Name: 単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶマウス骨髄由来単球の単離と静脈注射法。M-CSFとインターフェロンγを用いた培養で高純度単球を大量調製し、心血管研究や側副血管形成研究への応用が可能です。

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この作業は、DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft、ドイツ研究財団)SFB 854(Sonderforschungsbereich、共同研究センター)の支援を受けました。 
技術サポートを提供してくださったHans-Holger Gärtner氏、Audiovisuelles Medienzentrum、Otto-von-Guericke大学マクデブルク、マクデブルク、ドイツに感謝します。

この研究は、動物保護（24D-9168.11から1/2008から24）のためのドイツ法第8に従って、ザクセンとザクセン=アンハルト、Regierungspraesidiumドレスデン/ハレの国の許可を得て実施した。 1細胞の単離 1.1大腿骨と脛骨の調製を<ol><li>閉じたビンにイソフルランを気化させることにより、5％イソフルラン濃度を用いて、マウスを麻酔。マウスは3秒間移動を停止した後、頚椎脱臼を行う。 </li><li>エタノール（96％）で後肢を消毒する。皮膚や筋肉を取り出し、無菌のメスで骨を分離する。 <ol><li>鼠径皮膚切開を開始し、内果に向かって切開を延長し、下の子牛の周りの皮膚の円形切開を行う。近位にそれを剥離することにより、完全に足の皮膚を削除します。 </li><li>鋭いメスで大腿骨から大腿四頭筋を切り離し、前方腓骨の両方を削除と腓腹筋グループと靭帯を探し、解剖によって股関節で足をdisarticulate。 </li><li>前方に起動して、慎重に足を回転させ、靭帯を横に切開することにより、関節を中心に進んで、それによってジョイントをdisarticulating。 </li></ol></li><li>洗浄大腿無菌細胞調製を保証する90秒以上96％エタノールで脛骨。残りのエタノールを洗い流すために滅菌PBSで洗浄プロセスを続行します。 注：すべてのその後の工程は、汚染を避けるために無菌でなければならない。 </li></ol>骨髄の1.2収穫<ol><li>大腿骨と脛骨のシャフトへのアクセスを得るために細かいハサミで各骨の近位端および遠位端をカットします。これらの骨は非常に簡単に壊れているため、このステップには注意してください。 </li><li>温かい培地で骨をフラッシュする（M199 + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。無菌の28-G針、1ミリリットルの注射器、10〜15 mlの培地あたりの間に使用しますすすぎのための骨。 </li><li>細かい鉗子で骨を持ち、それが半透明に変わるまで一つ一つをすすぐ。注意深く細胞ストレスを最小にするために、シリンジプランジャの端部に圧力を加える。 </li><li> 70μmのナイロンウェブを通じて骨髄を濾過し、ろ液を集める。骨髄の最大量を抽出するために、遠位端と近位端から繰り返しすすぐ。 </li><li> PBSでふるいをすすぎ、ろ液を集める。慎重に穏やかに撹拌し、ピペッティングにより破片や携帯コングロマリットを取り除く。 </li></ol> 1.3栽培<ol><li> RTで10分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。上清を捨て、約25ミリリットルの培地で細胞を懸濁します。一回繰り返します。 </li><li>第2洗浄工程の後に培地6mlの中に細胞を再懸濁する。パンブルーの50μlの細胞溶液50μlを混ぜる。光学顕微鏡下で計数チャンバー内の細胞を数える。数cを計算するこの式を使用して、溶液中のエル： <img alt="式1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li>プレートの底に永久的な付着を防止するために、6ウェルの超低取付面板上に細胞を播種する。ウェルあたり最大6 mlの1mlあたり10 6細胞の濃度を使用してください。 </li><li>細胞分化を促進するために20ng / mlのM-CSFとの懸濁液を補う。 </li><li>培養物を37℃で5日間、細胞を、5％の二酸化炭素とを毎日観察する。 </li></ol>細胞の1.4収穫注：これらの手順は、氷上で行われるべきである。それに応じて1.4.1または1.4.2のどちらかに進みます。 <ol><li>この時点で、彼らは、超低取付面板であっても、培養プレートに付着する分化したマクロファージを含む、全体の培養を収穫する。 <ol><li>穏やかなピペッティングにより全体の文化を収穫し、4℃、PBの溶液で脱着S、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA。わからない場合には、顕微鏡下で確認する - プレートが接着細胞を残りの明確になるまで繰り返します。 </li></ol></li><li>別の方法として、主に単球が含まれている懸濁液中の細胞と上清を収穫することにより、接着性マクロファージを捨てる。 <ol><li> EDTA非含有PBS溶液と0.5％BSAと非接着細胞を回収。穏やかに付着したマクロファージを追い出し避けるためにあまりにも多くの力を加えないでください。 </li></ol></li></ol> 1.5 FACS-解析（オプション） 注：これは、MACSを用いてCD117 +ステムおよび前駆細胞の細胞懸濁液を枯渇させることが可能である。この手順については、製造元のプロトコルを使用してください。 <ol><li>どちらかが1.4.1または1.4.2の手順に従って、細胞を採取する。 </li><li> 4℃で10分間250×gで細胞を遠心して、もう一度この手順を繰り返します。 </li><li> FACS bの300μlの中に再懸濁し、少なくとも250,000細胞プローブあたりuffer。 </li><li> 96ウェルプレート（ウェルあたり30μL）の上に細胞溶液を転送します。 </li><li> 4℃で5分間250×gで細胞懸濁液を遠心します。 </li><li>上清を除去し、各ウェル（使用メーカー希釈）に対する抗体の25μlを添加する。 </li><li>抗体と細胞（1.5.1-1.5.6ステップ後の細胞表現型のために製造業者のプロトコルを以下のように染色。単球/マクロファージの同定のために一般に使用されるマーカーは、CD11bの、F4 / 80（ 図3）、CD115（図2）、およびGR-を含む1。 注：セル·ソリューションのさらなる説明については、CD4、CD8a、のCD11c、CD25、CD45、CD45R、CD62L、CD80、CD86、CD145、CD117、MHCⅡ、Ly6C、Ly6G、およびCD192のようなマーカーの使用が推奨されます。細胞の特徴は、以前に12を説明した。 </li><li> 4℃で20分間、プローブをインキュベートする。 </li><li>遠心機で4℃で5分間250×gでプローブし、FACS緩衝液200μlに再懸濁とは目を繰り返しますステップの2倍である。 </li><li> FACSチューブにプローブを転送し、FACS分析12を行う。 </li><li>細胞分化を分析するために、0日目、3及び5にFACS分析12を実行する。 </li></ol> 2.尾静脈注射 2.1準備<ol><li>約10分間37℃で加熱板上で動物を暖める。過熱の兆候を認識するために温めながら、動物を観察します。 </li><li> NaClを150μlの中で、ステップ1.1〜1.4で孤立し、単球を再懸濁し、30Gの針を1ミリリットルのインスリン注射器に細胞をロードします。軽くすべての球が注入されるように、注射器をロードする前に解決策をボルテックス。常に熱媒介アタッチメントと単球の活性化を避けるために、氷上で細胞を処理します。 </li></ol> 2.2保全処分<ol><li>静脈内注射のためのマウスを選択する際にケージ内の他のマウスを乱すことは避けてください。 </li><li>制止にマウスを置きます。あまりにも多くのPRを避けるessureと後肢に注意してください。 （ 図4） 注：または、動物のストレスのないハンドリングを保証するために全身麻酔を使用しています。 </li><li>マウスが制止を閉じる前に、呼吸のためのスペースがあることを確認してください。 </li></ol> 2.3インジェクション<ol><li>消毒剤と、注射部位を消毒する。マウスの尾にスプレーし、少なくとも1分間放置。 </li><li>静脈の視認性のために、注射部位の上に外側尾側に緩やかな圧力を加えることにより、尾の静脈血の流れを止める。 </li><li>注射の前に、尾を90度回します。 （ 図5） </li><li> 45度の角度で注入する。動物に害を避けるために、ゆっくりと何グラムあたり5μL以上の注入ません。 </li><li>失敗した注射のサインですブリスターがある場合は、すぐに中止し、より近位に注射を繰り返します。 </li><li>穏やかなページを適用することにより、射出側の出血を止める約1分間の案内圧力スイッチ。 </li><li>手順の最後に、リトラクターを開き、そのケージにマウスを置く。 </li><li>動物が注射によって害されませんでしたし、胸骨の横臥が維持されることを保証するために20分間、マウスを観察します。マウスが十分な意識を取り戻すまで、観測の時間を延長します。それは完全に回復した後にのみ、他の動物の会社にマウスを返します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

我々は、骨髄由来のマウスの単球を大量に単離するための単純で費用効果的な方法を記載する。 1.4×10 6の単球収率5を得た末梢血を使用して、他のプロトコルと比較して、我々は、単一のドナーマウスから11×10 6±3×10 6単球のより高い収率を得ることができる。 この方法の課題を考慮した場合、非無菌条件下で作業する場合には、汚染の可能性を言及することが重要である。すすぎ後の洗浄工程が適切に従わない場合は、細菌および真菌による汚染可能性が高いです。さらに、骨髄は顆粒球、リンパ球および赤血球系細胞を含む不均一な細胞懸濁液、で構成されています。通常、これらの細胞は、増殖因子の欠如のために2日培養の3との間に消える。成長因子駆動型分化した後、マクロファージは、汚染の主な原因である。トンを維持するためにマクロファージへの単球の分化を最小限に抑えるために、低およびマクロファージの彼数は、超低付着性プレートと、上述した洗浄工程の使用が重要である。 これは、排他的に単球に特異的...

単球の単離は、多くのin vitroおよびin vivo研究にとって重要かつ重要です。これらの細胞は、末梢動脈疾患、冠状動脈性心疾患、またはその他の虚血性疾患などの疾患の標的となります。これは、側副血管の成長が局所的な炎症によって強く引き起こされるためです。炎症反応には、内皮の活性化と白血球(主に単球)の局所的な動員が含まれ、その後、マクロファージに成熟し、複数の成長因子を分泌して細動脈の機能的な側副動脈へのリモデリングを誘導することにより、動脈形成性の高い環境を作り出します1-3。また、単球は樹状細胞に成熟し、免疫学的研究4,5やがん研究6,7に頻繁に使用されます。
末梢血からの単球単離のアプローチで問題となるのは、ほとんどの分析で十分な量の単球を生産するために必要なドナー動物の数が多いことです。以前のプロトコルでは、単球を単離する際のMACS9による密度勾配遠心分離や細胞枯渇などの方法が説明されています。しかし、これらの技術は単球の特性と機能性を変化させる可能性があり、解釈が困難になる可能性があります10,11。さらに、これらの方法は難しく、実験の再現性を低下させる可能性があります。
