拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査

以下の実験の全体的な目標は、後生動物モデル生物C eleganceを使用して、PreOn様タンパク質の広がりと複雑な毒性を調べることです。これは、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用して、PreOn様タンパク質を含む小胞の細胞内および細胞内輸送を監視することによって達成されます。次に、組織特異的なフォールディングセンサーとユビキタスに発現する応力。

レポーターは、細胞の自律性および非細胞の自律性が細胞の適応度に及ぼす影響を評価するために使用されます。次に、PreOn誘導毒性の新しい修飾因子を特定するために、ゲノムワイドなRNAiスクリーニングが行われます。スクリーニングは、毒性の読み出しとしてスラッシングを使用して液体培養で実行されます。

最後に、画像Jのプラグインであるワームトラッカーを使用して、Cエレガンスの組み合わせの動きを定量化します。これらの方法により、PreOn様タンパク質の細胞間移動に関与する遺伝的経路とその非細胞自律毒性を解明することができます。シンクロナイズドシーエレガンスコントロールとPreOnドメイントランスジェニックライン、および10%アグロスパッドを調製した後、添付のテキストプロトコルに従って、100ナノグラムのポリスチレンビーズ3マイクロリットルと4ミリモルリマソール3マイクロリットルをアグロスパッドにピペットで注入します。

プラチナワイヤーピックを使用して、プレートから溶液に所望の年齢の線虫を移し、カバースリップを使用してカバーし、細胞内レベルで線虫を画像化します。共焦点顕微鏡の顕微鏡スライドホルダーにスライドを置き、63 x または 100 x 1.4 NA のオイル対物レンズを使用します。次に、METAMORPHを開き、多次元取得を選択します。

また、メインタブで、タイムラプスとランニングジャーナルのチェックボックスをオンにします。[保存]タブで、ファイルを保存するためのディレクトリフォルダを選択または作成し、ファイルに名前を割り当てます [波長]タブでは、ヨーコクワッドレッドまたは同等のMRFPイメージングの照明を使用し、露出を100〜300ミリ秒に調整し、カメラゲインを100〜300に調整します。次に、[タイム ラプス] タブで、時間間隔を 1 秒、期間を 5 分、タイム ポイントの数を 301 に設定します。

ジャーナルタブの下。仕訳帳はA FCセット、Zホールド、A FC復帰はタイプセレクトスペシャルを2回選択し、初期ポイントは開始時点と終了時点を選択します。セットアップが完了したら、取得を押します この手順に続いて、粒子追跡アプリケーションなどの他の方法を使用して、ディスカスの動的特性を測定できます。

プリオンドメイントランスジェニックを同期させ、線虫をタイプしながら、テキストプロトコルに従ってinger RNAIライブラリープレートをコピーした後、重複したRNAiプレートを摂氏37度および300RPMでインキュベートして、空のベクターL 4 4 4 0をコントロールとして保有するHT one 15 Eコリ菌を使用します。それを培養チューブ内で別々に増殖させ、次にマルチチャンネルピペットを使用して、65マイクロリットルの培養物を2 96のウェルの4分の1に移します。マルチチャンネルヘッドを含む自動ワークステーションを備えたウェルプレートが分注されました。

10マイクロリットルの5ミリモルの希釈されたIPTGをRNAi細菌およびコントロールプレートの各ウェルに注入します。バクテリアがインキュベートしている間、3時間インキュベートする前に、それらを再密封してください。同期した野生型コントロールとトランスジェニックL-1幼虫とM-9バッファーウェルを混合し、5〜10マイクロリットルをガラス顕微鏡にピペットで移します。

ワームをスライドカウントし、マイクロリットルあたりのワームの数を計算します。3時間の細菌インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、ワームに熱ストレスがかからないように室温に戻します。次に、テキストプロトコルに従って、M nineバッファーにIPTGコレステロールと抗生物質を補充します。

また、適切な量のPreOnドメイントランスジェニックワーム溶液を、マイクロリットル混合物あたり15本のワームの最終濃度まで追加して、均一に分配します。次に、RNAiプレートの各ウェルと空のベクターコントロールプレートの1つのウェルに50マイクロリットルを分注します。野生型ワーム溶液を2番目のコントロールプレートに分注します。

次に、すべてのプレートを密封せずに放置し、通気を可能にし、4〜5枚のプレートを積み重ねて液体培養物が蒸発しないようにし、湿らせたペーパータオルで包み、その後にアルミホイルで包みます。プレートを摂氏20度、200RPMで4日間インキュベートします。プレートには、モニター付きのコンピューターに接続されたFalcon four M 60カメラを使用して、対照処理されたPreOnドメイントランスジェニック動物と比較してスラッシングの増加を視覚的にスクリーニングします。

