SDF-1α-キトサン硫酸デキストランナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

次の実験の全体的な目標は、SD F1 Alpha Chiasおよびデキストラン硫酸ナノ粒子を調製し、特性評価することです。ナノ粒子の調製は、まず幹細胞のホーミング因子である間質細胞由来の因子1αまたはS df one αをデキストラン硫酸と混合して、負に帯電した糖鎖に結合させることによって達成されます。第2のステップとして、正に帯電した糖鎖を混合物に添加し、デキストラン硫酸と多分子電解質複合体を形成します。

次に、亜鉛架橋との錯体を安定化するために、硫酸亜鉛を添加します。得られた粒子は、負に帯電したシェルに囲まれた密集したコアを有する。続いて、粒子のサイズとゼータ電位、ならびにナノ粒子中のS df one αの含有量と活性について測定されます SDF one alpha glycanナノ粒子の主な利点は、組み込まれたSDF one alphaが粒子から放出されることなく完全に活性であることです。

したがって、粒子は幹細胞治療における静止ヘルミンシグナルとして機能するのに役立つ可能性があります。まず、テキストプロトコールに記載されているようにストック溶液を調製し、0.22ミクロンのフィルターメンブレンで滅菌します。調製した溶液中のエンドトキシンレベルを、ulu amoeba cyte lysate gel clot assayで評価します。

レベルが0.06エンドトキシン単位/ミリリットル未満であることを確認してください。次に、0.18ミリリットルの超純水で、マグネチックスターバーを含む1.5ミリリットルのガラスバイアルに入れます。攪拌速度を800RPMに設定し、0.1ミリリットルの1%デキストラン硫酸塩を加えて2分後に攪拌します。

0.08ミリグラムのSD F1 alphaを加え、20分間攪拌します。ドロップワイズに0.33ミリリットルの0.1%tizenを加え、5分間攪拌します。攪拌速度を最大に変更し、気密シリンジで0.1ミリリットルの硫酸亜鉛をゆっくりと加えます。

攪拌速度を800RPMに戻し、30分間攪拌します。次に、0.4ミリリットルの15%マンニトールを加え、5分後に攪拌します。反応混合物を1.5ミリリットルのフージチューブに移し、16, 000Gsおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を吸引し、ピペットを使用して最後の液体を取り除きます。0.2ミリリットルの5%マンニトールをゆっくりと加え、0.5ミリリットルの29ゲージニードルシリンジでペレットを懸濁します。次に、遠心分離する前に5%マニトールを1ミリリットル追加します。

16, 000 GSで15分間の2回目。Resus懸濁遠心分離プロセスを繰り返した後、上清を吸引し、ペレットを0.2ミリリットルの5%マンニトールに再懸濁します。粒子径とゼータ電位は、それぞれ動的光散乱と電気泳動光散乱によって分析されます。

まず、動的光散乱による粒子サイズ測定のパラメータを含むSOPリストから操作手順を選択します。テキストプロトコルに記載されているように、SD F1アルファ粒子サンプルを水で希釈します。次に、100マイクロリットルのサンプルをEinor Q Vetなどの使い捨てUV Q Vetにロードします。

Q vetをセルホルダーに挿入し、強度調整が最適に達するのを待ってから、データ取得を開始します。測定が完了したら、直径とポリ分散指数の積算結果を記録します。4回の繰り返し読み取りのそれぞれから得られた結果を平均化し、電気泳動光散乱によるゼータ電位の測定の標準偏差を計算します。

10倍に希釈した粒子サンプル500マイクロリットルをフローセルにロードします。テキストプロトコルにリストされている測定のパラメータを含むZeta電位SOPリストから操作手順を選択します。ゼータ電位の結果を記録します。

次に、5つの繰り返し読み取りのそれぞれから得られた結果を平均化し、標準偏差を計算します。希釈した遊離粒子結合型SD F1 αのサンプルを、100°Cのlalyサンプルバッファーで10分間加熱します。2分間室温にサンプルを冷却した後、粒子を完全に解離するために、10分間の加熱中にサンプルを2回渦巻き、遠心分離機は0.5〜1分間10、000Gsを持っていました。

この時点で、サンプル溶液は透明で、目に見える沈殿物は存在しないはずです。次に、ウェルあたり10マイクロリットルのサンプルを4〜20%のESAL硫酸ナトリウムまたはSDSゲルにロードします。200ボルトで20分間電気泳動を行い、その後、クマシブルータンパク質染色でゲルを染色します。

