Name: 現代の木リング研究の技術的な観点 - Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ樹木年輪の高精度解剖学的解析法。非ニュートン流体を用いたマイクロトーム切片と二重染色により、材質細胞の詳細な顕微鏡観察と自動化された細胞解析を可能にする革新的なサンプリング技術を解説する。

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著者は、サンプル調製の進行を保証するために必要な装置を構築するためのSandro Luchinetti氏(Schenkung Dapples、チューリッヒ)の努力に感謝したいと思います。

1.サンプリング技術<ol><li>コアサンプリング<ol><li>サンプリングの木の茎のために、それぞれがその成長発達を分析するために、幹から増分コアラーを使用して、少なくとも2つのコアを抽出する。一般的な気候再構成はコアが斜面に平行に取るために、 例えば 、研究課題上のサンプリングの位置を変更します。熱帯種で作業する場合、少なくとも3つ以上のコアを取る。 </li><li>先鋭化増分コアラ（直径5、10または12ミリメートル）を使用し、ステムの成長軸に垂直なコアラを置く。 注：ツリーにそれを掘削する際、その回転以外のコアラの動きを避けるために、プッシャーを使用して、コアラの制御され、安定した位置を持っている。幹に穴髄へとを介してすべての方法。コア非常に密度の高い木（ すなわち 、熱帯種）に、Diospyrusのebenumなどのコアにも密な森の中に許可する増分コアのアダプター（黒檀）で特別な再構成チェーンソー体を使用しています。&lt;/ LI&gt; <li>抽出器を使用し、木から生じるコアを取り除く。コアラを切り、茎から取り外します。 </li><li>その後コア上に直接配置されているテープ、上の書き込みによってソフト鉛筆を使用して抽出コアに特定のIDを追加します。ステムの反​​対側に手順を繰り返します。 </li><li>ツリーの2つのサンプルは、任意の損傷を防ぐためにプラスチックや紙管または特殊な箱に保管してください。 注：これらは、成形からコアを防ぐため、紙のストローは、熱帯の環境では特に有益である。 </li><li>最後に、木製の支持梁上のコア（繊維方向直立）をマウント。冷たい水に強い木材接着剤を使用し、それらを乾燥させます。 注：研究の目的は、さらなる化学、同位体または密度分析が含まれている場合は、木製の支持体上のコアを取付けないでください。これらの目的のために、オープンケーブル導管または片面段ボードでコアを固定します。 </li></ol></li><li>マイクロコアサンプリング<ol><li>特殊なパンチングデバイスを使用して、または2ミリメートルの開口部と針。樹皮の厚さに応じて、樹皮の必要な部分を除去するためにノミを使用しています。 </li><li>上記のように茎の成長軸に垂直なデバイスを配置し、深さ約2​​cmまで茎の木部に浸透するハンマーを使用しています。 </li><li>ツール内部の結​​果のマイクロコアを破壊し、ステムから削除するには、針を回します。マイクロ遠心バイアルにマイクロコアを保存し、それらにラベルを付ける。 </li></ol></li><li>ディスクのサンプリング<ol><li>特殊なケースでは（特に熱帯で）、 例えば切り株や倒木や、可能な限りのサンプリング時に、チェーンソーでディスク（成長軸に垂直な断面）を取る。単純にディスクにラベルを付け、さらなる分析まで保管してください。 注：このサンプリング手順は、最も一般的に増分corersの使用を許可していないすべてのドライ死んで、歴史的、考古学的およびサブ化石材料としてだけでなく、非常に密度の高い広葉樹のために適用されます。 </li></ol&gt; </li></ol> 2.試料の調製<ol><li>サンディングディスク<ol><li>サンディングマシンにディスクを置き、120、220、300グリット続いて、80グリットのサンドペーパーから開始し、次第に細かい砥粒の配列を用いて表面を研削する。 400グリットを有する最終研磨は、ほとんどの針葉樹のために十分である。広葉樹、特に熱帯種のために、成長リングの境界を区別するために1200にサンディンググリッツを使い切る。 </li></ol></li><li>コア上平面切断面<ol><li>彼らの全体の範囲にわたってコア上の平面の表面をカットする可能新たに開発したコアミクロトームのコアホルダーの増加コアを固定してください。 注：ミクロトームのナイフに直角である直立試料の繊維方向を持つようにホルダー内のコアの向きを修正してください。 </li><li>それは少しブレードに接触するまでコアを持ち上げます。 CUにコアの範囲を越えたボールベアリングのガイダンスに固定されているブレードを、プル上部の最初の部分をオフトン。 </li><li> 、コアの後ろにナイフを押し戻すコア約10μmで試料ホルダーを持ち上げ、切断手順を繰り返します。コアの直径の約3分の1は、連続平面になり伐採されるまで、これを行います。 </li></ol></li><li>トウモロコシデンプ​​ン溶液を添加することによって、マイクロ切片を調製した。 <ol><li>解剖学的構造の詳細な画像解析のために、固定コアまたは他のサンプルは、ミクロトームのホルダーでディスクから分離する。サンプルの上部の縁に新たに開発されたスレッジミクロトームのボールベアリング指導によって導かミクロトーム刃を、置き、その上に引き出します。 </li><li>約20から30μmでサンプルを持ち上げて、もう一度サンプル上のブレードを引っ張ってブレードを押し戻す。サンプルの上に連続面が作成されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>コー​​ンスターチ溶液（コーンスターチ10gを、8mlの水、および100％のグリセロ7gので得られた表面を覆う一般的なブラシ付きL）。 NOTE：デンプン粒は、薄切片のその後の切断のための構造を安定化するために、サンプルの気泡を埋める。 </li><li> 、15μmでサンプルを持ち上げ、試料の表面にブラシを配置し、（ブラシ下）薄い部分を切断し始めてサンプルに向かってゆっくりと刃を引っ張る。カットしながら、結果のセクションでは、ブラシによって導かブレード上を摺動する。 </li><li>セクション全体が切断されると、ブラシと水とブレードからマイクロセクションを削除（摩擦を低減するために）、さ​​らなる製造のためのガラススライド上のセクションを配置。乾燥するのを防ぐために、グリセロールの少量（33％= 100％グリセロールの一部と水の2つの部分）を使用して、それらをカバー。 </li></ol></li></ol> 3.マイクロスライドの準備<ol><li>恒久的なスライドの以下の調製のために、第1ピペットと水でマイクロセクションから離れてグリセロールを洗う。 </li><li>ぬれたSEをカバーリグニンと非木質化を区別するサフラニン（サフラニン粉末+ 100mlの水を1g）とAstrablue（100％酢酸+水100mlのアストラ青色粉末+ 2mlを0.5g）を数滴とction構造だけでなく、後続の画像解析のためのコントラストを向上させる。 </li><li>色素によってカバーされ、5分間のセクション残りをしましょう​​と、再びピペットと水で洗い流す。 </li><li>できるだけ早く過度色素が除去されるように、希釈し、75％、96％の配列、最後に100％エタノールでそれらを洗浄することにより、ピペットのセクションを脱水する。 </li><li>使用ピペット全体ではなく、脱水処理には約2〜3分の処理時間を短縮する浴中に試料を配置するスライドガラスでサンプルをリンスする。 注：エタノールで脱水が破損脆弱なサンプルを防ぎます。 </li><li>その後、100％のキシロールでセクションをすすぐ。 注：キシレンは発癌性であり、それを使用する際に換気が実験室で必須である。その他製品が置き換えキシロールに存在するが、潜在的な再分析のために、より長い期間（数年、数十年）にわたってサンプルを記憶する意図がある場合には、カナダバルサム（ステップ3.5.2）が時間の経過とともに色を変化させずに透明なままでのみ包埋剤である。残念ながら、カナダバルサムはキシロールと組み合わせて使用​​する必要があります。 </li><li>それは十分に脱水ない限りキシロールは（白っぽい）乳白色を回すように、脱水処理を繰り返します。 </li><li>とすぐにキシロールを明確にとどまるように、100パーセントカナダバルサムの低下にセクションをカバーし、セクションの少なくとも大きさのカバーガラスでそれをカバーしています。 注：静かにカバーガラスを下に押して、気泡を除去することに注意してください。 </li><li>耐熱性プラスチックの2のストリップ間に生じるマイクロスライドを置き、金属板の上に置きます。次の乾燥工程中に平坦部を維持するためにそれを下に押してスライドの上に（ 例えば 、磁石）の重量を配置します。 </li><li>オーブン中でスライドを配置する約12時間60℃である。 12時間後、オーブンからスライドを取るし、それらをRT（約20℃）に冷却できるように棚の上に置きます。ときにクール、重量及びプラスチックストリップを削除し、余剰カナダバルサムを削除するにはかみそりの刃を使用してスライドをクリーニングします。 </li></ol> 4.セルの内容を可視化<ol><li> Nawashin液25を準備します。 <ol><li>クロム酸5gを、96％酢酸50mlおよび脱イオン水320mlの溶液（A）を調製する。の脱イオン水175ミリリットルとホルマリン200mlで別の溶液（B）を準備します。 </li><li> Nawashinソリューションを作成するために1：1の比で溶液Aと溶液Bを混合する。 </li></ol></li><li>セルの内容を視覚化するために、セル内のすべての分解プロセスを停止し、10分間Nawashin溶液で試料を固定する。 注：;存在oを固定、細胞寿命（電池寿命=核存在/核不在の推定を可能にする細胞核を保持核のR不在）は、細胞が生きているか死んでいるかどうかを示します。 </li><li>固定後、完全にサフラニンアストラブルーでそれらを染色する前に、さらにピクリン、アニリンブルー（1部飽和水溶性アニリン10％ピクリン酸4部+青）でそれらを染色しNawashin溶液を除去し、水で切片を洗浄。 </li><li>慎重に染色処理を加速するために約80℃（沸点以下のいずれの場合において）に試料を加熱する。サンプルの脱水と埋め込むためのプロトコルは3.4から3.8の手順に従ってください。 </li></ol> 5.解剖学的特徴のデジタル画像を準備する<ol><li>血管解析のためにコア表面のデジタル画像を作成します。 <ol><li>コアミクロトームを用いてコア表面平面を切断し、単にフェルトマーカーを用いて得られた表面の黒色を染色。 </li><li>できるだけ早く染料が乾燥するように、白亜、コアの表面をこする。単に上のチョークをこすって細胞内のチョークを押す指を用いて表面。また、この手順によって余剰チョークを削除します。 注：細胞壁が黒色であり、血管の内腔の部分が白である結果。このコントラストは、自動画像解析のための前提条件である。 </li><li>デジタルカメラを備えた双眼顕微鏡下に準備されたコアを配置します。わずか（約10％）の重複画像を全面が捕捉されるまで、コアの一方の側に起動シーケンスを取る。コア表面の完全なイメージを作成するために、単一の画像をステッチ。 </li></ol></li><li>マイクロスライドからデジタル画像を作成して<ol><li>顕微鏡下に洗浄マイクロスライドを置き、全体セクションから重複した画像を取る。 </li><li> 40Xおよび1,000倍の倍率の範囲、分析される構造に応じて特定の倍率を規定する。 </li><li>セクションの1の完全な画像を作成するために、単一の画像をステッチ。綴じ処理中に可能な歪みを避けるために、「使用;計画「顕微鏡の対物レンズを-type。 </li></ol></li></ol> 6.解剖学的特徴の定量化<ol><li>画像解析ツールROXAS18または類似のソフトウェアを使用して細胞やリングの境界線を検出するために、メートル単位での定量的な結果を得るために、マイクロセクション及び関連する空間キャリブレーションの完全な画像をロードします。同じ倍率で撮影マイクロメートルのステージ画像のスケールの間のピクセル数を測定し、メートル法単位（ 例えば 1000μm以下）で、スケールの間隔によって得られた値で割ることによって空間較正を計算する。 </li><li> （ソフトウェアで提供される）提供されたリストの分析の自動一部を開始する前に、適切な設定から選択します。 注：構成は、例えば、考慮のサンプルの染色の色、検出されるべき細胞のサイズおよび形状の範囲をとり、プログラム設定を以前に最適化されたセットである。こうして仕立ての構成異なる種と画質のための最適な認識結果を生成することを可能にする。 <ol><li>必要に応じて、試料中に回避するために含めたり除外されるイメージ内のような領域の使用量などのさらなるオプション、 例えば 、空白の画像の余白やクラックを選択します。 </li></ol></li><li>分析ボタンを押して分析を開始します。選択した場合、多角形、長方形や円ツールを使用して包含または除外される画像内の領域を定義。次の自動分析は、いくつかの画像の欠陥（ 例えば 、乏しいコントラスト）を補正し、画像の品質に基づいて、コントラストを向上させる柔軟なアルゴリズムを使用する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

