における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

この手順の全体的な目標は、酵母細胞を使用して、目的の化学物質が標的とする生物学的プロセスを見つけることです。これは、まず酵母の化学物質の用量反応プロファイルを決定することによって達成されます。第2のステップは、酵母遺伝子ノックアウト株の完全なコレクションを、致死量以下の化学物質とコントロールプレート上で増殖させることです。

次に、化学物質に過敏な酵母変異体が同定されます。このリストは、バイオインフォマティクスで分析され、化学物質に耐えるために必要なすべての遺伝子が明らかになります。最後のステップは、低スループットで実験の生物学的複製を実行することです。

これにより、見つかった化学的遺伝子相互作用が検証されます。最終的に、このハイスループットの化学的遺伝学的スクリーニング法を使用して、目的の化学物質に耐えるためにどの遺伝子産物と生物学的経路が使用されるかを示します。この技術が、液体培養におけるバーコード付き変異体の競争的成長などの既存の方法よりも優れている点は、分子生物学的な技術が不要であることです。

この方法は、新しい低分子が真核細胞の成長をどのように阻害できるかなど、ケミカルバイオロジーの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、A-Y-E-P-Dプレート上で4 7 4 1細胞をストリーキングして一晩酵母培養物を準備し、摂氏30度で48時間、または目に見えるコロニーが形成されるまでインキュベートします。コロニーの準備ができたら。

1つのコロニーを選び、無菌容器に5ミリリットルのYEPD液体培地を接種することにより、一晩で液体培養物を調製します。その後、摂氏30度で一晩インキュベートし、連続回転または振とうします。次に、試験する化学物質のさまざまな用量を含む固体寒天培地を準備します。

これを行うには。まず、目的の化学物質のストック溶液を、最終濃度の100倍で適切な溶媒に数個調製します。次に、試験する濃度ごとに、3ミリリットルの溶融YEPD寒天をいくつかの滅菌培養チューブに分注します。

寒天の固化を防ぐために、寒天の入ったチューブを摂氏55度の水浴に底付けします。今、13でテストされる化学物質の各濃度について、溶融寒天テックスのアリコートに100 x化合物の白色放出、チューブを2〜3秒間混合し、各チューブから1ミリリットルをピペットで12ワールドプレートの複製ウェルにピペットで移し、プレートを室温で一晩セットできるようにします。翌日、10ミリリットルのYEPD液体培地に2マイクロリットルの飽和一晩酵母培養液を接種します。

次に、この培養物の25マイクロリットルを12クジラプレートのウェル内の化学物質含有寒天にピペットで移し、滅菌ガラスビーズまたは滅菌ロッドを使用して均等に広げます。プレートを炎で乾かしてから、プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、ウェル内のコロニーの総数とサイズを評価します。

10〜15%を超えて成長を阻害しない化合物の亜致死濃度を特定し、スクリーニングで使用します。G4のミリリットルあたり200マイクロリットルを含む16枚のYEPD寒天プレート上で複製することにより、プレートあたり384コロニーの密度で欠失変異体率を維持します18。微生物アレイロボットシステムまたは手動ピン留めツールを3か月ごとに使用しています。

プレートは必要になるまで摂氏4度で保管してください。次に、同じ濃度のG、4、18、または5つの寒天プレートで250ミリリットルのYEPD寒天培地を調製し、平らで均一な表面で室温で一晩冷まします。欠失変異体コレクションを含むプレートを摂氏4度で保管から取り出し、プレートを室温に戻します。

繊細なタスクワイプを使用して、各プレートの蓋に形成された結露を取り除き、アレイに水滴が堆積し、アレイ変異体の相互汚染を防ぎます。微生物アレイピン留めロボットに、欠失変異体アレイを16枚のシャーレのプレートあたり384コロニーの密度から4枚のシャーレのプレートあたり1,536コロニーに凝縮させます。アレイを摂氏30度で一晩インキュベートした後、アレイを調べて、ソースプレートからコロニーが均一に移ることを確認します。

配列にはいくつかの空白の位置が組み込まれ、欠失変異配列が正しく凝縮されたことを示すガイドとして機能します。これらは、目的の化合物を含むメディアに複製するために使用されるソースプレートになります。1枚のソースプレートで複数のピン留めが可能です。

また、多くのロボットにはオフセット機能があり、これにより毎回同数の酵母が転送されます。レプリカプレート削除変異体アレイ修復を設定するために、700ミリリットルの制御車両のみと、目的の化学物質を含む実験用YEPD寒天。これは、アッセイをトリプリケートで実行するのに十分です。

コントロールと実験寒天を使用してプレートを注ぎます。各プレートに50ミリリットルを追加します。プレートを室温で一晩、平らで均一な表面で冷まし、ロボットを使用してプレートを繰り返します。

