等価電気特性のノンパラメトリック推定に基づいています。 このホワイトペーパーに記載された技術と実験プロトコルは、容易に従来のオープンループ電圧と電流クランプ実験に適用することができ、 生体内 17,18 に 、このような細胞外4,16のような他の製剤、または細胞内記録に拡張することができます。全細胞パッチクランプ電気生理学のセットアップの注意深いアセンブリは安定した高品質の記録のために非常に重要なステップです。以下では、そのような実験は、実験者に既に利用可能であることを前提とし、LCGの使用法を説明する上で私たちの注意を集中します。読者は、最適化とデバッグに関する追加のヒントについては、19〜22に指摘されています。

<table><tbody><tr><td>ティッシュスライサー</td><td>ライカ</td><td>VT-1000S</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>サッター</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1.5/0.84 mm OD/ID, フィラメント付き</td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>TMC</td><td>20 シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMLFS</td><td>40X 液浸対物レンズ</td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>サイエンティフィカ</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>コンピュータ制御</td></tr><tr><td>データ収集カード</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Comedi Linuxドライバに対応</td></tr><tr><td>デスクトップコンピュータ</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010 タワーOS</td><td>:リアルタイムLinuxオ</td></tr><tr><td>シロスコープ</td><td>Tektronix</td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>ギブソン</td><td>MINIPULS3</td><td>R4ポンプヘッドを使用 (F117606)</td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>TC02</td><td>PH01 灌流カニューレ</td></tr><tr><td>圧力計</td><td>Testo</td><td>510</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>メモリ</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>ACSF、ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Σ</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-グルコン酸</td><td>シグマ</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>シグマ</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>シグマ</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-ホスホクレアチン</td><td></td><td>Σ P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

実験的神経科学は、新規の開発と応用への関心の高まりを目撃し、多くの場合、複雑な刺激が、システムの応答にリアルタイムに依存​​する適用、閉ループプロトコルれます。最近のアプリケーションは、光遺伝学3を使用して、皮質脳卒中後の発作の制御に、マウス1とゼブラフィッシュ2の両方の運動反応を研究するための仮想現実システムの実装の ​​範囲です。閉ループ技術の重要な利点は、直接アクセスすることはできませんまたは、同時に実験スループットを最大化しながら、このような神経細胞の興奮4や信頼性などの複数の変数に依存し、より高い次元の特性を探査する能力にあります。この貢献ではと細胞電気生理学との関連で、我々はREC、錐体皮質ニューロンの応答特性の研究に閉ループの様々なプロトコルを適用する方法について説明します若年ラットの体性感覚皮質から急性脳スライスにおけるパッチクランプ法で細胞内orded。何の市販またはオープンソースソフトウェアを効率的にここに記載の実験を行うために必要なすべての機能を提供しないように、LCG 5と呼ばれる新しいソフトウェアツールボックスは、そのモジュラー構造のコンピュータ·コードの再利用を最大化し、新たな実験パラダイムの実装を容易に、開発されました。刺激波形は、コンパクトなメタ記述を使用して指定されており、完全な実験プロトコルは、テキストベースの設定ファイルに記述されています。さらに、LCGは、試験の反復と実験プロトコルの自動化に適しているコマンドライン·インタフェースを備えています。

前のセクションでは、L5錐体細胞の電気生理学的特性を特徴づけるために、ソフトウェアツールボックスのLCGを使用して、スライス標本におけるインビボ様シナプス活性を再作成する方法を説明してきました。コマンド·ライン·インターフェースと半自動プロトコルの使用は、生成されたデータの出力および品質に大きな影響を持つことができ、実験の再現性及び効率性を好みます。データを一貫した方法で保存されているのでさらに、それは特定の目的に解析を拡張することは容易である。 図1は、6つの異なるプロトコルを使用して、細胞の基本的な電気生理学的特性が特徴付けされた実験の代表的な結果を示しています。 活動電位の形状と閾値（ 図1A）の測定：現在の脱分極の簡単かつ強力なパルスが平均活動電位の形状を測定するために注入されます。スパイク閾値であります活動電位24の第三の導関数の最初のピークとして計算。電圧-電流曲線（ 図1B）の測定：サブスレッショルド電流パルスは、入力抵抗とサブ...

閉ループプロトコルは、現代の電気生理学においてますます普及しつつあります。私たちは、デスクトップコンピュータとデジタル取得ボードを使用して、in vitroで皮質錐体ニューロンの複雑な電気生理学的プロトコルを実行するためのシンプルで汎用性が高く、安価な方法を提示します。

