Name: における化学遺伝の相互作用の迅速な同定サッカロマイセス·セレビシエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶ酵母を用いた化学遺伝学的相互作用の同定法。Saccharomyces cerevisiaeの遺伝子ノックアウト株を用いて、化学物質に対する感受性変異体を特定し、耐性に必要な遺伝子を解析する。

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CJNラボの研究はNSERC、カナダの癌協会研究所（CCSRI）、およびカナダの乳がん財団（BC-ユーコン支店）から操作する補助金によってサポートされています。

注：この手順の一般的なワークフローを図2に概説されている。 成長阻害用量の1の決定<ol><li>酵母一晩培養の調製 注：このプロトコルで使用される酵母エキス-ペプトン-デキストロース増殖培地（YEPD）は、標準的なレシピ13である。 <ol><li> BY4741（ のMATa HIS3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0）YEPD寒天プレート上の細胞外ストリークし、30℃で、可視コロニーが形成されるまで、48時間インキュベートする。 </li><li>単一コロニーを滅菌した培養容器にYEPD液体培地の5ミリリットルを接種することによって、一晩培養を準備します。連続回転または振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。文化は一般的に（〜2×10 8細胞/ ml）朝までに飽和状態に達するだろう。 </li></ol></li><li>様々な化学物質の投与量を含有する固体寒天培地調製<ol><li>のいくつかの株式を準備化学物質は、適当な溶媒中で100×所望の最終濃度で試験する。 注：効果的な濃度は、化学に依存し、経験的に決定されなければならない。当初は幅広い最終濃度範囲をテストすることをお勧めします。 すなわち 、低μMからハイmMまで。 </li><li>化学物質の各濃度について、いくつかの滅菌培養チューブにアリコート溶融YEPD寒天を3mlを、試験される。 55℃の水浴中で場所が固化維持する。 </li><li>試験対象の化学物質の各濃度について12ウェルプレート内の重複ウェルのそれぞれペアに溶融メディア、渦に混合する2-3秒、およびピペット1ミリリットルを100倍化合物の30μlを添加する。唯一の制御車両を含めるようにしてください。プレートを室温で一晩に設定できるようにします。余分なメディアを捨てる。 </li></ol></li><li>スプレッドプレーティング細胞<ol><li>ステップ1のように一晩増殖させ飽和酵母培養の2μL、とYEPD液体培地の10ミリリットルを接種する。1.2。 </li><li>プレートウェルあたり希釈された酵母培養液25μl、滅菌ガラスビーズやロッドを使用して均一に広げ、そしてプレートが炎の下で乾燥させる。 48時間、30℃でプレートをインキュベート。 </li><li>プレート上での酵母の増殖（コロニーの両方の合計数と大きさ）を評価する。画面を実行するために10％以上の-15％の成長を阻害しない化合物の亜致死濃度を選択する。 </li></ol></li></ol> 2.体系的化学遺伝画面<ol><li>ソースプレートの欠失変異体アレイのメンテナンス（DMA）と準備<ol><li>グリセロールストックから欠失変異体アレイを構築する上で詳細な説明についてはBaryshnikova ら 14を参照してください。欠失変異体は、プレートあたり384コロニーの密度で配列された後、DMAは4​​℃で数ヶ月間保存することができる。それぞれに成長するコロニーを防止するためにG418、必要に応じて200μgの/ mlを含むYEPD寒天上に複製するその他。 注：複数のシリアル複製が遅い成長株の損失を防止し、サプレッサー変異株の出現を最小限にするために避けるべきである。半数体としてのコレクションを維持する場合、これは特に関連する。 </li><li>ロボットシステムを配列の微生物を使用して、すべてのレプリカプレーティングの手順を実行します。また、手動のピン止めツールを使用して配列されたコロニーを操作します。 注：酵母の削除コレクションは、いくつかの商業的供給源から半数体と二倍体として利用可能で、通常は96ウェルプレートにグリセロールストックとして出荷されています。 </li></ol></li><li>欠失変異体の配列を凝縮<ol><li> G418200μgの/ mlを含むYEPD寒天培地の250ミリリットルを準備します。 G418の有効濃度は変化してもよく、各ロットは、実験的にテストする必要があります。 </li><li>プレートあたりのG418を200μg/ mlを含むYEPD寒天の50ミリリットルを注ぐことにより、5 YEPD寒天プレートを準備します。配列を凝縮する前にこの一日を行い、プレートを室温で冷却することができるようにerature一夜平らな平らな面に。 注：4つのプレートが1536 - ひずみ密度で収集に必要となる、第五のプレートが余分として注入する。 </li><li>プレート当たり384コロニーの密度で突然変異体の削除コレクションを含む16ペトリ皿を取り出し、室温（〜1時間）に来ることができます。 </li><li>繊細なタスクが拭く使用して各プレートの蓋の上に形成されたすべての結露を拭いてください。これを怠ると、配列された変異体の配列と交差汚染の上に堆積されて水滴になることがあります。 </li><li>微生物の配列ピン止めロボットを用いて、プレート当たり1536個のコロニー（4ペトリ皿）に、プレート当たり384コロニー（16ペトリ皿）の密度からDMAを凝縮。プレート1ピンから1 番目のコロニーが凝縮された配列の1列1行するように、これを実行し、プレート2の1 番目のコロニーは、1列2、2列1を行にプレート3の1 番目のコロニー行、とする行2のプレート4の1 番目のコロニーコラム2。 </li><li> 30℃で一晩連結配列をインキュベートする。 </li><li>ソースプレートからコロニーの均一な移動を確保するための配列を調べます。 