dendroecological研究への木材解剖学の成功と持続可能な統合の課題は離れてマニホールド分析的な問題から、主に技術的な側面に、である。これらの課題は、原則として、サンプリングから高品質マイクロセクションとそれらのその後の分析19を作成することへのアプローチの範囲。 一見したところ、コアあるいはディスクのサンプリングは長年にわたり知られている簡単な手順である。間違って行うことができ、サンプリングの小さな不正確さがその後の調製および分析の段階で重大な問題が発生する可能性が多くのものがあります。研究の目的は、リング幅の測定に限定されている場合は、そのような正確に垂直ステム軸に、または不完全尖らコアラを使用していないコアリングのような小さな不正確さが問題になりません。サンプルの顕微鏡分析を目指ししかし、誤ったサンプリング方向は、光学歪みが発生する可能性がありコア内のマイクロクラックで鈍いcorersの結果を用いながら、細胞壁、。これらのコアのマイクロセクションをカットしようとしたときにその結果、薄い部分はちょうどばらばらなく、効率的な製造は、もはや保証されている。同じことは、マイクロコアサンプリングについても同様です。パンチャーが幹木材に打ち込まれたとき鈍い先端は高圧になります。その結果形成層層は圧縮される。形成層細胞（ 図5）は、結果的に圧迫され、分析することができない。 ディスクのサンプリングは確かに環境の変化にそれらを関連付けるために、成長の変化を分析する最良の戦略である。残念ながら、さらなる分析のためにサンプリングされることを意図し、すべての木からディスクを取るために、単純に不可能です。それにもかかわらず、特に熱帯年輪の場合は、茎ディスクの一定量の増分コアとの組み合わせで必要とされる。ディスクはリングの境界を定義するベースとして使用され、このためにboundarをサポートするために増分コア12,27,28の分析に基づいて定義新設。 カッティング対サンディングの長所と短所は、頻繁に1,11,21を議論している。それは上記の言及されたように、最適な手順は、常に研究課題に依存し、分析されるべきパラメータ（巨視的または微視的）。同位体または化学分析は、さらに作業工程に投影した場合には、試料全体にわたって細胞内腔に充填することができることをサンディングすることによって作成された摩耗粉が、慎重に真空引きまたは圧力空気により除去することが最も重要である。 すべての微視的にはさらなる分析のためのサンプルを調製する最も適切な方法を分析するためのマイクロセクションをカットするです。まず、セ​​クションはその後、さらなる分析のための潜在的な汚染なしに保つことができ、サンプルを、遮断される。第二のセクションは、単一の格子パラメータを高分解能測定を可能にする。さらに、時間のかかる埋め込みを回避細胞を安定化するためにコーンスターチ液26を用いて、技術は、マイクロセクショニングの大きな利点である。 マイクロ切片の欠点は、まだ長い準備時間になり限られたサンプルサイズです。実際の時系列は、何世紀にも、あるいは数千年以上の時間に戻って分析するために、さらに、既存の切断装置17,19だけでなく、画像処理と解析18を開発する必要がある。この方向への最初のステップは、最初にコア（ 図1）上に平面の表面を切断するために製造され、コア·ミクロトーム21の開発である。最近の試 ​​験は、この装置（ 図1）を使用して、全体のコアの微小部分を切断する能力を明らかにした。 高品質マイクロセクションでは、効果的な画像解析のための基本原理を提供する。顕微鏡下の画像を取ることは一般的な手順19であるが、それらの効果的な分析はまだ必要な作業ですさらに17を開発することができる。すべての既存の画像解析システムは半自動である、 すなわち、それらは多かれ少なかれ強く技術者によって制御される必要がある。多くの場合、画像を修正する必要がある、あるいは新しい画像は、画像内のセル壁の厚さを変更することなく、ソフトウェアによる構造のよりよい登録のコントラストを強調するために行われなければならない。 このようROXAS 18、WinCellまたはImageJの29固有のスクリプトのような特殊な画像解析ツールは、細胞数、細胞寸法、セル壁厚と年輪内のセルの位置などの基本的な解剖学的データを提供することができる。 dendroecologicalコンテキストに関連する多くの追加の解剖学的メトリックは、最大の導管のサイズ、導管のサイズ分布は、早材または導管の最初の行のサイズは、（光学）、木材密度、イントラ年間、これらの基本的な測定値から計算することができる導管のサイズと細胞壁のプロファイル厚み、及び導管（孤独、倍数など ）のパターンをグループ化。 ソフトウェアROXAS 18を使用して、管路内腔（ すなわち 、水の導電セル）と年輪の境界線の輪郭が自動的に認識され、視覚的に、元の画像の上にオーバーレイとして表示されます。導管用の検出アルゴリズムは、色、サイズ、形状情報、各導管のローカルコンテキスト上のリングの境界の検出アルゴリズムに基づいている。ツールボックスは、私たちは手動で直接、 すなわち 、オーバーレイ機能を編集、 ​​削除、追加およびリングの境界線を変更し、導管が概説することにより、これらの結果を改善することができます。編集後、細胞壁の厚さ（針葉樹）を含む最終的なデータ出力には、自動的に生成され、スプレッドシートに保存された。完全に自動化されたシステムではなくても、比較的単純な構造を示した針葉樹のために、現在利用可能ではありませんが、これは今後の開発のための目標です。これは強く府を支持する時系列の木材解剖学的パラメータのLLの統合分析。