分子イメージャーとデンシトメトリー解析ソフトウェアを使用して、SD F1 alphaのタンパク質バンド密度を調べます。遊離 SDF one alpha 標準で構築された標準曲線に対して粒子中の S DF 1 α の量を計算し、in vitro 放出アッセイ SD F1 α 糖鎖粒子とカルシウムとマグネシウムを含まないドコスリン酸緩衝生理食塩水、または DPBS を 1 対 1 の比率で混合します。粒子懸濁液を1.5ミリリットルチューブ内の0.05ミリリットルアリコートに分割します。

サンプルをチューブの底にロードします。気泡の混入や液体の表面の乱れを避けてください。チューブの上部をパラフォームで密封します。

次に、回転するマイクロチューブミキサーでチューブを摂氏37度で回転させます。指定された時間にチューブからアリコートを取り出し、遠心分離後すぐにサンプルを16, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清とペレットを分離します。

次に、ペレットを0.05ミリリットルのDPBSで再構成します。すべてのサンプルを採取したら、SDSゲル上の上清とペレットを調べます。前回と同様に、このアッセイはS dfの走化性活性を測定します。

S df one alphaとその受容体との1つのα相互作用は、細胞のSD F1α勾配への移動を引き起こします。まず、希釈フリーまたは粒子結合した形態のSD F1 αを、移行バッファーを用いて、テキストプロトコルに記載されている最終濃度まで3倍に段階希釈します。希釈したSD F1 α溶液0.6ミリリットルを24ウェルプレートのウェルに加え、ネガティブコントロールを行います。

移行バッファーについても同じことを行い、その後、入力セル制御用のウェルに0.57ミリリットルの移行バッファーを追加します。プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、下部ウェルの上にトランズウェルなどの透過性細胞培養インサートを配置し、0.1ミリリットルのジャークハット細胞をトランズウェルインサートにロードします。

次に、0.03ミリリットルのセルを直接入力セルコントロールにロードします。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターで2時間十分にインキュベートします。インキュベーション後、細胞培養インサートを取り出します。

下部ウェルに移動した細胞を4ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。フローサイトメーターで移動した細胞をカウントします。最後に、ネガティブコントロールの数値を減算した後の入力セル番号のパーセンテージとして移行を計算します。

SDのF1αデキストラン硫酸オザン粒子径測定の解析です。CUMUL の結果は、粒子の流体力学的直径が 671 ナノメートルで、ポリ分散度が 0.24 であることを示しています。このスクリーンショットは、SD F1 alpha DExT 鎖硫酸オザン粒子のゼータ電位の 5 つの繰り返し測定のうちの 1 つを示しています。

ゼータ電位はマイナス24.7ミリボルトです。S df one alpha デキストラン硫酸オザン粒子中の S df one alpha の量は、SDS ゲル電気泳動によって推定されます。ここに示されているのは、SD F1 α 標準物質であるデキストラン硫酸カイザン制御ナノ粒子と SD F1 α デキストラン硫酸カイザンナノ粒子のサンプルをロードしたクマシ染色 SDS ゲルです。

標準曲線は、SD F1 Alpha Standardバンドの密度分析から構築され、標準曲線から計算すると、SDF one alphaナノ粒子サンプル中のS DF one alpha濃度は0.03ミリグラム/ミリグラムであることがわかります。ナノ粒子からのS DF one αのin vitro放出速度を決定するために、スーパーナト中に放出されたS DF one αの量とペレット中の粒子結合sdf one αの量を、SDSゲルのkumasi染色とそれに続くサイトメトリー分析によって決定した。粒子結合したS-DF1αの活性をマイグレーションアッセイで測定し、それと比較して、ここに示すように遊離SDF1αとします。

粒子結合したSDF one alphaは、測定されたすべての濃度で、遊離s DF one alphaと同じ程度の移動を誘発した。この手順を試みる際には、糖鎖タンパク質粒子の組成が変更される可能性があることを覚えておくことが重要です。特定の用途に応じて、他のタンパク質を組み込んだり、異なる配合を使用して粒子サイズを変えたりすることができます。

このビデオでは、ナノ粒子の収集と、組み込まれたSDF one alphaの機能解析の準備における基本的な技術を実演していただければ幸