実験的に決定された濃度の化学物質を含む3セットのプレートに二重変異体アレイを接種し、ビヒクル制御を含むプレートをリセットします。ベンチトップ上のプレートを室温でインキュベートし、合計24〜48時間の画像を作成します。プレートは、蓋を取り外し、フラットベッドスキャナーに伏せて置くことにより、24時間および48時間のインキュベーションを行います。

少なくとも 300 DPI の解像度で画像をキャプチャします。または、デジタルカメラを使用して画像をキャプチャします。その場合は、プレートを上向きにして暗い背景に置き、蓋を取り外して画像を作成します。

次に、ボールSGAツールやスクリーンミルなど、いくつかのオープンソースプログラムのいずれかを使用して、アレイコロニーサイズの定量と比較を行います。この段階では、いくつかの酵母欠失変異体は、目的の化学物質に対して過敏であるとスコア付けされ、酵母欠失コレクションから目的の過敏変異体がYEPDに連鎖します。G four 18のマイクロリットルあたり200マイクログラムを含むエイジャーは、コロニーが形成されるまで摂氏30度でインキュベートします。

診断用PCRとAgel電気泳動により菌株の遺伝子型を確認した後、各菌株に5ミリリットルのYPD液を接種し、回転または振とうしながら摂氏30度で一晩インキュベートします。各培養物のOD 600を測定し、滅菌蒸留水で各菌株を1のOD 600に希釈します。これらは現在、正規化された酵母培養物です。

次に、4 7 4 1酵母培養により正規化された野生型100マイクロリットルをウェルAに分注し、96ウェルプレートのうちの1つをウェルに最大7つの追加菌株を分注し、ウェルに100マイクロリットルを分注し、ウェルに7つまで追加で、B1からHの1つを分注する。次に、90マイクロリットルの滅菌水を井戸に分配し、A2〜H2から6〜H6を注ぎます。最後に、正規化されたG彫刻の1〜10希釈のシリーズを準備します。

まず、10 マイクロリットルのカラム 1 からカラム 2 までマルチチャンネルピペットで連続ピペッティングし、6 回の希釈が行われるまで 96 ウェルプレートを横切って続けます。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、YEP Dのグリッド内の希釈酵母培養物の2〜5マイクロリットル、化学物質およびビヒクル制御を含む固体培地を使用します。インキュベーション後24〜48時間、プレートを適切な温度でインキュベートします。

プレートを検査し、選択した変異体の化学に対する感度を、24時間および48時間でのBY 47 41コントロールイメージプレートと比較して比較します。前述したように、以下の画像は、化学物質のスビン阻害濃度を測定する手順の結果を示しています。最初の画像は、1〜5, 000に希釈され、5つのフルオロウラシルの濃度の増加にメッキされた飽和BY 4 7 4 1培養物の成長を示しています。

10マイクロモルの濃度は、サブイン阻害用量として選択されます。この画像は、5つのフルオロウラシルを含む液体培地中のBY 4 7 41細胞の成長曲線を示しています。10〜4個の細胞の約4倍を三重に沈着させ、5つのフルオロウラシルおよび光学密度の増加濃度を10分ごとに22時間測定した。

ここでも、10マイクロモルの用量がスビン阻害用量であることがわかる。これらの次の図は、5つのフルオロウラシルの化学遺伝学の緑色からの結果を示しています。ここでは、右側に10マイクロモルの5フルオロウラシル、左側にDMSO制御を含むYPD寒天上に複製されたS sachar visier欠失変異体アレイが示されています。

このグラフは、10マイクロモルでの突然変異体の相対的な成長である化学遺伝学の緑色の結果を示しています。DMSOコントロールと比較した5つのFluorウラシルは、ここでは光線の位置で注文されています。10マイクロモル、5フローラウラシル、DMSOコントロールと比較した変異体の相対的成長は、コロニーサイズ比によって順序付けられます。

どちらのグラフでも、0.8 未満の比率しきい値が示されています。この最終画像は、3つのバリデーションアッセイの結果を示しています。いくつかの単離された変異株の段階希釈をDMSOコントロールで成長させました(左)、中央に10マイクロモル、5つのフルオロUIL、右側に0.015%メチルメタンスルホン酸

この手順を試行する際は、酵母スポッティングアッセイや酵母テトラッド解剖などの独立した方法論を使用して結果を検証するために、欠失変異配列の信頼性の高いコピーを使用していることを確認することが重要です。この手法は、低分子研究の分野の科学者が、出芽酵母のシステムレベルのアプローチを使用して化合物の作用機序を探索するための効率的な手段を提供します。