木、ならびに低木、ドワーフ低木、さらにハーブは、それらの環境の変化に関連するマニホールド応答パターンを示す。これらのパターンは、半ば、19世紀以来、植物学と植物生理学の対象となっている。当時、木本植物の研究は主に木や生態学的文脈1における年輪の構造と変動の記述分析に焦点を当てた。アンドリュー·エリコットダグラスは年輪研究2のクロスデート技術を発明したときは、この生態学的コンテキストは、多かれ少なかれ正確に考古学に木製の調査結果を日付に新しい能力によって抑制された。初めてのクロスのデートは、暦年に年輪の正確な年代測定を可能にし、今までその応用1のすべてのフィールドで年輪研究のバックボーンとしてみなされている。 並行して、19世紀末以来、木材解剖学は、関連する重要な研究規律へと進化自然と応用科学3の他の多くの分野にD。二つの主要なドメインが確立されている：木材技術、生理学、病理学、および生態3,5に関連する考古学4に木材を識別するための基礎となる体系的な木材解剖学、および適用される木材解剖を、。 年輪研究では、dendroecologyは、今日ではそのような地形プロセス（dendrogeomorphology）、気温と降水量の再構成（dendroclimatology）、水位の変化（dendrohydrology）あるいは氷河の変動（のような環境の研究に焦点を当てた年輪関連の研究を網羅するトピックとして定義されているdendroglaciology）6。この定義が示すように、年輪の分析は、（i）のリング幅7,8、木材密度9年間の変動を分析することにより、過去の気象条件として出会い、環境のプロセスを再構築の分野においてますます重要になって、または10同位体、またはしている（ii）のトン彼は地形のプロセス11の間隔を再発。これらのリング幅の変動について非常に詳細な研究とその同位体含量は、リングの解剖学的構造を研究するために、 すなわち 、より詳細にリングを分析する必要性を実証する。しかし、環境の変化に関連した年輪内の木材解剖学的特徴の詳細な研究は、12,13はまれである。これらの顕微鏡的特徴が14知られているが、彼 ​​らはめったにdendroecological研究に顕微鏡レベルで適用されていない。さらに、正確な年代測定の目的のために不可欠な自然に成長した樹木、これらの成長反応の正確なタイミングは、めったに最近15文書化されていません。 地球温暖化16の影響に関しては、既存および新規技術の開発の改善は、特に気候への影響の研究11の観点から、記録し、必要とされる過去と継続的な環境のプロセスを定量化する。生態学的にベースの木材解剖17に伝統的な木材解剖学的研究を展開し、デンドロ科学者は新しいパラメータを分析し、木本植物18の解剖学上の特定の環境要因の短期的および長期的な効果を理解するための新しい方法論を開発することができます。特定のドライバ（ 例えば 、機械的な力、気候変動）に関連する個々の環内の異なるセルパラメータの変動についての詳細な知識は、ツリーリング状に変動性を理解するための基本的な要件である。一般的なリング幅の測定値と比較して、木材解剖学的バリエーションを特定する労力と多くの時間を必要とする、より複雑かつ広大な製造技術を必要とする。試料を切断、染色、および埋め込 ​​みの詳細な手順はマニホールドであり、常に研究19の目的に依存している。 数、サイズや競合製品のための針葉樹あるいは構造におけるリング幅の巨視的分析について広葉樹における血管のibutionは、試料の表面は、一般に微細な研磨紙や特殊研削盤20を用いて研磨される。この方法の欠点は、さらに半自動顕微鏡分析21を防ぎほこりで個々の細胞の充填である。試料表面を剃刀の刃または他の鋭利なナイフを用いて切断された場合、巨視的試料調製のための最良の結果が達成される。 小さなサンプルのための一方で、かみそりの刃は、最適なツールです。コアなど大きなサンプルはコアの全体範囲にわたって平面表面の切断を必要とする。サンディングとは対照的に、細胞は、連続的な画像解析のためのさらなる調製を可能に塵埃が充填されていない。さらに、開放セルの内腔、正しくカット細胞壁、及びサンプル全体の平面は、コアの全体の程度に高周波デンシ22の適用を可能にする。画像は、試料の表面（細胞を分析するために壁）濃インクを用いて染色することができ、オープンセル内腔は、その後、細胞壁および管腔面積19,23の間のコントラストを高めるために白いチョークを充填することができる。このかなり単純な手法は、血管サイズ測定のためのより大きな細胞構造の基本的な巨視的な評価が可能になります。 平面表面を切断するためのこれらの技術は、巨視的な分析のために十分である。詳細な木材解剖学的（ すなわち、微視的）分析のために、透過光顕微鏡デンドロ科学で適用最も一般的な方法である。木部細胞は、細胞型決定、細胞分裂、細胞分化、およびプログラム細胞死24を包含する複雑な過程を経て分化する。これらのプロセスは、細胞の解剖学的特性を決定発生するタイミングや速度ので、これらのプロセスに影響を与える環境条件は、環構造内の解剖学的偏差を生成することができる。これらの分析のための重要な前提条件として、sは、マイクロセクションミクロトーム19を用いて調製する必要がある。セクショニングのための試料を調製する際に、仮道管または繊維方向の視認性が重要である。画像は19を分析するために、必要に応じて、この技術は、高品質のセクションを容易にしているためミクロトームをスライドさせる駆動手の使用はマイクロセクションをカットすることをお勧めします。特定の研究の特定の目的に依存して、マイクロセクションは、セルの長手方向に垂直または平行に切断される。これらのセクションは、次に、顕微鏡の下に撮影し、セルの寸法は、特殊なイメージは、ソフトウェアを解析使用して測定される。 最近まで、マイクロ切片を作製する能力は小さなサンプルサイズのみ（xは1センチメートル約1cm）に限られていた。これは、特定の年の障害のような単一のイベントを分析するために許容可能であるが、この技術は、環境の再構成に必要な拡張時系列分析を許可していません。この取り組みは、実現することができます、新しい効率的かつ経済的な準備手順及び分析技術の開発を通じて、D。近年では、スイスのスイス連邦研究所のWSLのツリーリングラボのメンバーは、このトピックに関する集中的な作業を開始している。結果として、新しいデバイスおよび分析技術は、環境研究テーマの広い範囲に木材解剖学的特徴を統合するという考えをサポートするために開発されてきた。

