現代の木リング研究の技術的な観点 - Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

次の実験の全体的な目標は、よく複製され、高度に分解された木材を生成することです。樹木や低木の成長に対する時間と環境要因の影響を研究するための解剖学的データセット。これは、ミクロトーム切片化中に非ニュートン流体を使用して植物細胞を安定化させることによって達成され、第2ステップとしてサンプルの詳細な顕微鏡分析が可能になります。

木質化細胞と非木質化細胞の分化を促進するために、マイクロ切片を二重染色し、サンプルのデジタル画像を撮影します。最終的には、植物の成長の自動化された細胞ベースの分析と関連する時系列分析を実行して、関心のある木材の解剖学的パラメータの評価を可能にすることができます。この技術の主な利点は、サンプルを送信するなどの既存の方法よりも優れている点は、私たちの技術では、細胞がおがくずで満たされていないため、画像分析のための非常に鮮明な品質のサンプルが得られることです。

さらに、切片化中に細胞に非ニュートン流体を添加することで、サンプルをパラフィンに埋め込むという時間のかかる技術を回避できます。ビデオで見る新しいミクロトームは、シャンダブスとチューリッヒの中央ルネッティにある私たちの研究室で開発されました。それらは、大きくて密度の高い標本の切断を可能にするガイダンスの高い安定性のために際立っています。

木の幹のコアサンプリング用。まず、鋭利なインクリメントコアを木の幹の成長軸に垂直に配置します。次に、コアを投入し、抽出器を使用して、得られたコアサンプルをツリーから除去します。

コアの表面に柔らかい鉛筆でマークされた特定のIDでコアにラベルを付け、すべてのサンプルが収集されたら、ステムの反対側で手順を繰り返します。ラベルの付いたコアは、輸送中の損傷から保護するために、適切な容器に保管してください。その後、ラボに戻ったら、耐水性の木工用ボンドを使用して、コアサンプルの繊維方向を木製のサポートビームに直立させて取り付け、マイクロコアサンプリングのために乾燥させます。

まず、必要に応じてノミを使って樹皮の一部を取り除きます。次に、先ほど示した茎の成長軸に垂直な特別なパンチング装置を配置し、ハンマーを使用して茎の木部を深さ約2センチメートルまで貫通させます。パンチングデバイスを回して、ツール内のマイクロコアを壊します。

次に、ステムからコアを取り外し、ラベル付きのマイクロ遠心チューブに保管します。コアサンプル上のプレーンな表面を切断するには、まず、新しく開発されたコアミクロトームのコアホルダーに目的のインクリメントコアを固定し、コア上の平面をその全範囲にわたって切断します。次に、コアの範囲にわたってボールベアリングガイドに固定されているブレードにわずかに触れるまでコアを持ち上げ、ブレードを引っ張ってコアの上部の最初の部分を切断します。

次に、ナイフを芯の後ろに押し込みます。サンプルホルダーを約10ミクロン持ち上げ、コアの約3分の1になるまで切断手順を繰り返します。直径がカットされ、連続したプレーンな表面が得られます。

サンプルの解剖学的構造の詳細な画像解析のためには、別のミクロトームタイプでマイクロ切片を調製する必要があります。まず、目的のコアサンプルをミクロトームのミクロトームホルダーに固定します。次に、ボールベアリングのガイダンスに導かれてミクロトームブレードを配置し、ブレードをコアに引っ張ります。

ブレードを押し戻して、サンプルを20〜30ミクロン持ち上げます。次に、ブレードをサンプルの上に引っ張ります。再び、サンプルの上部に連続した表面が作成されるまで、このプロセスを繰り返します。

次に、ペイントブラシを使用して、得られた表面をコーンスターチ溶液で覆います。次に、サンプルを15ミクロン持ち上げ、ブラシをサンプルの表面に置きます。ブレードをゆっくりとサンプルに向かって引き、ブラシの下に薄く切り込みを入れ始め、セクション全体が切断されたらブラシを使用してブレードの表面のセクションをガイドします。

