リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

本実験の目的は、フリーで提供されているソフトウェアツールボックスであるLCGを用い、皮質ニューロンにおいてin vitroダイナミッククランプを実施することです。これは、ラットの体性感覚皮質のスライスを調製し、傍正中細胞からパッチクランプ記録を行うことで達成されます。次に、記録した細胞に一連の自動電生理学的プロトコルを適用し、細胞の標準的な特性評価を行います。これにより、その後の解析や細胞型間の比較に有用なデータが得られます。

次に、興奮性および抑制性のシナプスイベントの注入をシミュレートします。生体内で新皮質ニューロンが経験する高コンダクタンス状態を再現するため、背景シナプス注入が皮質細胞のゲインをどのように変調させるかを結果に示しています。既存の手法に対する本手法の主な利点は、例えばある実験プロトコルの結果を別のプロトコルの入力として使用するなどして、実験的な記録をより複雑なワークフローに組み込むことが可能である点にあります。

この手法は、電気生理学的プロトコルの標準化やデータ解析の加速に寄与し、研究室間でのデータ共有への道を切り開くことができます。本手法は元来、in vitroでのホールセルパッチCLA記録用に開発されましたが、in vivoパッチ、CLA記録、あるいはマイクロ電極アレイを用いた記録など、他の実験的な準備やプロトコルにも便利に利用可能です。ラットの脳を摘出した後、小脳を取り除き、メスを用いて正中線に沿って2つの半球に分離します。片方の半球から余分な液体を取り除き、少量の瞬間接着剤を用いて傾斜プラットフォーム上に固定します。

次に、脳の上にCSFを数滴速やかに滴下し、Vibramチャンバーへと移します。ブレードを用いて、脳組織の最初の2.5〜3 mmを切り落とします。その後、スライス表面の損傷を抑えるために、スライス速度と周波数を調整します。

次に、厚さを300 µmに設定し、スライスを開始します。ブレードが皮質を通過したら、カミソリの刃または曲げた針を使用して、海馬の上方および関心のある皮質領域の端に切り込みを入れます。その後、スライスを36 °Cのマルチウェル・インキュベーションチャンバーに移します。

この手順では、40倍の対物レンズを用いて、スライスを記録チャンバー内に設置します。第5層および脳表面から600～1000 µmの深さにある健全な細胞を探索してください。これらの細胞は通常、コントラストが低く、外観が滑らかで、腫脹していないのが特徴です。

健全な細胞が見つかったら、マイクロピペットの3分の1を細胞内液で満たします。次に、設定済みのLinuxオペレーティングシステムが動作しているヘッドステージにピペットを設置します。コマンドを実行してください。

シェルのプロンプトが表示されます。データ収集ボードがアンプを駆動していないことを確認するために、このコマンドを入力してください。次に、ピペットホルダーに接続されたシリンジのプランジャーを押し、30から50 millibarsの正圧を印加します。

次に、ピペットをスライスから約100 µm上に配置し、マイクロマニピュレーターのアプローチモードを使用して、ターゲット細胞に向かってピペットを移動させます。その後、電気生理学アンプのピペットオフセットを調整し、ボルテージクランプモードで10 mVのテストパルスを出力します。LCG SEALテストコマンドを用いてピペット抵抗をモニターしながら、シリンジのピストンを引き戻して圧力を10～30 mbarまで下げます。

ビデオカメラのモニターで細胞の陥没（ディンプル）の形成を確認しながら、ゆっくりと細胞に近づけます。同時に、モニターに表示される電流波形を観察し、テストパルスによって誘発される抵抗値の上昇をモニタリングします。ピペットの抵抗値が上昇し、細胞にディンプルが形成されたら、直ちに圧力を解除し、ピペットに緩やかな陰圧をかけてシール形成を促進させます。

その間に、保持電位を-70 mVまで徐々に下げます。緩やかな吸引を加えて細胞膜を破裂させ、ホールセル構成を確立させます。その後、細胞の電気的特性を評価します。

LCGEコードを使用して。これは、閾値が-50.5 mVであるパッチ適用された第5層前帯状回ニューロンの平均活動電位です。この図は、過分極電流に対する受動的応答の測定結果を示しています。

細胞の基本的な活性特性を特定した結果、この細胞がレギュラー発火ニューロンであることが判明し、擬似的な興奮性後シナプス電位を注入した際の適応は最小限であることが示されました。シェルのコマンドプロンプトでこのコマンドを入力し、次の実験を保存するディレクトリを変更してください。アンプの従来のハードウェア制御を操作するのではなく、この方法を用います。ブリッジバランスおよび容量補正を適用するには、このコマンドを実行して、能動電極補正を行うために必要な電極カーネルを推定してください。

フルカーネルは、高速な電極カーネルと、フルカーネルで観察される指数関数的な裾を形成する低速な膜カーネルという2つの成分の和です。前者はピペットの非パラメトリックモデルを構成します。膜カーネルと電極カーネルを分離するために電流注入を行う際、LCGカーネルコマンドにより、高速電極カーネルを構成するポイント数の入力が求められます。次に、電極カーネルが指数関数的な減衰裾の終端をカバーするように数値を選択してください。

次に、このコマンドを使用してダイナミッククランプ実験を行います。最後に、結果を可視化します。ここでは、ダイナミッククランプを用いたin vivo様活動の再現を示します。

赤色のトレースは興奮性シナプスのシミュレーションを、青色のトレースは抑制性シナプスのシミュレーションをそれぞれ表しています。そして、興奮性または抑制性のポストシナプス電流の集中投射を受けたL5錐体細胞から記録された電位トレースがここに示されています。細胞に注入された対応する興奮性、抑制性、および全電流がチャートに表示されています。

20回の試行にわたって生成されたスパイクのラスタープロットは、ニューロンが同一の入力に対して極めて高い信頼性と精度で応答できることを示しています。このビデオを視聴することで、無料で提供されているソフトウェアツールボックスであるLCGを用いて、ダイナミックランプ実験を行う方法を十分に理解できるはずです。この手順は、神経細胞の興奮性から複雑なネットワーク相互作用に至るまで、幅広い対象を調査するための他のクローズドループプロトコルにも応用可能です。