<table><tbody><tr><td>インクリメントコアラー</td><td></td><td></td><td>http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&アイテムID = 88&lang=en</td></tr><tr><td>Core-Microtome</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>実験室用ミクロトーム</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>Trephor micro coreer</td><td></td><td></td><td>http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp</td></tr><tr><td>ナワシン溶液</td><td></td><td></td><td>1% クロム酸 10 部、4 部 4%ホルムアルデヒドと酢酸1部</td></tr><tr><td>ピクリック-アニリンブルー</td><td></td><td></td><td>95%エタノールに溶解した飽和アニリンブルー1部とトリニトロフェノール4部</td></tr><tr><td>サフラニン</td><td></td><td></td><td>経験式(ヒル表記) C20H19ClN4&nbsp;</td></tr><tr><td>アストラブルー</td><td></td><td></td><td>経験式(ヒル表記) C47H52CuN14O6S3&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td>線式 CH3CH2OH&nbsp;</td></tr><tr><td>キシロール(キシレン)</td><td></td><td></td><td>線式 C6H4(CH3)2&nbsp;</td></tr><tr>カナダ 顕微鏡用<td>バルサム</td><td></td><td></td><td>埋め込みソリューション</td></tr><tr><td>Roxas Software</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://imagej.nih.gov/ij/ WinCell</td><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

現代の木リング研究の技術的な観点 -  dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Dendroecological研究は、単一の木、さらには全体の森林生態系は、環境変化に対応し、最終的にそのような変更を再構築する方法を理解するために木の年輪に格納された情報を使用しています。これは、時間を遡って、成長の変化を分析し、（例えば）温度記録を、様々な植物固有のパラメータを相関させることによって行われる。これらの分析における木材解剖学的パラメータを統合することさえ、イントラ年次解像度まで、再構成を強化する。そこで我々は、サンプルの準備、および一般的な巨視的な分析のためだけでなく、その後の顕微鏡分析のための木製の試料を分析する方法についてのプロトコルを提示する。さらに我々は、時系列分析をサポートするために、共通の小規模および大規模な標本から生成されたデジタル画像を分析するための潜在的な解決策を紹介する。プロトコルは、現在使用できるように基本的な手順を示す。これ以外にも、既存の技術の改善、および新規トンの開発のための継続的な必要性があるechniques、記録し、過去と継続的な環境のプロセスを定量化する。伝統的な木製の解剖学的研究では、この研究分野の生態学的情報を含むように拡張される必要がある。これは、新しいパラメータを分析し、木本植物の解剖学上の特定の環境要因の短期および長期の影響を理解するための新しい方法論を開発していきデンドロ研究者をサポートする。

