Name: 拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査 C。エレガンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶプリオン様タンパク質の拡散と毒性をC. elegansモデルで調査する手法。蛍光顕微鏡とRNAiスクリーニングを用いて神経変性疾患の治療標的を探索します。

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原稿に対する有益な議論と批判的なコメントをいただいたCindy Voisine氏とYoko Shibata氏に感謝します。ノースウェスタン大学のハイスループット解析研究所(HTAL)とバイオロジカルイメージングファシリティ(BIF)の協力に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIGMS、NIA、NINDS)、エリソン医学財団、ダニエル・F・アンド・エイダ・L・ライス財団(RIMに所属)からの助成金によって資金提供されました。C.I.N.-K.はドイツ研究振興協会(KR 3726/1-1)の支援を受けた。

1.モニタリング経細胞は、in vivoタイムラプスイメージングにより、プリオン様タンパク質の広がり注：C.を育てる注意深くエレガンス野生型（WT）（N2）とトランスジェニック系統の標準的な方法に従ってとは、培養温度47を制御する。 <ol><li> C.のトランスジェニック系統を生成しますエレガンス単量体赤色蛍光タンパク質（mRFPと）でタグ付けされたプリオン様タンパク質を発現する。マイクロインジェクション48を使用する方法を示し、このビデオを見る。これらの染色体外の行を統合する方法を説明し、さらに詳細及び方法については、49を参照してください。 </li><li>卵は、標準的な方法50に従って敷設又は漂白によって同期集団を準備します。 <ol><li>産卵による同期<ol><li>転送10から20妊娠プレート上の大人とそれらの1のために卵を産むましょう - 2時間。プレートから大人を削除し、子孫が希望歳までに成長しましょう​​。 </li></ol></li> &lt;漂白によるLI&gt;同期<ol><li>妊娠大人の非同期の人口を収集し、アルカリ性の次亜塩素酸ナトリウム溶液（250 mMのNaOHおよび1：H 2 O中の市販の漂白剤の4（v / v）で希釈）でそれらを漂白。二回（1分間218×gで）M9バッファ47（21 MMNA 2 HPO 4·7H 2 O、22 mMKH 2 PO 4、86 mMNaCl、1 mMMgSO 4·7H 2 O、1までのdH 2 Oを追加すると、卵を洗うL）。 </li><li>彼らは20℃で穏やかに撹拌し、O / NでM9バッファーに孵化することを許可する。ワームの開発が同期集団を残し、食料源の非存在下でL1段階で阻止するであろう。 OP50 E.を播種し、新鮮な線虫の成長メディア（NGM）プレート上になL1を転送大腸菌とは、子孫が希望する47歳まで開発してみましょう。 </li></ol></li></ol></li><li> 50を説明するように顕微鏡スライド上に（H 2 O）2％アガロースパッドを準備します。 <ol><li> 2マイルを準備その全長にわたって配置された表示用テープとcroscopeスライドをスペーサーとして使用する。それらの間の第三の顕微鏡スライドを置きます。 </li><li> H 2 Oおよびクリーンスライド上にピペット1滴の2％アガロースを溶解する。 </li><li>寒天ドロップの上に他の3つのスライドに垂直な第四のスライドを置きます。静かにラベルテープと同じ厚さにパッドを平らにするためにそれを押し下げます。 </li><li>スペーサを取り外し、静かに離れてスライドを引いて前に1分間、それが乾燥してみましょう。寒天パッドは、それらのいずれかに固執します。 </li></ol></li><li>白金線のピックを使って、パッドと転送〜10匹の動物にピペット〜10μlの麻酔薬（M9バッファーで2 mMのレバミゾール）。カバースリップ（〜22×22 mm）ので覆い、1時間以内に画像を撮影する。 </li><li>あるいは、より長い期間にわたって動画を取得するか、さらに、動物の任意の動きの可能性を低減するために、麻酔薬およびビーズ固定化51の組み合わせを使用。 <ol><li> 10％のAGAを準備（M9バッファ内の）51を説明し、3μlのナノスフェアサイズ標準溶液へのワーム（ポリスチレンビーズ、100nm）を加えた3μlの麻酔薬（M9バッファーで4 mMのレバミゾール）を追加すると、パッドの増加となりました。カバースリップで優しくカバー。乾燥を避けるために、VALAP（ワセリン、ラノリン、パラフィンワックスの等量混合物）を用いてカバースリップをシールする。 </li></ol></li><li>画像は、共焦点顕微鏡を使用してワームを固定化した。 