DMAが正しく（ 図4A）凝縮されたために、ガイドとして役立つわざわざ配列に組み込まれ、いくつかの空白の位置が、あるでしょう。 注：これらは、試験化合物を含有する培地上にレプリカプレーティングのソースプレートになる。単一ソースプレートは、複数のpinningsのために使用することができる。また、多くのロボットは、酵母の同じような数字が毎回転送されていることを確認します相殺機能を持ちます。 </li></ol></li><li>レプリカプレート欠失変異体配列<ol><li>コントロールの700ミリリットル（車両のみ）、および実験的なメディア（化学系）の700ミリリットルを準備します。これは（条件あたり12のプレートに加え、2エクストラ）三連でアッセイを行うために十分である。 </li><li>プレート当たりの試験化学物質またはコントロールを含むYEPD寒天の50ミリリットルを注ぐ。プレートtを許可Oフラットさえ表面に室温で一晩冷やす。 </li><li>レプリカプレートにロボットを用いて、実験的に決定された濃度の化学物質を含有するプレートを3組、ならびにビヒクル対照を含有するプレートを3組にDMAを接種する。 24〜48時間室温でプレートをインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 3.イメージングプレートとデータ解析<ol><li>インキュベーターからプレートを取り出し、それらを画像化の前に、室温（〜1時間）に来ることができます。これは、プレートを画像化しながら、結露を防ぐことができます。 </li><li>蓋を取り外し、フラットベッドスキャナ上に表を下にして置くことにより24及び48時間での画像プレート。少なくとも300dpiの解像度で画像をキャプチャします。代替的に、画像をキャプチャするデジタルカメラを使用。そうする場合は、場所のプレートは、暗い背景に表向きにして画像に蓋を取り外します。 注意：プレートのファイルフォーマットおよび位置決めを使用定量化プログラムに依存するであろう。 </li&gt; <li> Balony 15、SGAtools 16、及びScreenMill 17を含むいくつかのオープンソースプログラムのいずれかを使用してアレイコロニーの大きさの定量化と比較を行う。 </li></ol>画面の4。バリデーション注：この段階では、いくつかの酵母の欠失変異体は、対象の化学物質への過敏として獲得します。これらの化学遺伝的相互作用は、次の二つの方法で検証する必要があります。最初の感受性株の同一性は、PCRによって確認されるべきである。第二に、化学物質過敏症は、独立して採点されなければならない。以下に概説ひずみ過敏症、酵母生物学における一般的な技術を検証するために、スポッティングアッセイを行うための簡単​​なプロトコルである。 <ol><li>ストリークアウトのG418を200μg/ mlを含むYEPD寒天上に酵母削除コレクションから（過敏）変異体を希望する。コロニーが形成されるまで30℃でインキュベートする。に応じてプライマーを用いた診断PCRによって株の遺伝子型を確認してください製造業者のプロトコル。 </li><li>各菌株のためのYEPD液体の5ミリリットルを接種し、回転または振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。 </li><li> OD 600を測定し、無菌のdH 2 O中にOD 600 = 1に各菌株を希釈これらは現在、正規化された酵母培養物である。 </li><li> 96ウェルプレートのウェルA1に正規化された野生型酵母（BY4741）培養物100μlを分注する。井戸B1-H1に最大7つの追加の株を100μl分注する。 </li><li> A6-H6を通じて井戸A2-H2に無菌のdH 2 O90μlのを分配するためにマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用してください。最後に、正規化された酵母培養物の1:10希釈系列を用意。シリアルにマルチチャンネルピ ​​ペッターで列2に列1の10μlのピペッティングして起動し、6の希釈が行われるまで、96ウェルプレート全体で継続する（ すなわち 、10 0〜10 -5）。 </li><li>マルチチャンネルを使用してグリッドに希釈した酵母培養の2-5μlの転送化学的および車両コントロールを含むYEPD固体培地上にピペッター。 24〜48時間のための適切な温度でプレートをインキュベートする。 </li><li> （BY4741対照と比較して）プレートを点検し、化学物質に選択した変異体の感度を比較する。ステップ3.2と24と48時間での画像プレート。 注：関連遺伝子オントロジーまたは機能を有するいくつかの過敏株の同定は、スクリーンの有効性に自信を向いているが、遺伝子の野生型コピーを含有するプラスミドと過敏欠失菌株の形質転換は、正式にその遺伝子を確立するために必要とされる興味の削除は（第二部位変異を隠されていない）薬剤感受性の原因となる。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明は、化学遺伝的相互作用のプロファイルを生成するためのアプローチである。この方法は単純で、化学物質の存在下および非存在下での総合的な遺伝子欠失コレクション内の各株のコロニーのサイズを比較することにより、化学的傷害を許容するために必要なすべての遺伝子が同定されている。感受性株の結果リストの注釈濃縮分析は、アクションの薬品モードへの洞察を提供するために使用することができる。このプロトコルは、出芽酵母用に最適化されているが、それはまた、例えば大腸菌のような他の配列された微生物の欠失コレクションで使用するために適合させることができる携帯摂動26,27の数百を調べるために成功裏に使用されてきた慶應義塾コレクションを、 大腸菌 。 酵母および他の生物における化学遺伝プロファイリングは、十分に確立されている。これらの研究の大部分は、マイクロアレイ分析またはハイスループットsequ介し欠失変異体をプールし、定量化する競合アッセイに依存してきたユニークな遺伝的バーコードのencing。このアプローチは、大規模な化学ライブラリーの堅牢な...