すべてのdendroecological分析は正確なサンプルに依存して、どんなにディスク、コア、またはマイクロコアがとられている場合。このために、デバイスは、木製のサンプル内のマイクロクラックを避けるために（正確にシャープに）完全な形にしておく必要があります。インクリメントコア上表面を調製する場合、コアミクロトームの使用が必須である。さらに、画像のコントラストを向上させるために処理することができるオープンセルを有する能力を分析し、血管径の測定（ 図1）は 、時系列に解剖学的構造の適応に向けた最初の重要なステップで分析される。時には広葉樹のサンプルの密度はミクロトームの使用を防止します。その場合には、圧縮機や真空との適切な研磨と血管からの過度のおがくずのその後の除去は最良の選択肢である。 早材及び針葉樹における晩材仮道管、より小さいセル構造のより詳細な分析のために、高品質のマイクロセクションが必要とされている。ここでは、potentiこのような二次細胞壁は、一次壁から剥離されるものとしてらアーチファクトが（ 図2）を回避する必要がある。これらのアーティファクトは、デジタル画像に発生した場合、セル寸法の自動分析は、もはや不可能である。アーティファクトは、手動時間がかかり、セル寸法の不正確な測定値のほとんどの場合の結果であり、これを補正する必要がある。最小限に（ 図2）26 のアーチファクトの発生を低減しつつ、サンプルの上に非ニュートン流体の単純なアプリケーション、 すなわち 、トウモロコシデンプン溶液は、構造の安定性をサポートする。熱帯種を含むすべての木製サンプルに適しコーンスターチ、このアプリケーションは、冗長な切断前の試料と、埋め込み手順の適用を行う。 マイクロセクションでは、年輪のより安全な決定を可能にする。これは、特に彼らの自然の限界、 すなわち上に成長針葉樹の場合である&lt;/ em&gt;の、高山地域でツリーラインで。非常に狭い環は、巨視的（ 図3）を検出するために頻繁に困難である。極端な場合には、リングが早材細胞、および細胞壁肥厚（共通の晩材細胞とは対照的に）を欠いている扁平晩材細胞、一列の1つまたは2つの行で構成されている。マイクロセクションを使用する場合はこのために、彼らは良いかさえのみ表示されます。また、密度の変動は、特に地中海熱帯（ 図3）に年輪の検出を単純化する、より明確環境界から区別することができる。 40X以上の倍率で画像を分析する場合、単一のセルが表示され、それらの細胞壁の厚さも検出可能である。半自動解析ソフトウェアは、それらの時間的·空間的発展の方向（ 図4）以下の定義されたパスに沿った特定のパラメータの測定を可能にします。これにより、ちゃん例えば、細胞内腔や細胞壁の厚さのような単一のパラメータのGESは年輪（ 図4）の全範囲にわたって決定することができる。これは、画像内に見えるすべてのリングのために行うことができ、これは完全に伸長時系列分析の必要性をサポートする。 画像分析はまた、植生期間（ 図5）内の年輪の発生段階を決定するために用いることができる。二次細胞壁の完全な木化まで、細胞壁の最も外側の角から開始して、偏光を用いた木質化さえ異なる段階をサフラニンアストラブルーで染色された部分の画像を分析する場合、見えるようになる。木化（成熟した）細胞壁が偏光（ 図5）中に照らすためである。詳細な情報は、例えば、より詳細な気候成長relatiを決定するために、それぞれの植生期間文書化環境データに関連付けることができる<html> onship。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig1.jpg" /> 図1の微小部分の例には、リング幅と血管径の測定を含むオークの準備平面左：オークインクリメントコアの最も外側の部分。直径5mmのコアは、コアミクロトームを用いて切断した。表面は、フェルトマーカーを用いて、黒色染色し、汚れが乾燥した後、細胞を、白亜を充填した。右：グラフは、左に示すコアの表面上で行わリング幅および血管サイズ測定を示しています。いいえマイクロセクションは（21の後に変更された）コアミクロトームによって作成された明確な表面のために、これらの測定を行うために必要とされなかった。下：マイクロセクションには、脱水、染色し、カナダバルサムで固定、インクリメントコアを遮断する。厚さ：20ミクロン、長さ25 cmである。<html> G &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig2.jpg" /> 図コーンスターチ溶液を使用して、セクションカット対安定化することなく、カットマイクロセクションの2。画像左：針葉樹の早材の仮導管で切断アーティファクトを示すマイクロセクション。サンプルは埋め込まずに切断し、結果として早材細胞のではなく薄い二次壁は、一次壁（青矢印）をオフに分割した。右：針葉樹の早材の仮導管内の任意のアーティファクトのないマイクロセクション。このセクション（左図のように同じサンプル）は試料表面の上にブラシでコーンスターチ溶液を塗布した後、切断した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ove_content「FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig3.jpg" /> 図左ほとんど検出年輪界の3例：（ここで： ヨーロッパカラマツ ）増分コアのマイクロ部分が細胞壁の任意の肥厚なし扁平晩材細胞の単一の行によって示される環境界（黒矢印）を示すが。このリングは、肉眼では見えないだろう。右：イントラ年次密度の変動（白矢印）は地中海の種で共通している（マイクロセクション： コナラアイレックス ）。晩材とバック早材構造（白矢印）に向けたセル構造の緩やかな変化は、実際のリングの境界（黒矢印）から密度変動を区別するために可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図針葉樹の年輪内腔面積、壁の厚さの測定の4イラストトップ： アカマツ （ヨーロッパアカマツ）の年輪でROXAS解析結果の一例を示すカットアウト画像。リング境界はシアンに黄色と仮道管腔の輪郭に示されている。つの半径方向ファイル（青仮道管腔）が測定されたセル壁の厚さは、赤色円で表されている。ブラックスケールバー=100μmである。下：イントラ年次仮道管の内腔面積の変化と全体の年輪のための仮道管細胞壁の厚さ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig5.jpg" /> 図5. Exampl形成年輪のE。イメージはで成長ヨーロッパカラマツから7月7日目 、2007年にサンプリングされたマイクロ·コアから得サフラニンとアストラ·ブルー染色のマイクロセクションから偏光で光顕微鏡下で撮影されましたレッチェンタール海抜1300メートルで。このマイクロ部形成層細胞に、拡大期における細胞は、壁肥厚期の細胞および成熟細胞が認識可能である。画像の接線幅は、木部断面の〜1ミリメートルをカバーしています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、木の標本をその成長構造の全体的な評価のためにサンプリングする方法を概説するプロトコルを提示します。十分に複製され、高分解能の木材解剖学的および樹状生態学的データセットを生成するために必要なマクロおよびミクロの調製および視覚化技術について説明します。