注：結果は、EM-CCDカメラとのMetaMorphなどの顕微鏡オートメーションおよび画像解析ソフトウェアを備えたスピニングディスクAF共焦点顕微鏡を用いて得られ、以下の仕様の概要を説明するが、他の同等の共焦点撮像システムも使用することができるされている。 <ol><li> 63Xまたは100X / 1.4NA油浸対物を使用して、顕微鏡スライドホルダーにワームを含む顕微鏡スライドを配置。 </li><li>ソフトウェアを開きます。 mRFPとイメージング用のレーザパワーとフィルタを調整します。 10％の電力とエミッションフィルタ&gt; 600 nmで561 nmのレーザーを使用してください。 </li><lI&gt;開く &quot;多次元取得」。 「メイン」タブで、「微速度撮影」と「ファイル名を指定して実行ジャーナル」（：オフハードウェアオートフォーカス）のチェックボックスをオン。 </li><li> 「保存」タブで選択したり、ファイルを保存するディレクトリのフォルダを作成します。ファイルに名前を割り当てます。 </li><li> 「ウェーブ長」タブの下で適切な照明を選択して、露出とゲインを調整します。 （ライブ画像を用いて評価）個々のサンプルに応じて、100と300ミリ秒と100と300の間で、カメラのゲインと露出で「YokoQuadレッド」（またはmRFPを撮像のための同等の照明設定）を使用します。 </li><li> 「微速度撮影」タブで「時間ポイント数」= 301、 &quot;時間&quot; = 5分および「時間/間隔」= 1秒を選択します。 </li><li> 「AFCのSET ZのHOLD」と「AFCリターンのZ HOLDに」、種類：：＆ &quot;ジャーナル」タブでジャーナルを選択＃8220;スペシャル」（2回）、初期点：「スタート時点」と「時点の終わり」。このオートフォーカスオプションは、画像より長期間にわたって同じセクションに重要です。 </li><li>セットアップが終了したら、Enterキーを押して「取得」。タイムラプスビデオは、独立したTIFFファイルとしてリコールセーフされている。 </li><li> ImageJの中で与えられた時系列のすべて.TIFFファイルを開きます。 「イメージ」→「スタック」→「スタックへのイメージ」に進みます。必要に応じて、→「ファイル」の下にムービーを書き出すなど、サイズバーを追加、明るさとコントラストを調整→「AVI ...」「名前を付けて保存」（例えば、ビデオ1と2は図1を対応する参照）。 </li></ol></li></ol> 2。細胞自律と非細胞自律を調査するために折りたたみセンサーおよびストレスレポーターを使用すると、タンパク質恒常性と毒性に影響<ol><li>折りたたみセンサやストレスreporteを同時発現するトランスジェニック系統を生成しますプリオン様タンパク質と一緒にrを。十字架を確立するか、トランスジェニック系統を生成する方法の方法については、48,49,52を参照してください。 C.のリストについては、表1を参照してください使用することができる。エレガンス株 。 </li><li>トランスジェニック動物の同期化された集団を準備し、（セクション1.2）50上記のように希望歳までに成長します。 </li><li>実体顕微鏡を用いて、折り畳み式センサやストレスレポーターのそれぞれの表現型を調べる。 <ol><li>折り畳みセンサーは、同期後に各日の凝集体を保有する動物の数を決定する（例えば、 図2EおよびF参照）。 </li><li>ストレスレポーターのために、テストレポーターの増加した蛍光のプリオン様タンパク質の共発現の結果（例えば、 図3を参照）場合。 </li></ol></li></ol> C.におけるプリオン誘導毒性の抑制3.ゲノムワイドスクリーンエレガンス<img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> のRNAiスクリーニングプロトコルの4略図を図。個々のステップの詳細については、プロトコルセクション3を参照してください。 <ol><li> C.の同期虫ワームおよびRNAiライブラリの重複<ol><li> RNAiスクリーニングのために、AhringerのRNAiライブラリ（またはビダルのRNAiライブラリ）53,54を使用しています。 10％グリセロールを補った100μlのLB-アンプメディアとプレート（LB中の50μg/ mlのアンピシリン）を充填することにより、96ウェルプレートにオリジナルの384ウェルフォーマットからのRNAiライブラリをRearrayと96ピンレプリケーターを使用して接種する。 -80℃で攪拌し、店舗で37℃CO / Nで成長する。 </li><li> C.を維持虫 WT及び20℃のNGMプレート上でのトランスジェニック系統をOP50 E.を播種標準的な方法47に従って大腸菌 。 </li><li>漂白によってプリオンドメイントランスジェニックおよびWT（コントロール）線虫を同期する（セクション1.2を参照）。 </li><li>ワームが漂白されていることを同じ日に、50μg/ mlのアンピシリンを補充したLBメディアを準備。分配するために、自動試薬ディスペンサーを使用する（またはピペット手動で）、96ウェルプレートの各ウェルにLB-アンプ培地65μlの。 </li><li> -80℃から96ウェルAhringerのRNAiライブラリプレートを取り外し、ペーパータオルで並んで無菌フードにそれらをもたらす。すぐにプレートがまだ凍結されている間、プレートの外側に氷からの汚染を避けるように注意しながら、上下逆さまにプレートを保持することにより、シールテープを取り除く。プレートを再反転し、それらを約30分間解凍しましょう​​。 </li><li> 1のRNAiライブラリのプレートに1無菌の96ピン·レプリケータを浸し、その後1新鮮なLB-Ampプレートに。各プレートのために新鮮な無菌のレプリケータを使用してください。接着剤箔テープですべてのプレートを密封し、-80℃にライブラリプレートを返す。リプリケータは、漂白剤に浸しすすぐことができ、そして再使用するオートクレーブ処理。 </li><li>複製されたのRNAiプレートを37℃、300rpmに設定したインキュベーター中でO / Nを成長させる。 HT115 Eを使用するには大腸菌対照として空のベクター（L4440）を保有する細菌は、培養チューブに分けて、それを成長した後、2枚の96ウェルプレートの四分の一にマルチチャンネルピ ​​ペットとの文化の65μlのピペット。 </li></ol></li><li>細菌のdsRNA生産やワームの追加の誘導<ol><li>希釈しイソプロピルβ-D- thiogalactopyranosid（IPTG）のddH 2 Oで5 mMの濃度まで希釈されたIPTG10μlのは、RNAi細菌と対照プレートの各ウェルに（手動またはピペット）分配するマルチチャンネルヘッドを自動化されたワークステーションを使用してください。バックインキュベーターにプレートを再シールして配置します。それらは、37℃で3時間振盪しましょう​​。 </li><li>細菌が揺れている間、ワームを準備します。ガラス顕微鏡スライドに - （10μL〜5）少量のサンプルをよくM9 /ワームのサスペンションを混ぜ、ピペット。カウント実体顕微鏡下でのワームの数と、1μl当たりのワームの数を計算する。 </li><li> 0.20 mg / mlのIPTG、8.0 / mlのコレステロール、50μg/ mlのアンピシリン、9.6 / mlのテトラサイクリン、0.0835 / mlのファンギゾン、および：無菌技術を用いて、以下の最終濃度を補充したM9（M9 +）の溶液を調製する50μLあたり15ワーム。 <ol><li>プリオンドメイントランスジェニックおよびWTワームのための別々の溶液を作る。必要なM9 +ワーム溶液の最終体積は、RNAiコピープレート（下記参照）に加え〜自動化ディスペンサーが使用される場合、リザーバ内に残るデッドボリュームを30mlの数に依存する。 </li></ol></li><li>細菌のdsRNA生産の3時間の誘導後、培養器の外板を取り、動物にストレスを熱を避けるために、RT（〜30分）にそれらを冷ます。 </li><li> 50μlのM9 +プリオンドメインジェニックワームのRNAiプレートの各ウェルに溶液および空ベクター対照プレートのいずれかを分配する。作る動物は貯水池の底に沈降する傾向があるので、各ステップの前にワームの溶液を混合するようにしてください。 </li><li>第二制御板へのWTワームを分注する。通気を可能にするために開封プレートのままにしておきます。一緒に5皿や湿ったペーパータオルとアルミホイルで包む - 蒸発する液体培養を維持するには、4スタック。 4日間、20℃、200rpmでインキュベートする。 </li></ol></li><li>得点 注：インキュベーターで4日後、ワームは、成人期の二日目にも、画面の準備ができています。動物が邪魔されずにスラッシングを確実にするためにスクリーニングする前に30分間ノン揺れ条件に合わせて調整しましょう​​。 <ol><li>対照処置プリオンドメイントランスジェニック動物と比較して増加したスラッシングを目視でモニターとコンピュータに接続されたファルコン4M60カメラを用いて、スクリーン。 </li><li> wrMTrck（次のセクションを参照）を使用して確認するために、予備的ヒットのリストをコンパイルします。 </li></ol></li></ol>予備の4.確認画面のヒット<ol><li>固体プレート上の運動アッセイ<ol><li>標準的な方法47に従って、アンピシリン100μg/ ml、12.5 / mlのテトラサイクリンおよび1mM IPTGを補ったNGMでプレートを準備します。可能な場合は、より合理映像取得プロセスを可能にするメディアの同じ高さを、持っているすべてのプレートを確実にするために、板注ぐマシンを使用しています。 </li><li> 37℃、250 rpmで〜1ミリリットルのLB +アンピシリン50μg/ ml、O / Nで異なるRNAiのクローンを育てる。 </li><li>次の日、3時間、1mMのIPTGでdsRNAの発現を誘導する。薄い層に広げ、それぞれのRNAi細菌クローン150μlでプレートをシード。暗闇の中で室温で2日間乾燥細菌をしてみましょう。 RNAiのクローン当たり3プレートを準備します。 </li><li>標準的な方法50（セクション1.2を参照）に応じて漂白することによりワームの人口を同期して、M9培地中で卵が孵化O / Nを聞かせて。 </li><li>ワーム懸濁液のサンプルを取り、NEMの量を決定する実体顕微鏡で1μl当たりatodes。 30のL1ワーム - それは25を含むように続いて、各実験プレートにM9プラスワームの適切な量をピペット。ワームは成人期の2日目に達するまで4日間、20℃で線虫を成長させる。 </li></ol></li><li> ImageJのためのwrMTrckのプラグインとのワ​​ームの運動性の定量分析 注：ビデオは浜松オルカ-R2デジタルカメラC10600-10Bと浜松シンプルPCIイメージングソフトウェアと10倍の倍率で立体顕微鏡を用いて記録した。 <ol><li>カメラとシンプルなPCIイメージングソフトウェアをオンにします。画像形成条件の調整を可能にする「ライブ」をクリックする。 </li><li>次のようにビデオ条件を設定します。ゲイン= 0;ハイライトモード=;高速インデックス= 1;ビニング= 2.「自動公開」した後、顕微鏡鏡と明るさとコントラストダイヤルを動かし、照明条件を調整します。 NOTE：ビデオoverexpことなく、高いコントラストを有する必要がある動物は明るい背景に黒い図形として表示されるように、osed。 </li><li> 「リアルタイム検索」をクリックし、フォルダとファイル名を選択します。 30秒20ミリ秒と「時の停止」に「フィールド遅延」に設定します。 （ほとんどのワームがどこにあるか）を記録する板の面積を選択するために押して「ライブレビュー &quot;。ステージ上でプレートを3または4回タップして、すぐに「開始」ビューとプレスの分野での地位を確認する。 </li><li>映画は記録を終了した後、画像の上で右クリックして、.AVIに.cxd形式からムービーを書き出すために「エクスポートモンタージュシーケンス」を選択します。 </li></ol></li><li>運動性のビデオを分析する<ol><li> ImageJソフトウェアを開き、「プラグイン」タブに移動し、その後「wrmtrck」と選択して &quot;wrMTrckバッチ」。分析対象のすべてのファイルを含むディレクトリを選択します。 </li><li> FIGURで詳述するようにwrMTrck_Batchの主入力ウィンドウでは、入力値をロードE 5C。各パラメータの説明は、プラグインに付属の説明書に記載されています。 「OK」をクリックし、運動解析の実行をしてみましょう。 </li><li>結果をキュレーションし、検出されたすべてのトラックが実際のCからであることを確認するエレガンスと、アーチファクトを排除する各ムービーの作成​​.txtファイルのそれぞれを開き、データ解析ソフトウェアファイルに情報をコピーする。手動で偽のワームのトラックをチェックし、排除するために作成された「* _labels.zip」ファイルを開き、得られた「* _labels.tif &quot;を実行。 </li></ol></li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここに記載されている方法は、拡散とプリオン様タンパク質の複雑な細胞自律的かつ非細胞自律的毒性を説明するのに役立つ。我々は最近、凝集しやすいサイトゾルプリオンドメインはオートファジー関連プロセスでの膜結合小胞に取り込まれることを発見した。これらの小胞の特定のサブセット内および細胞及び組織40との間のプリオンドメインを輸送する。生きている動物に彼らの動きを監視するための鍵は、タンパク質のみmRFPと標識タンパク質がこれらおそらく酸性小胞で見ることができたので、mRFPとでタグ付けなければならないことである。同じアプローチを使用して、我々は現在、そのような（ALSにリンク）スーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）、（PDにリンク）、α-シヌクレインまたはTAR DNA結合タンパク質として、特定の疾患関連タンパク質の可能性プリオンのような挙動を調査している（ALSにリンク）43（TDP-43）。ベシクル内でこの間輸送は、いくつかの他のタンパク質で使用されると思われるが、あるかもしれません拡散できるようdditional経路。 よく特徴付け折り畳みセンサを使用する<e...

アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および伝染性海綿状脳症（TSE）を含む多くの神経変性疾患は、凝集しやすいタンパク質と会合している、したがって、集合的にタンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患（PMDのとして知られている）。それらはヒトおよび動物の両方1に感染することができるという点でのTSEまたはプリオン病は、PMDののユニークなクラスを構成する。分子レベルでは、プリオンは募集および病理学的βシートが豊富なPrP Scの高次構造2,3に単量体のαヘリックスが豊富なホストでエンコードされた細胞のプリオン（PRP C）を変換することによって複製する。自己増殖タンパク質凝集体は、哺乳動物のプリオン4,5との重要な特徴を共有する真菌、で同定されている。さらに、哺乳類プリオンは細胞間の移動が可能であり、ナイーブ細胞6,7-感染する。 のPMD OTHながらERのTSEが感染性はないよりも、彼らは、プリオン病8,9と共通の病原性の原則を共有しています。のPMDのそれぞれにリンクされたタンパク質は、構造または機能に関連していないが、これらは結晶化のようなプロセスを経由してすべてのフォームの凝集体は核と呼ばれるまたは重合を播種。さらに、タンパク質性種子はそれらの可溶性アイソ2,10,11を補充することによって成長する。自己増殖に効率が一緒にそのような分子シャペロンなどの追加の細胞因子と最終的に集計核、播種、断片化および12〜15の拡散率を決定するタンパク質の固有の特性に応じて、 生体内で変化する。したがって、タンパク質凝集を効率的に伝播することができ、これらの要素の間で微妙なバランスが存在しなければならない。唯一のいくつかのアミロイド形成凝集体はプリオンの特性を保有するため、すべてのPMDが感染性ではない理由も説明するかもしれない。プリオンは、「トップパフォーマー &#39;Oを表しているようだそれらのPMD 8,13を研究するための強力なツールになり自己複製タンパク性凝集体のFA広いスペクトル、。 興味深いことに、疾患関連凝集に関連する毒性は、多くの場合、非細胞自律的な構成要素16,17を持っています。これは、厳密にのみ細胞が遺伝子を示すの特定の表現型を発現することを意味している自律的な効果を、細胞とは対照的に、対応する遺伝子を発現しない隣接細胞に影響を与えることを意味する。これは説得力組織特異的発現によって実証または神経変性疾患18-26の多数のモデルにおけるそれぞれのタンパク質のノックダウンした。様々なメカニズムが減少した栄養供給、ニューロンのシグナル伝達における不均衡、グルタミン酸興奮毒性、および神経炎症16,27,28を含むのPMDで、この非細胞自律的毒性、の基礎として提案されている。また、セル間の疾患関連プリオン凝集体のような動きは、mighTこの側面29,30に貢献する。増加する証拠は、プリオン以外のタンパク質含有物特性は、多くのPMD 30-36で観察病理の広がりを説明し得る、細胞間で伝達することができることを示唆している。しかし、まだ疾患タンパク質の細胞間移行及び隣接セルに対する毒性効果の間に明確な因果関係が存在するか否かを決定されなければならない。したがって、細胞間の伝送と非細胞自律的な毒性の根底にある細胞経路のより良い理解は、新規治療薬の開発のために必要不可欠である。しかし、後生動物において、ミスフォールドタンパク質の細胞から細胞への伝達に影響を広げ、細胞因子プリオン様の多くの側面はよく生物レベルで、特に理解されていない。 線虫（Caenorhabditis elegans）線虫は、電位を提供するいくつかの利点を有する プリオン様spreadiの新しい面を発見後生17 ngの。これは、in vivoで生体内の蛍光タグ化タンパク質の追跡を可能にする、透明である。さらに、病気の影響を受け、多くの細胞および生理学的プロセスは、人間のワームから保存されており、C.されている虫も遺伝子操作および分子および生化学的解析37-39幅広い種類のに適している。正確には959体細胞はまだ筋肉、神経細胞および腸を含む、いくつかの異なる組織タイプがあり、シンプルなボディプランに大人の雌雄同体を構成している。 C.の新しいプリオンモデルを確立するために、 虫は、我々はワーム4,40には知られている内因性プリオンタンパク質が存在しないので、外因的に、よく特徴付けグルタミン/アスパラギン（Q / N）細胞質の酵母プリオンタンパク質Sup35のリッチプリオンドメインNMを表現することにしました。酵母プリオンはプリオン複製41-44の基本的なメカニズムの解明に貴重だった。さらに、NMはモミです哺乳動物細胞培養45,46におけるプリオンの完全なライフサイクルを再現することが示されている第サイトゾルプリオン様タンパク質。同様に、Cで発現した場合虫は 、Sup35プリオンドメインは、酵母細胞と比較して、後生動物細胞内での増殖のためのさまざまな要件に非常によく採用され、プリオン生物学40の主要な機能を示した。NM凝集は、ミトコンドリアの完全性の破壊との外観を含め、深遠な有毒な表現型と関連していた細胞レベルで、様々なオートファジー関連小胞、ならびに胚および幼虫停止、発達遅延、および生物レベルでのタンパク質の折り畳み環境の広範な乱れ。驚くべきことに、プリオンドメインは、導入遺伝子が発現していないもので、隣接組織に影響を与え、細胞自律的かつ非細胞自律的な毒性を示す。さらに、内および細胞間のプリオンドメインの小胞輸送をリアルタイムに監視される&lt;em&gt;の生体内40で。 ここでは、Cのプリオンのような普及を検査する方法を説明します虫 。私たちは、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いてプリオンドメインを含む小胞の細胞内および細胞間輸送を監視する方法について説明します。私たちは、組織特異的な折り畳み式センサの使用を強調し、普遍的に細胞のフィットネス上の細胞自律的かつ非細胞自律的な効果を評価するためのストレスレポーターを表現します。最後に、プリオン誘発毒性の新たな変性剤を同定するために最近行われたゲノムワイドRNA干渉（RNAi）は、画面の手順を説明する。組み合わせて、これらの方法は、タンパク質の細胞間移行及びそれらの非細胞自律的な毒性に関与する遺伝的経路を離れていじめるのを助けることができる。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノスフィア サイズ スタンダード 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer RNAi ライブラリ</td><td>出典 BioScience LifeSciences&nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR冷蔵遠心分離機、120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>96ピンリプリケータ&nbsp;</td><td>サイオノミックス&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>HiGro 大容量インキュベーションシェーカー&nbsp;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Multidrop Combi 試薬ディスペンサー&nbsp;</td><td>Titertrek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm Biomek FX AP96 自動ワークステーション&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44 シェーカー</td><td>ニューブランズウィック</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&アクション=製品&contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ ORCA-R2 C10600-10BデジタルCCDカメラ</td><td>浜松 http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスクAF共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ Falcon 4M60カメラ&nbsp;</td><td>テレダイン・ダルサ&nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 顕微鏡 オートメーション &画像解析ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html Hamamatsu SimplePCI 画像解析ソフトウェア</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>ImageJ</td> <td>用プラグイン wrMTrck</td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>C. elegans strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td><td>当研究室から入手可能な</td><td>森本研究室</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>折り畳み式センサーとストレスレポーターひずみ</td><td></td><td></td><td></td>のソースについては、表1を参照してください</tr></tbody></table>