遺伝的ツールとモデル生物出芽酵母で利用可能なリソースを一括遺伝子がネットワークは、生物学的システムの要件を満たすためにとして機能する方法に新たな洞察を提供し、大規模なゲノム機能研究を可能にした。これらのツールの礎石は、酵母1,2内のすべてのオープンリーディングフレームの非必須遺伝子欠失の完全なセットの共同制作だった。顕著な観察は、標準的な実験室条件下​​で半数体として増殖させた場合の酵母遺伝子のわずか〜20％が生存に必要とされることであった。これは別の生物学的経路を利用して、ゲノムの摂動に対する緩衝する細胞の能力を強調しています。組み合わせて個別に実行可能な、しかし、致死的に接続または収束並列生物学的経路のシグナル及び生物学的機能を説明する遺伝的相互作用のネットワークを形成する遺伝的変異体。条件付きテの発展に伴い必須遺伝子のmperatureに敏感と低次形態対立遺伝子技術は、非必須遺伝子3,4の研究に限定されていません。この概念は、類似の細胞プロセスに関与する遺伝子が5が一緒にクラスタ化方法を説明するための公平な遺伝的相互作用マップを生成するゲノム規模で適用されている。 遺伝子ネットワークの化学摂動模倣遺伝子欠失（ 図1）6。過敏症の削除株の高密度アレイに対して増殖抑制化合物を問い合せると、化学的ストレスに耐えるために必要とされる遺伝子のリスト、つまり 、化学遺伝的相互作用プロファイルを識別します。遺伝的相互作用と同様に、化学ライブラリーの大規模スクリーニングは、一緒に行動クラスタの類似した様式を有する化合物7が示されている。したがって、化合物の化学遺伝的相互作用のプロファイルを確立することによって、作用機序は、LARと比較することによって推測することができるGE-規模合成遺伝的および化学的な遺伝的相互作用のデータセット8,9。 化合物のスコアは、尋問されている大規模な化学遺伝学的スクリーニングでは、バーコードの競合アッセイにより行われてきた。この手法では、欠損株のプールされたコレクションは、化学物質を含有する培地の少量の数世代にわたって一斉に成長させる。各欠失変異体は、固有の遺伝的バーコードを保有するので、欠失株のプール内の個々の突然変異体の生存/増殖は、マイクロアレイまたは高スループット配列10によって追跡される。 生物活性化合物を含む固体寒天上で増殖させた物理的に配列された変異体のコロニーの大きさを監視することにより、適合度を推定することは、化学遺伝的相互作用11,12を識別するための有効な方法である。このアプローチは、競合ベースのスクリーニングの費用対効果の高い代替物を提供し、化学物質の小さなライブラリーをアッセイするために適している。ここで概説S.における化学遺伝的相互作用のリストを生成するための簡単な方法論である分子生物学操作またはインフラストラクチャに依存しない。セレビシエ。のみ酵母削除コレクション、ロボットまたは手動のピン止め装置、及び自由に利用できる画像解析ソフトウェアを必要とする。