現代の木リング研究の技術的な観点 -  Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

本実験の全体的な目的は、再現性が高く、高解像度な木材の解剖学的データセットを作成し、樹木および低木の成長に対する時間および環境要因の影響を研究することです。これは、ミクロトームによる切片作成時に非ニュートン流体を用いて植物細胞を安定させることで達成され、これにより、第2段階としてサンプルの詳細な顕微鏡分析が可能になります。木化した細胞と木化していない細胞の識別を容易にするため、マイクロセクションを二重染色し、サンプルのデジタル画像を撮影します。最終的に、植物の成長に関する自動細胞解析および関連する時系列解析を行うことで、目的の木材解剖学的パラメータの評価が可能になります。既存の手法（サンプルをスコアして送付する方法など）に対する本手法の主な利点は、細胞内におがくずが充填されないため、画像解析に適した非常にクリアな品質のサンプルが得られることです。さらに、切片作成時に細胞に非ニュートン流体を加えることで、時間のかかるパラフィン包埋の手法を避けることができます。ビデオで紹介する新しいミクロトームは、私たちの研究室とチューリッヒのShang Dubsの中央Lu Nettiとの協力により開発されました。これらはガイドの安定性が非常に高く、大きく密度の高い試料の切断が可能であるという特徴があります。樹幹のコアサンプリングについて。まず、研磨した増分用コアを樹幹の成長軸に対して垂直に配置します。次に、コアをねじ込み、エクストラクターを使用して採取したコアサンプルを樹木から取り出します。コアの表面に柔らかい鉛筆で特定のIDを記入してラベルを貼り、すべてのサンプルを採取し終えたら、茎の反対側でも同様の手順を繰り返します。輸送中の破損を防ぐため、ラベルを貼ったコアは適切な容器に保管してください。その後、研究室に戻り、コアサンプルを繊維方向に沿って、耐水性の木工用接着剤を用いて木製の支持梁に直立状態で固定し、マイクロコアサンプリングのために乾燥させます。まず、必要に応じてノミを使用して樹皮の一部を除去します。次に、実演したように、茎の成長軸に対して垂直に専用のパンチングデバイスを配置し、ハンマーを用いて茎の木部まで約2 cmの深さまで貫通させます。パンチングデバイスを回転させ、ツール内部で得られたマイクロコアを破砕します。次に、茎からコアを取り出し、ラベルを貼ったマイクロ遠心チューブに保存します。コアサンプルに平坦な切断面を作るには、まず、コアの全域にわたって平面を切り出すために新しく開発されたコアマイクロトームのコアホルダーに、目的の年輪コアを固定します。次に、コアを上げて、コアの全域にわたってボールベアリングガイドに固定されたブレードに軽く触れるまで持ち上げ、ブレードを引いてコア上部の最初の部分を切断します。次に、ナイフをコアの後方に押し込みます。サンプルホルダーを約10 µm持ち上げ、コアの直径の約3分の1が切除され、連続した平坦な表面ができるまで、切断手順を繰り返します。サンプルの解剖学的構造の詳細な画像解析を行うには、別の種類のミクロトームでマイクロセクションを調製する必要があります。まず、目的のコアサンプルをミクロトームのホルダーに固定します。次に、ボールベアリングガイドに従ってミクロトームの刃を配置し、コアに向かって刃を引きます。ブレードを押し戻して、サンプルを 20 to 30 microns 持ち上げます。次に、ブレードをサンプルの上まで引きます。サンプルの上面に連続的な表面が形成されるまで、この工程を繰り返します。次に、絵筆を用いて、得られた表面をコーンスターチ溶液で覆います。その後、サンプルを15 µm持ち上げ、筆をサンプルの表面に置きます。ブレードをゆっくりとサンプルの方へ引き、筆の下で薄く切り始め、切断が完了した際に筆を使用して切片をブレードの表面に導きます。別のブラシと水を用いてブレードから組織を取り除き、ガラススライドの上に置いて木化組織と非木化組織を区別できるようにします。ピペットを使って水でグリセロールを洗い流します。次に、濡れた切片にサフランとアストロブルーの混合液を数滴滴下して覆います。5分後、水で染料を洗い流し、直ちに段階的なエタノール処理で切片を脱水します。脱水エタノール処理の後、100% xol で切片を繰り返し洗浄します。xol が透明になった時点で終了します。組織に100%カナダバルサムを1滴滴下し、気泡が入らないように注意しながらカバーガラスを被せます。次に、作成したマイクロスライドを2枚の耐熱性プラスチックストリップで挟み、金属プレートの上に置きます。切片を平坦に保つためにスライドの上に重りを載せ、60 °Cのオーブンに入れます。12時間後、スライドを室温まで冷却し、重りとプラスチックストリップを取り除きます。最後に、カミソリを使用してスライドを洗浄し、余分なバルサムを除去します。これまでに見せてきた切片作成および染色の手順に従えば、さまざまなサイズや形状のあらゆるサンプルを調製することが可能です。また、コア表面のデジタル画像を撮影して血管解析を行うために、専用のホルダーを使用することもできます。まず、実演した通りにコアマイクロトームでコア表面を平坦に切断し、フェルトペンを用いて得られた表面を黒く染めます。染料が乾燥したらすぐに、コア表面を白チョークでこすり、指でチョークを細胞内に押し込みます。余分なチョークを取り除き、デジタルカメラを搭載した双眼顕微鏡のステージにコアを載せ、コアの片端から観察を開始します。次に、表面全体が捉えられるまで、わずかに重複するように一連の画像を撮影します。次に、個々の画像を繋ぎ合わせて、コア表面の完全な画像を生成し、マイクロスライドからデジタル画像を作成します。スライドを顕微鏡ステージに置き、解析対象の構造に適した倍率を選択します。最後に、コア表面のサンプルで示した方法と同様に、洗浄済みマイクロスライドに封入された切片の重複する画像を撮影し、それらの画像を繋ぎ合わせて切片の完全な1枚の画像を生成します。細胞を露出させた状態で保持できることは、解剖学的な年輪生態学的構造を時系列解析に適応させるための重要な第一歩となります。針葉樹の早材または晩材の道管をより詳細に解析するためには、高品質なマイクロセクションが必要です。ここでは、細胞壁の破損などの潜在的なアーティファクトを回避しなければなりません。先ほど実演したコーンスターチ溶液のような非ニュートン流体を試料に適用することで、細胞構造の安定性が維持されます。マイクロセクション（微小断面）を作成することで、年輪の判定をより確実に行うことが可能になります。これは、特に自然限界付近に生育している針葉樹において顕著です。ここで見られるように、極めて狭い年輪は頻繁に現れますが、肉眼で検出することは困難です。極端な例では、年輪が1列または2列の細胞層で構成されており、マイクロセクション（微小切片）を用いた場合にのみ確認できることがあります。高倍率で画像を解析すると、個々の細胞が観察できます。半自動解析ソフトウェアを用いることで、細胞壁の厚さなどの単一パラメータの変化を、画像内で確認できるすべての年輪について決定することができ、長期的な時系列解析の必要性が示されます。マイクロセクションの二重染色により、リグニン化の異なる段階を可視化することが可能です。これらの情報を、それぞれの生長期の環境データと関連付けることで、開発後、より詳細な気候と成長の関係を明らかにすることができます。この手法は、DRO生態学分野の研究者が樹木や低木のさまざまな解剖学的パラメータを探索するための道を切り開きました。この方法を用いることで、大きく高品質な切片を作成するために必要な時間を大幅に短縮できます。本手順を実施する際は、ドラフトチャンバー内での作業や手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。このビデオを視聴することで、タイムシリーズ解析を裏付けるために、再現性が高く、高解像度な解剖学的データセットを作成する方法について深く理解することができます。