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; c。エレガンス</em

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

プリオンは、型破りな自己増殖性タンパク質性粒子であり、コードする核酸を一切含んでいません。これらのタンパク質性種子は、良性の細胞アイソフォームの変換と複製のテンプレートとして機能します。蓄積された証拠は、多くのタンパク質凝集体が自己増殖テンプレートとして作用し、同族タンパク質のフォールディングを損なう可能性があることを示唆しています。凝集体は特定の状況下で機能することがありますが、このプロセスはしばしば細胞タンパク質の恒常性(プロテオスタシス)の破壊につながり、最終的にはアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、伝染性海綿状脳症(TSE)などの壊滅的な疾患につながります。プリオンの増殖とタンパク質凝集体の細胞間拡散の正確なメカニズムは、まだ精力的に研究されています。この知識をさらに深めるために、最近、細胞質酵母プリオンタンパク質Sup35のプリオンドメインを発現するための、線虫Caenorhabditis elegansにおける新しい後生動物モデルが確立されました。このプリオンモデルには、生きた動物の蛍光タグ付きプリオンドメインを直接モニタリングでき、遺伝的アプローチが容易になるなど、いくつかの利点があります。ここでは、C.エレガンスを用いて、タンパク質凝集体のプリオン様挙動を研究し、プリオン誘発毒性の修飾因子を同定する方法について述べます。

in vivoでのタイムラプスイメージングによるプリオン様タンパク質の広がり間のモニタリング トランスジェニックC.プリオンドメインを発現する線虫株は、例えば 、細胞から細胞への伝達および非細胞自律的な毒性、プリオン様タンパク質の特定の側面を分析するために特に適している。動物の透明性は、蛍光人生のあらゆる段階での生体内からタンパク質をタグ付けトラッキングが可能。これを利用して、蛍光顕微鏡を用いて細胞や組織を横断プリオン様タンパク質の移動が視覚化される。 63Xまたは100X / 1.4NA油目的は、小胞構造を解決することが必要である。重要なことは、プリオンドメインは、これらのおそらく酸性小胞40内の蛍光表示されたままにするためには、mRFPとでタグ付けする必要があります。多くの場合、タグとして使用されている黄色蛍光タンパク質（YFP）、Iそれは低pH環境40,55で急冷されているため、適切ではないよ。単独のRFPタグが（ <stro...

プリオン様のタンパク質凝集体の伝播は、最近、多くの神経変性疾患に関与していることが明らかになりました。このプロトコルの目標は、線虫C.エレガンスをモデルシステムとして使用して、タンパク質の拡散を監視し、プリオン様現象を調査する方法を説明することです。