<table><tbody><tr>YEPDの液体/固体媒体のための<td>酵母のエキス</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td>は<td>1%の最終濃度(w / v)に加えます（w / v</td></tr><tr><td>）チルプトン粉末</td><td>BDバイオサイエンス211820</td><td></td><td>YEPD液体または固体媒体の場合、2）の最終濃度（w / v）</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>に追加しますYEPD液体/固体媒体の場合、最終濃度(w / v)を2%に加えてください&#8212;オートクレーブはしないでください。20%ストック溶液を調製し、ろ過滅菌し、オートクレーブ後に培地に加えます。</td></tr><tr><td>寒天 A</td><td>バイオベーシック</td><td>FB0010</td><td>YEPD 固体培地用 最終濃度 2% (w/v)</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>200で1,000倍の在庫を用意&nbsp;dH2O中のmg / mlおよびフィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 培養チューブ</td><td>エバーグリーン サイエンティフィック</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>ハイスループット微生物アレイピン留めロボット</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy;ペトリ皿</td><td>シンガーインストゥルメント&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>200皿入りボックス</td></tr><tr><td>384ショートピンRePad</td><td>シンガーインストゥルメント&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>1,000パッドボックス</td></tr><tr><td>1536ショートピンRePad</td><td>シンガーインストゥルメント&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td colspan="4">代替ピン留めツール:</td></tr><tr><td>全自動ロブティックシステム</td><td>S&Pロボティクス</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>いくつかの自動化されたコロニー処理ロビティックおよび想像システムが利用可能です。</td></tr><tr><td>手動ピン留めツール</td><td>V&P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>ハンドヘルド・レプリケーション・ツールおよびアクセサリ。&nbsp;</td></tr></tbody></table>