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アーバン流出研究施設の設計と建設

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを濃縮するために、電気陽性フィルターを使用します。この原稿では、メソッド 1615...

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

天然製品ベースの木材接着剤のより経済的で環境に優しい配合を求める努力を促進するために、この作業は植物種子ベースの木材接着剤の調製と試験を示しています。このプロトコルにより、合成ベースの木材接着剤の代替に適した候補として、植物種子ベースの農産物を評価できます。...

植物種子ミールベースの​​木材接着剤の調製および試験

ここでは、逆転写定量PCRを使用して、環境水と飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを定量化する手順を紹介します。EPA メソッド 1615 のこの標準化された手順による地下水からの平均ウイルス回収率は、ポリオウイルスで 20%、マウスノロウイルスで 30%...

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

タンパク質は、分散研究のために節足動物をマークするためによく使用されます。節足動物に内部および外部のタンパク質マークを投与する方法が実証されています。間接的またはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によるタンパク質マーク検出技術も示されています。...

管理と分散研究のための節足動物にプロテインマークを検出

家畜の摂食行動の好みは、木本作物の放牧管理計画を実施するために変更することができます。ここでは、条件付けられた味覚嫌悪を誘発する新しい植物を食べた後の塩化リチウム用量を示すプロトコルを紹介します。...

放牧グラウンドは小型反芻動物でウッディ作物にカバーするために条件づけ味覚嫌悪を作成する方法

学ぶ樹木年輪の高精度解剖学的解析法。非ニュートン流体を用いたマイクロトーム切片と二重染色により、材質細胞の詳細な顕微鏡観察と自動化された細胞解析を可能にする革新的なサンプリング技術を解説する。

現代の木リング研究の技術的な観点 - Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

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