このプロトコルの目的は、骨髄由来の単球を大量に生成するためのシンプルで費用対効果の高い方法を提供することです。このプロトコルによって得られる11 x 106 ± 3 x 106細胞の高い細胞収量により、骨髄由来単球の単離中に必要なマウスの数を大幅に減らすことができる。この手順は、最小限の時間で完了でき、上記のような高価で複雑な手法を使用せずに完了できます。ここでは、ドナーマウスの天然骨髄懸濁液から単球を抽出し、超低付着プレート上で懸濁液を培養し、溶液に20 ng/ml M-CFSを添加します。インキュベーションの5日目に、細胞を採取し、機能的および表現型の特性を確認するために特徴付けます。
動脈形成の分野での実験では、これらの骨髄由来の単球をマウスに静脈内移植することは、全身的な薬物送達の効果的な方法であり、一般的な末梢動脈疾患モデルで大腿動脈結紮と組み合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>6ウェル超低アタッチメントプレート</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td>6ウェル超低アタッチメントプレート, キャップ付き, 無菌</td></tr><tr><td>8-12週齢, オス, balb/c マウス&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue dead cell stain</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>GE Healthcare, Freiburg, Germany</td><td></td><td>Fraction V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>28G,30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>キャップ付き, 滅菌</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td><td></td><td>Allegra&reg;X-15R遠心分離機</td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet、マンハイム、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剤</td><td>Sch&uuml;lke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>使い捨てメス No.10&nbsp;</td><td>羽毛安全カミソリ Co.Ltd、大阪、日本&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%&nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml;cken、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抽出ユニット Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml;te GmbH &Co.KG、エバーシュタット、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4 / 80</td><td>AbD Serotec、D&uuml;ドイツ sseldorf</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>FACSバッファ&nbsp;</td><td>単一コンポーネント</td><td></td><td>PBS、0.5%BSA、0.1%NaN3</td></tr><tr><td>FACSデバイス</td><td>Becton、Dickinson and Company、Franklyn Lakes、ニュージャージー州、米国</td><td></td><td>BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACSチューブ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; ピペット</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine ps,</td><td>Rubis, Stabio, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>R&ouml;sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングプレート&nbsp;</td><td>Labotect GmbH、G&ouml;ttingen, ドイツ&nbsp;</td><td></td><td>ホットプレート062</td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーEwald Innovationstechnik GmbH、バート・ネンドルフ、ドイツ</td><td></td><td>、Incu安全</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Baxter Deutschland GmbH、Unterschlei&szlig;ハイム、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH、オーバーコッヘン、ドイツ</td><td></td><td>軸方向40 >C</td></tr><tr><td>マクロファージコロニー刺激因子</td><td>Sigma