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

出芽酵母は、生物活性化学物質の作用機序を学術、製薬、幅広い、および産業科学者に興味がある。決定、または出芽酵母、〜6000の遺伝子の欠失変異体と低形質必須遺伝子のための完全なコレクションのモデル真核生物である変異体は、市販されている。変異体のこれらのコレクションは、系統的に化学物質を許容するために必要な化学-遺伝子の相互作用、 すなわち遺伝子を検出するために用いることができる。この情報は、順番に、化合物の作用の可能性が高いモードに報告します。ここでは、出芽酵母における化学遺伝的相互作用の迅速な同定のためのプロトコルについて説明します。我々は、アクションの明確に定義された機構を有する化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）を用いた方法を実証する。我々の結果は、核TRAMPのRNAエキソソームおよびDNA修復酵素は、以前メートルと一致する5-FUの存在下で増殖のために必要とされることを示すベースのバーコード化学遺伝学的アプローチおよび5-FUに悪影響RNA及びDNA代謝に影響を与えることを知ってicroarray。これらのハイスループットスクリーニングの必要な検証プロトコルも記載されている。

このアプローチの妥当性確認として、我々は、上記で概説したプロトコル次の化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）の代表的な化学遺伝的相互作用の画面を行った。 5-FUは、チミジル酸シンターゼ、ならびにDNAおよびRNA代謝18を破壊することが知られている。 5-FUの化学遺伝的相互作用は十分に研究されており、ヘテロ接合およびホモ接合性欠失コレクション8,19の両方を使用して、酵母バーコードマイクロアレイ技術によって研究されている。ここでは、同様の結果が突然変異コロニーの大きさの比較定量することにより得ることができることを示している。 それを行う画面が非必須半数体遺伝子欠失コレクションを利用していることに留意すべきである。このタイプのスクリーンはまた、必須遺伝子変異体を含むことを可能にする、二倍体株は、温度感受性突然変異体、および低次形態対立遺伝子を用いて行うことができる。半数体欠失コレクションを利用する一つの利点は、増加した薬物である小文字の区別もターゲット経路のityが、遺伝子産物の完全な不在を与え。しかし、二つの重要な欠点が必須遺伝子...

ここでは、出芽酵母における化学遺伝学的相互作用を定義するための費用対効果の高い方法を提示します。このアプローチは、酵母分子生物学の基本的な技術に基づいて構築されており、化学物質の小規模から中規模のコレクションやその他の培地環境の機構的調査に適しています。