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

本実験の目的は、フリーで提供されているソフトウェアツールボックスであるLCGを用い、皮質ニューロンにおいてin vitroダイナミッククランプを実施することです。これは、ラットの体性感覚皮質のスライスを調製し、傍正中細胞からパッチクランプ記録を行うことで達成されます。次に、記録した細胞に一連の自動電生理学的プロトコルを適用し、細胞の標準的な特性評価を行います。これにより、その後の解析や細胞型間の比較に有用なデータが得られます。次に、興奮性および抑制性のシナプスイベントの注入をシミュレートします。生体内で新皮質ニューロンが経験する高コンダクタンス状態を再現するため、背景シナプス注入が皮質細胞のゲインをどのように変調させるかを結果に示しています。既存の手法に対する本手法の主な利点は、例えばある実験プロトコルの結果を別のプロトコルの入力として使用するなどして、実験的な記録をより複雑なワークフローに組み込むことが可能である点にあります。この手法は、電気生理学的プロトコルの標準化やデータ解析の加速に寄与し、研究室間でのデータ共有への道を切り開くことができます。本手法は元来、in vitroでのホールセルパッチCLA記録用に開発されましたが、in vivoパッチ、CLA記録、あるいはマイクロ電極アレイを用いた記録など、他の実験的な準備やプロトコルにも便利に利用可能です。ラットの脳を摘出した後、小脳を取り除き、メスを用いて正中線に沿って2つの半球に分離します。片方の半球から余分な液体を取り除き、少量の瞬間接着剤を用いて傾斜プラットフォーム上に固定します。次に、脳の上にCSFを数滴速やかに滴下し、Vibramチャンバーへと移します。ブレードを用いて、脳組織の最初の2.5〜3 mmを切り落とします。その後、スライス表面の損傷を抑えるために、スライス速度と周波数を調整します。次に、厚さを300 µmに設定し、スライスを開始します。ブレードが皮質を通過したら、カミソリの刃または曲げた針を使用して、海馬の上方および関心のある皮質領域の端に切り込みを入れます。その後、スライスを36 °Cのマルチウェル・インキュベーションチャンバーに移します。この手順では、40倍の対物レンズを用いて、スライスを記録チャンバー内に設置します。第5層および脳表面から600～1000 µmの深さにある健全な細胞を探索してください。これらの細胞は通常、コントラストが低く、外観が滑らかで、腫脹していないのが特徴です。健全な細胞が見つかったら、マイクロピペットの3分の1を細胞内液で満たします。次に、設定済みのLinuxオペレーティングシステムが動作しているヘッドステージにピペットを設置します。コマンドを実行してください。シェルのプロンプトが表示されます。データ収集ボードがアンプを駆動していないことを確認するために、このコマンドを入力してください。次に、ピペットホルダーに接続されたシリンジのプランジャーを押し、30から50 millibarsの正圧を印加します。次に、ピペットをスライスから約100 µm上に配置し、マイクロマニピュレーターのアプローチモードを使用して、ターゲット細胞に向かってピペットを移動させます。その後、電気生理学アンプのピペットオフセットを調整し、ボルテージクランプモードで10 mVのテストパルスを出力します。LCG SEALテストコマンドを用いてピペット抵抗をモニターしながら、シリンジのピストンを引き戻して圧力を10～30 mbarまで下げます。ビデオカメラのモニターで細胞の陥没（ディンプル）の形成を確認しながら、ゆっくりと細胞に近づけます。同時に、モニターに表示される電流波形を観察し、テストパルスによって誘発される抵抗値の上昇をモニタリングします。ピペットの抵抗値が上昇し、細胞にディンプルが形成されたら、直ちに圧力を解除し、ピペットに緩やかな陰圧をかけてシール形成を促進させます。その間に、保持電位を-70 mVまで徐々に下げます。緩やかな吸引を加えて細胞膜を破裂させ、ホールセル構成を確立させます。その後、細胞の電気的特性を評価します。LCGEコードを使用して。これは、閾値が-50.5 mVであるパッチ適用された第5層前帯状回ニューロンの平均活動電位です。この図は、過分極電流に対する受動的応答の測定結果を示しています。細胞の基本的な活性特性を特定した結果、この細胞がレギュラー発火ニューロンであることが判明し、擬似的な興奮性後シナプス電位を注入した際の適応は最小限であることが示されました。シェルのコマンドプロンプトでこのコマンドを入力し、次の実験を保存するディレクトリを変更してください。アンプの従来のハードウェア制御を操作するのではなく、この方法を用います。ブリッジバランスおよび容量補正を適用するには、このコマンドを実行して、能動電極補正を行うために必要な電極カーネルを推定してください。フルカーネルは、高速な電極カーネルと、フルカーネルで観察される指数関数的な裾を形成する低速な膜カーネルという2つの成分の和です。前者はピペットの非パラメトリックモデルを構成します。膜カーネルと電極カーネルを分離するために電流注入を行う際、LCGカーネルコマンドにより、高速電極カーネルを構成するポイント数の入力が求められます。次に、電極カーネルが指数関数的な減衰裾の終端をカバーするように数値を選択してください。次に、このコマンドを使用してダイナミッククランプ実験を行います。最後に、結果を可視化します。ここでは、ダイナミッククランプを用いたin vivo様活動の再現を示します。赤色のトレースは興奮性シナプスのシミュレーションを、青色のトレースは抑制性シナプスのシミュレーションをそれぞれ表しています。そして、興奮性または抑制性のポストシナプス電流の集中投射を受けたL5錐体細胞から記録された電位トレースがここに示されています。細胞に注入された対応する興奮性、抑制性、および全電流がチャートに表示されています。20回の試行にわたって生成されたスパイクのラスタープロットは、ニューロンが同一の入力に対して極めて高い信頼性と精度で応答できることを示しています。このビデオを視聴することで、無料で提供されているソフトウェアツールボックスであるLCGを用いて、ダイナミックランプ実験を行う方法を十分に理解できるはずです。この手順は、神経細胞の興奮性から複雑なネットワーク相互作用に至るまで、幅広い対象を調査するための他のクローズドループプロトコルにも応用可能です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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