別のブラシと水を使用してブレードから組織を取り除き、スライドガラスの上に置いて、木質化した構造と木質化していない構造を区別できるようにします。ピペットを使用してグリセロールを水で洗い流します。次に、濡れた部分をサフランとアストロブルーの混合物を数滴垂らします。

5分後、染料を水で洗い流し、すぐに連続したエタノール処理で切片を脱水します。脱水エタノール処理後、切片を100%xolで繰り返しすすいでください。xolが透明なままになるとすぐに。

100%カナダバルサムのドロップとカバーガラスでティッシュを覆い、気泡を避けます。次に、得られたマイクロスライドを2つの耐熱プラスチックストリップの間に置き、金属プレートの上に置きます。スライドの上に重りを置いてセクションを平らに保ち、スライドを摂氏60度のオーブンに置きます。

12時間後、スライドを室温まで冷ましてから、ウェイトとプラスチックストリップを取り外します。最後に、カミソリの刃を使用して余分なバルサムを除去するために、提示された切片化および染色手順に従って、さまざまなサイズと形状のすべての種類のサンプルを準備することができます。まず、先ほど示したようにコアミクロトームでコア表面面をカットし、フェルトマーカーを使用して得られた表面を黒く染色します。

染料が乾いたらすぐに、白いチョークで芯の表面をこすり、次にチョークを指で細胞に押し込みます。余分なチョークを取り除き、コアの片側からデジタルカメラを搭載した双眼顕微鏡のステージにコアを置きます。次に、表面全体がキャプチャされるまで、わずかに重なり合う画像のシーケンスを取得します。

次に、1 つの画像をつなぎ合わせてコア表面の完全な画像を作成し、マイクロスライドからデジタル画像を作成します。スライドを顕微鏡ステージに置き、分析する構造に適した倍率を選択します。最後に、コア表面サンプルで示したように、クリーニングされたマイクロスライドにマウントされたセクションの重なり合う画像を取得し、画像をつなぎ合わせてセクションの完全な画像を1つ作成します。

オープンセルを持つ能力は、解剖学的樹状動物の生態学的構造を時系列分析に適応するための最初の重要なステップです。針葉樹の初期の木材または後期の木材のトラッシュのより詳細な分析には、高品質のマイクロセクションが必要です。細胞壁の破損などの潜在的なアーティファクトは避ける必要があります。

先ほど示したコーンスターチ溶液のような非ニュートン流体をサンプルに塗布すると、細胞構造の安定性が支持されます。マイクロセクションにより、年間ランクをより安全に決定できます。これは、自然の限界で成長する針葉樹に特に当てはまります。

ここで見られるように、非常に狭いリングは頻繁に見られますが、巨視的に検出することは困難です。極端な場合、リングは1つまたは2つの細胞列で構成され、マイクロ切片を使用している場合にのみ見える場合があります。高倍率で画像を解析すると、単一の細胞が見えます。

半自動解析ソフトウェアでは、画像内に見えるすべてのリングについて、細胞壁の厚さなどの単一パラメータの変更を決定できるため、長時間の時系列解析が必要であることがわかります。マイクロ切片を二重染色することで、木質化のさまざまな段階を視覚化することができます。この情報は、その後、それぞれの植生期間の環境データに関連付けて、より詳細な気候成長関係を決定することができます その開発後。

この技術は、DRO生態学の分野の研究者が樹木や低木のさまざまな解剖学的パラメーターを探求する道を開きました。この方法を使用すると、大きくて高品質な切片を作成するのに必要な時間が大幅に短縮されます。この手順を実行するときは、ドラフトの下での作業や手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。

このビデオを見れば、時系列分析をサポートするための解剖学的データセットを配置するために、十分に複製され、高分解能で生成する方法を十分に理解できるはずです。