自動化されたリキッドハンドリングワークステーションを使用してワームをR RNAiプレートに分注する主な利点は、ウェルあたりのワームの数とばらつきが大幅に減少することです。固体プレート上で運動性アッセイを実施し、候補RNAiクローンを検証するには、テキストプロトコルに従って一晩でRNAi細菌を増殖させます。次に、1ミリモルのIPTGを使用して、DS RNAの発現を3時間

各RNAi細菌クローン150マイクロリットルを使用して、事前に調製したNGMプレートを薄い層に広げて播種します。実体顕微鏡で室温で2日間乾燥させます。前述のように、同期した線虫と懸濁液の量を決定し、各実験プレートに25〜30 Lの幼虫を1匹加えます。

線虫が到達するまで、線虫を摂氏20度で4日間インキュベートします。成人期の2日目に線虫の運動性を定量化するために、カメラと簡単なPCIイメージングソフトウェアの電源を入れます。カメラのアイコンをクリックすると、撮影条件の調整が有効になります。

次に、イメージング条件を次のように設定します。ゲインをゼロライトモードに設定し、高速インデックスを1に、ビニングを2に設定します。次に、ライブ露出と自動露出をクリックし、顕微鏡のミラーと明るさとコントラストのダイヤルを動かして照明条件を調整します。

時間をクリックし、スキャンしてフォルダとファイル名を入力し、フィールド遅延を20ミリ秒に設定し、時間で停止します 30秒。ライブを押しますview 記録するプレートの領域を選択するために。次に、ステージ上でプレートを3〜4回タップします。

視野内での位置をすばやく確認し、ムービーの録画が終了したら開始を押し、画像を右クリックして[モンタージュシーケンスのエクスポート]を選択し、ムービーをCXD形式からAVIファイルにエクスポートします。運動性ビデオを分析するには、画像Jを開き、プラグインタブを選択し、次にワームトラッカーを選択してワームトラッカーバッチを選択し、ワームトラッカーのメイン入力ウィンドウで分析するすべてのファイルを含むディレクトリを選択し、ここで詳しく説明するように入力値をロードします。各パラメータの説明は、プラグインに付属の説明書に記載されています。

[OK] をクリックし、移動解析の実行を許可します。最後に、結果をキュレートするために、検出されたすべてのトラックが実際の海のエレガンスからのものであることを確認し、アーティファクトを排除します。各ムービー用に作成したTXTファイルを開き、データ解析ソフトのファイルにコピーします。

作成したラベルzipファイルを開き、結果のラベルTIFFを実行して、誤ったワームトラックを手動でチェックして排除します。研究室の元ポスドクであるYesper Petersonは、毒性の測定値であるCL Eleganceモチルの手動評価の代わりに、ワームトラッカーのアイデアを最初に思いつきました。ワームトラッカーを使用すると、タイムラプスイメージングを使用して、より短い時間でより多くの条件を評価しながら、ユーザーバイアスのない自動化された方法でこれらの実験を行うことができます。

RFPタグ付きR2、E2は、管状小胞に蓄積し、フォールディングセンサーまたはストレスレポーターを発現するcoexによって細胞内および細胞間で輸送されるのが見られました。PreOn様タンパク質細胞と併用することで、自律的効果と非細胞的自律効果を評価することができます。筋肉細胞におけるR two E 2の発現は、腸内でのQ 44凝集の早期発症をもたらし、R two E 2がR 2 E 2の共発現に対して非細胞自律的な影響を及ぼしていることを明らかにします。SOD 3 PGFP転写酸化ストレスレポーターは、異なる組織におけるレポーターのアップレギュレーションにつながります。 PreOnドメインが全ゲノムスクリーニングに続いて非細胞的に酸化ストレス応答を誘発することを実証しています。

この動画は、コンピュータ画面上の高解像度イメージングと視覚化により、プレートの4分の1を同時にスクリーニングできることを示しています。週に2回のセッションを実施すれば、6週間以内にRNAiライブラリ全体をスクリーニングすることができます。ワームトラッカーは、ここで見られるように、Cエレガンスの運動性を定量化するために使用されました。

Worm Trackerは、元のビデオをバイナリ形式に変換し、各ワームにトラックが割り当てられます。処理されたビデオは、トラックを重ねて表示し、アーティファクトを手動で排除できます。[Body Lengths per second] パラメーターは、潜在的なサイズの違いに対して正規化されます。線虫。

この方法では、PreOnによる毒性の35のサプレッサーが同定され、対照処理された線虫と比較して、運動性の表現型が少なくとも133%、最大256%に増加しました。ワームトラッカーをリースする際には、取得したワームトラックを手動で確認することを覚えておくことが重要です。このソフトウェアはワームの識別に優れていますが、背景が誤って動物と識別されることがあります。

したがって、ワームトラッカーを実行した後は、ビデオを確認することを忘れないでください。これらの方法は、特定の疾患関連タンパク質が細胞から細胞へと広がることができるかどうか、同様の可能性、または細胞間伝播とこれらのタンパク質の複雑な毒性との間に関連があるかどうかなど、神経変性疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。キッズ。