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

以下の実験の全体的な目標は、後生動物モデル生物C eleganceを使用して、PreOn様タンパク質の広がりと複雑な毒性を調べることです。これは、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用して、PreOn様タンパク質を含む小胞の細胞内および細胞内輸送を監視することによって達成されます。次に、組織特異的なフォールディングセンサーとユビキタスに発現する応力。レポーターは、細胞の自律性および非細胞の自律性が細胞の適応度に及ぼす影響を評価するために使用されます。次に、PreOn誘導毒性の新しい修飾因子を特定するために、ゲノムワイドなRNAiスクリーニングが行われます。スクリーニングは、毒性の読み出しとしてスラッシングを使用して液体培養で実行されます。最後に、画像Jのプラグインであるワームトラッカーを使用して、Cエレガンスの組み合わせの動きを定量化します。これらの方法により、PreOn様タンパク質の細胞間移動に関与する遺伝的経路とその非細胞自律毒性を解明することができます。シンクロナイズドシーエレガンスコントロールとPreOnドメイントランスジェニックライン、および10%アグロスパッドを調製した後、添付のテキストプロトコルに従って、100ナノグラムのポリスチレンビーズ3マイクロリットルと4ミリモルリマソール3マイクロリットルをアグロスパッドにピペットで注入します。プラチナワイヤーピックを使用して、プレートから溶液に所望の年齢の線虫を移し、カバースリップを使用してカバーし、細胞内レベルで線虫を画像化します。共焦点顕微鏡の顕微鏡スライドホルダーにスライドを置き、63 x または 100 x 1.4 NA のオイル対物レンズを使用します。次に、METAMORPHを開き、多次元取得を選択します。また、メインタブで、タイムラプスとランニングジャーナルのチェックボックスをオンにします。[保存]タブで、ファイルを保存するためのディレクトリフォルダを選択または作成し、ファイルに名前を割り当てます [波長]タブでは、ヨーコクワッドレッドまたは同等のMRFPイメージングの照明を使用し、露出を100〜300ミリ秒に調整し、カメラゲインを100〜300に調整します。次に、[タイム ラプス] タブで、時間間隔を 1 秒、期間を 5 分、タイム ポイントの数を 301 に設定します。ジャーナルタブの下。仕訳帳はA FCセット、Zホールド、A FC復帰はタイプセレクトスペシャルを2回選択し、初期ポイントは開始時点と終了時点を選択します。セットアップが完了したら、取得を押します この手順に続いて、粒子追跡アプリケーションなどの他の方法を使用して、ディスカスの動的特性を測定できます。プリオンドメイントランスジェニックを同期させ、線虫をタイプしながら、テキストプロトコルに従ってinger RNAIライブラリープレートをコピーした後、重複したRNAiプレートを摂氏37度および300RPMでインキュベートして、空のベクターL 4 4 4 0をコントロールとして保有するHT one 15 Eコリ菌を使用します。それを培養チューブ内で別々に増殖させ、次にマルチチャンネルピペットを使用して、65マイクロリットルの培養物を2 96のウェルの4分の1に移します。マルチチャンネルヘッドを含む自動ワークステーションを備えたウェルプレートが分注されました。10マイクロリットルの5ミリモルの希釈されたIPTGをRNAi細菌およびコントロールプレートの各ウェルに注入します。バクテリアがインキュベートしている間、3時間インキュベートする前に、それらを再密封してください。同期した野生型コントロールとトランスジェニックL-1幼虫とM-9バッファーウェルを混合し、5〜10マイクロリットルをガラス顕微鏡にピペットで移します。ワームをスライドカウントし、マイクロリットルあたりのワームの数を計算します。3時間の細菌インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、ワームに熱ストレスがかからないように室温に戻します。次に、テキストプロトコルに従って、M nineバッファーにIPTGコレステロールと抗生物質を補充します。また、適切な量のPreOnドメイントランスジェニックワーム溶液を、マイクロリットル混合物あたり15本のワームの最終濃度まで追加して、均一に分配します。次に、RNAiプレートの各ウェルと空のベクターコントロールプレートの1つのウェルに50マイクロリットルを分注します。野生型ワーム溶液を2番目のコントロールプレートに分注します。次に、すべてのプレートを密封せずに放置し、通気を可能にし、4〜5枚のプレートを積み重ねて液体培養物が蒸発しないようにし、湿らせたペーパータオルで包み、その後にアルミホイルで包みます。プレートを摂氏20度、200RPMで4日間インキュベートします。プレートには、モニター付きのコンピューターに接続されたFalcon four M 60カメラを使用して、対照処理されたPreOnドメイントランスジェニック動物と比較してスラッシングの増加を視覚的にスクリーニングします。自動化されたリキッドハンドリングワークステーションを使用してワームをR RNAiプレートに分注する主な利点は、ウェルあたりのワームの数とばらつきが大幅に減少することです。固体プレート上で運動性アッセイを実施し、候補RNAiクローンを検証するには、テキストプロトコルに従って一晩でRNAi細菌を増殖させます。次に、1ミリモルのIPTGを使用して、DS RNAの発現を3時間誘導します。各RNAi細菌クローン150マイクロリットルを使用して、事前に調製したNGMプレートを薄い層に広げて播種します。実体顕微鏡で室温で2日間乾燥させます。前述のように、同期した線虫と懸濁液の量を決定し、各実験プレートに25〜30 Lの幼虫を1匹加えます。線虫が到達するまで、線虫を摂氏20度で4日間インキュベートします。成人期の2日目に線虫の運動性を定量化するために、カメラと簡単なPCIイメージングソフトウェアの電源を入れます。カメラのアイコンをクリックすると、撮影条件の調整が有効になります。次に、イメージング条件を次のように設定します。ゲインをゼロライトモードに設定し、高速インデックスを1に、ビニングを2に設定します。次に、ライブ露出と自動露出をクリックし、顕微鏡のミラーと明るさとコントラストのダイヤルを動かして照明条件を調整します。時間をクリックし、スキャンしてフォルダとファイル名を入力し、フィールド遅延を20ミリ秒に設定し、時間で停止します 30秒。