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

この手順の全体的な目標は、酵母細胞を使用して、目的の化学物質が標的とする生物学的プロセスを見つけることです。これは、まず酵母の化学物質の用量反応プロファイルを決定することによって達成されます。第2のステップは、酵母遺伝子ノックアウト株の完全なコレクションを、致死量以下の化学物質とコントロールプレート上で増殖させることです。次に、化学物質に過敏な酵母変異体が同定されます。このリストは、バイオインフォマティクスで分析され、化学物質に耐えるために必要なすべての遺伝子が明らかになります。最後のステップは、低スループットで実験の生物学的複製を実行することです。これにより、見つかった化学的遺伝子相互作用が検証されます。最終的に、このハイスループットの化学的遺伝学的スクリーニング法を使用して、目的の化学物質に耐えるためにどの遺伝子産物と生物学的経路が使用されるかを示します。この技術が、液体培養におけるバーコード付き変異体の競争的成長などの既存の方法よりも優れている点は、分子生物学的な技術が不要であることです。この方法は、新しい低分子が真核細胞の成長をどのように阻害できるかなど、ケミカルバイオロジーの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、A-Y-E-P-Dプレート上で4 7 4 1細胞をストリーキングして一晩酵母培養物を準備し、摂氏30度で48時間、または目に見えるコロニーが形成されるまでインキュベートします。コロニーの準備ができたら。1つのコロニーを選び、無菌容器に5ミリリットルのYEPD液体培地を接種することにより、一晩で液体培養物を調製します。その後、摂氏30度で一晩インキュベートし、連続回転または振とうします。次に、試験する化学物質のさまざまな用量を含む固体寒天培地を準備します。これを行うには。まず、目的の化学物質のストック溶液を、最終濃度の100倍で適切な溶媒に数個調製します。次に、試験する濃度ごとに、3ミリリットルの溶融YEPD寒天をいくつかの滅菌培養チューブに分注します。寒天の固化を防ぐために、寒天の入ったチューブを摂氏55度の水浴に底付けします。今、13でテストされる化学物質の各濃度について、溶融寒天テックスのアリコートに100 x化合物の白色放出、チューブを2〜3秒間混合し、各チューブから1ミリリットルをピペットで12ワールドプレートの複製ウェルにピペットで移し、プレートを室温で一晩セットできるようにします。翌日、10ミリリットルのYEPD液体培地に2マイクロリットルの飽和一晩酵母培養液を接種します。次に、この培養物の25マイクロリットルを12クジラプレートのウェル内の化学物質含有寒天にピペットで移し、滅菌ガラスビーズまたは滅菌ロッドを使用して均等に広げます。プレートを炎で乾かしてから、プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、ウェル内のコロニーの総数とサイズを評価します。10〜15%を超えて成長を阻害しない化合物の亜致死濃度を特定し、スクリーニングで使用します。G4のミリリットルあたり200マイクロリットルを含む16枚のYEPD寒天プレート上で複製することにより、プレートあたり384コロニーの密度で欠失変異体率を維持します18。微生物アレイロボットシステムまたは手動ピン留めツールを3か月ごとに使用しています。プレートは必要になるまで摂氏4度で保管してください。次に、同じ濃度のG、4、18、または5つの寒天プレートで250ミリリットルのYEPD寒天培地を調製し、平らで均一な表面で室温で一晩冷まします。欠失変異体コレクションを含むプレートを摂氏4度で保管から取り出し、プレートを室温に戻します。繊細なタスクワイプを使用して、各プレートの蓋に形成された結露を取り除き、アレイに水滴が堆積し、アレイ変異体の相互汚染を防ぎます。微生物アレイピン留めロボットに、欠失変異体アレイを16枚のシャーレのプレートあたり384コロニーの密度から4枚のシャーレのプレートあたり1,536コロニーに凝縮させます。アレイを摂氏30度で一晩インキュベートした後、アレイを調べて、ソースプレートからコロニーが均一に移ることを確認します。配列にはいくつかの空白の位置が組み込まれ、欠失変異配列が正しく凝縮されたことを示すガイドとして機能します。これらは、目的の化合物を含むメディアに複製するために使用されるソースプレートになります。1枚のソースプレートで複数のピン留めが可能です。また、多くのロボットにはオフセット機能があり、これにより毎回同数の酵母が転送されます。レプリカプレート削除変異体アレイ修復を設定するために、700ミリリットルの制御車両のみと、目的の化学物質を含む実験用YEPD寒天。これは、アッセイをトリプリケートで実行するのに十分です。コントロールと実験寒天を使用してプレートを注ぎます。各プレートに50ミリリットルを追加します。プレートを室温で一晩、平らで均一な表面で冷まし、ロボットを使用してプレートを繰り返します。実験的に決定された濃度の化学物質を含む3セットのプレートに二重変異体アレイを接種し、ビヒクル制御を含むプレートをリセットします。ベンチトップ上のプレートを室温でインキュベートし、合計24〜48時間の画像を作成します。プレートは、蓋を取り外し、フラットベッドスキャナーに伏せて置くことにより、24時間および48時間のインキュベーションを行います。少なくとも 300 DPI の解像度で画像をキャプチャします。または、デジタルカメラを使用して画像をキャプチャします。その場合は、プレートを上向きにして暗い背景に置き、蓋を取り外して画像を作成します。次に、ボールSGAツールやスクリーンミルなど、いくつかのオープンソースプログラムのいずれかを使用して、アレイコロニーサイズの定量と比較を行います。この段階では、いくつかの酵母欠失変異体は、目的の化学物質に対して過敏であるとスコア付けされ、酵母欠失コレクションから目的の過敏変異体がYEPDに連鎖します。G four 18のマイクロリットルあたり200マイクログラムを含むエイジャーは、コロニーが形成されるまで摂氏30度でインキュベートします。診断用PCRとAgel電気泳動により菌株の遺伝子型を確認した後、各菌株に5ミリリットルのYPD液を接種し、回転または振とうしながら摂氏30度で一晩インキュベートします。各培養物のOD 600を測定し、滅菌蒸留水で各菌株を1のOD 600に希釈します。これらは現在、正規化された酵母培養物です。次に、4 7 4 1酵母培養により正規化された野生型100マイクロリットルをウェルAに分注し、96ウェルプレートのうちの1つをウェルに最大7つの追加菌株を分注し、ウェルに100マイクロリットルを分注し、ウェルに7つまで追加で、B1からHの1つを分注する。次に、90マイクロリットルの滅菌水を井戸に分配し、A2〜H2から6〜H6を注ぎます。最後に、正規化されたG彫刻の1〜10希釈のシリーズを準備します。まず、10 マイクロリットルのカラム 1 からカラム 2 までマルチチャンネルピペットで連続ピペッティングし、6 回の希釈が行われるまで 96 ウェルプレートを横切って続けます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、YEP Dのグリッド内の希釈酵母培養物の2〜5マイクロリットル、化学物質およびビヒクル制御を含む固体培地を使用します。インキュベーション後24〜48時間、プレートを適切な温度でインキュベートします。プレートを検査し、選択した変異体の化学に対する感度を、24時間および48時間でのBY 47 41コントロールイメージプレートと比較して比較します。前述したように、以下の画像は、化学物質のスビン阻害濃度を測定する手順の結果を示しています。最初の画像は、1〜5, 000に希釈され、5つのフルオロウラシルの濃度の増加にメッキされた飽和BY 4 7 4 1培養物の成長を示しています。10マイクロモルの濃度は、サブイン阻害用量として選択されます。この画像は、5つのフルオロウラシルを含む液体培地中のBY 4 7 41細胞の成長曲線を示しています。10〜4個の細胞の約4倍を三重に沈着させ、5つのフルオロウラシルおよび光学密度の増加濃度を10分ごとに22時間測定した。ここでも、10マイクロモルの用量がスビン阻害用量であることがわかる。これらの次の図は、5つのフルオロウラシルの化学遺伝学の緑色からの結果を示しています。ここでは、右側に10マイクロモルの5フルオロウラシル、左側にDMSO制御を含むYPD寒天上に複製されたS sachar visier欠失変異体アレイが示されています。このグラフは、10マイクロモルでの突然変異体の相対的な成長である化学遺伝学の緑色の結果を示しています。DMSOコントロールと比較した5つのFluorウラシルは、ここでは光線の位置で注文されています。10マイクロモル、5フローラウラシル、DMSOコントロールと比較した変異体の相対的成長は、コロニーサイズ比によって順序付けられます。どちらのグラフでも、0.8 未満の比率しきい値が示されています。この最終画像は、3つのバリデーションアッセイの結果を示しています。いくつかの単離された変異株の段階希釈をDMSOコントロールで成長させました(左)、中央に10マイクロモル、5つのフルオロUIL、右側に0.015%メチルメタンスルホン酸。この手順を試行する際は、酵母スポッティングアッセイや酵母テトラッド解剖などの独立した方法論を使用して結果を検証するために、欠失変異配列の信頼性の高いコピーを使用していることを確認することが重要です。この手法は、低分子研究の分野の科学者が、出芽酵母のシステムレベルのアプローチを使用して化合物の作用機序を探索するための効率的な手段を提供します。

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生物学

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における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

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