ライブを押しますview 記録するプレートの領域を選択するために。次に、ステージ上でプレートを3〜4回タップします。視野内での位置をすばやく確認し、ムービーの録画が終了したら開始を押し、画像を右クリックして[モンタージュシーケンスのエクスポート]を選択し、ムービーをCXD形式からAVIファイルにエクスポートします。運動性ビデオを分析するには、画像Jを開き、プラグインタブを選択し、次にワームトラッカーを選択してワームトラッカーバッチを選択し、ワームトラッカーのメイン入力ウィンドウで分析するすべてのファイルを含むディレクトリを選択し、ここで詳しく説明するように入力値をロードします。各パラメータの説明は、プラグインに付属の説明書に記載されています。[OK] をクリックし、移動解析の実行を許可します。最後に、結果をキュレートするために、検出されたすべてのトラックが実際の海のエレガンスからのものであることを確認し、アーティファクトを排除します。各ムービー用に作成したTXTファイルを開き、データ解析ソフトのファイルにコピーします。作成したラベルzipファイルを開き、結果のラベルTIFFを実行して、誤ったワームトラックを手動でチェックして排除します。研究室の元ポスドクであるYesper Petersonは、毒性の測定値であるCL Eleganceモチルの手動評価の代わりに、ワームトラッカーのアイデアを最初に思いつきました。ワームトラッカーを使用すると、タイムラプスイメージングを使用して、より短い時間でより多くの条件を評価しながら、ユーザーバイアスのない自動化された方法でこれらの実験を行うことができます。RFPタグ付きR2、E2は、管状小胞に蓄積し、フォールディングセンサーまたはストレスレポーターを発現するcoexによって細胞内および細胞間で輸送されるのが見られました。PreOn様タンパク質細胞と併用することで、自律的効果と非細胞的自律効果を評価することができます。筋肉細胞におけるR two E 2の発現は、腸内でのQ 44凝集の早期発症をもたらし、R two E 2がR 2 E 2の共発現に対して非細胞自律的な影響を及ぼしていることを明らかにします。SOD 3 PGFP転写酸化ストレスレポーターは、異なる組織におけるレポーターのアップレギュレーションにつながります。 PreOnドメインが全ゲノムスクリーニングに続いて非細胞的に酸化ストレス応答を誘発することを実証しています。この動画は、コンピュータ画面上の高解像度イメージングと視覚化により、プレートの4分の1を同時にスクリーニングできることを示しています。週に2回のセッションを実施すれば、6週間以内にRNAiライブラリ全体をスクリーニングすることができます。ワームトラッカーは、ここで見られるように、Cエレガンスの運動性を定量化するために使用されました。Worm Trackerは、元のビデオをバイナリ形式に変換し、各ワームにトラックが割り当てられます。処理されたビデオは、トラックを重ねて表示し、アーティファクトを手動で排除できます。[Body Lengths per second] パラメーターは、潜在的なサイズの違いに対して正規化されます。線虫。この方法では、PreOnによる毒性の35のサプレッサーが同定され、対照処理された線虫と比較して、運動性の表現型が少なくとも133%、最大256%に増加しました。ワームトラッカーをリースする際には、取得したワームトラックを手動で確認することを覚えておくことが重要です。このソフトウェアはワームの識別に優れていますが、背景が誤って動物と識別されることがあります。したがって、ワームトラッカーを実行した後は、ビデオを確認することを忘れないでください。これらの方法は、特定の疾患関連タンパク質が細胞から細胞へと広がることができるかどうか、同様の可能性、または細胞間伝播とこれらのタンパク質の複雑な毒性との間に関連があるかどうかなど、神経変性疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。キッズ。

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生物学

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

このビデオは、赤色蛍光タンパク質でタグ付けされたプリオン様タンパク質を発現するC.エレガンスのin...

トランスジェニック線虫におけるプリオン様タンパク質の細胞間拡散をモニタリングするためのタイムラプスイメージング

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A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

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線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex...

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

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カエノハブディティス・エレガンスにおける年齢関連神経変性疾患のモデル化

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ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

Caenorhabditisエレガンスにおける自動包接計数を用いた生体内のタンパク質凝集動態のモニタリング

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マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

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解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

学ぶプリオン様タンパク質の拡散と毒性をC. elegansモデルで調査する手法。蛍光顕微鏡とRNAiスクリーニングを用いて神経変性疾患の治療標的を探索します。

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査

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