Aldrich, ハンブルク, ドイツ</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp;region=DE">SRP3110&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>機械式加振機</td><td>IKA、シュタウフェン、ドイツ</td><td></td><td>ms2 ミニ加振機</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH、Pasching、オーストリア</td><td></td><td>37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>マイクロ試験管</td><td>Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微生物学的作業台</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>単球洗浄緩衝液&nbsp;</td><td>単一成分</td><td></td><td>PBS、0.5%BSA、2 mM EDTA</td></tr><tr><td>マウス拘束装置</td>で私たちのグループによって製造されました <td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG、ベルリン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (ナトリウム酸)</td><td>シグマアルドリッチ、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー計数室</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml;nigshofen、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr>ナイロン<td>cellsieve</td><td>Becton、Dickinson and Company、Franklyn Lakes、ニュージャージー州、米国</td><td></td><td>細胞ストレーナー、70 & マイクロ;mメッシュサイズ</td></tr><tr>ペ<td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>シグマアルドリッチ、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>ライフサイエンステクノロジーズGmbH、ダルムシュタット、ドイツ</td><td></td><td>pH 7.4、滅菌</td></tr><tr><td>ピペットエ</td><td>ッペンドルフAG、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td>10&micro;L / 100&マイクロ;L / 200&マイクロ;l / 1,000&micro;l</td></tr><tr><td>ピペッティングヘッド</td><td>Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>吸引ユニット</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Germany</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>1 ml Omnifix&reg; -F インスリン注射器</td></tr><tr><td>キャップ付きチューブ</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>15 ml/50 ml Cellstar tubes</td></tr><tr><td>Warm water bath</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

白血球の亜型およびマクロファージの祖先として、単球は生物の多くの重要なプロセスに関与しており、生物医学のさまざまな分野の主題としてよくあります。以下に述べる方法は、不均一な骨髄からマウス単球を単離するための簡単で効果的な方法です。
Balb/cマウスの大腿骨と脛骨からの骨髄は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でフラッシングすることによって採取されます。細胞懸濁液にはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加し、接着による単球の分化を避けるために超低接着面で培養します。単球の特性および分化は、様々な間隔で特徴付けられる。表現型解析には、CD11b、CD115、F4/80などのマーカーを用いた蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が使用されます。培養終了時には、懸濁液は45%±12%の単球からなる。接着性マクロファージを除去することで、純度を最大86±6%まで高めることができます。単離後、単球はさまざまな方法で利用することができ、in vivo送達の最も効果的で一般的な方法の1つは、静脈内尾静脈注射です。
この単離と応用の技術は、特に炎症や免疫学の分野でマウスモデル研究にとって重要です。単球は、マウス疾患モデルでも治療に使用できます。

マウス骨髄から抽出された細胞溶液は、様々な細胞型から成る。主要な細胞型は、リンパ球、顆粒球及び単球である。細胞型は、分化の5日後に採取し、ネイティブ懸濁液および細胞については、図1に示されているサイズおよび粒度によって推定することができる。培養中のシフト細胞組成に注意してください。しかし、集団の正確な分類は、細胞マーカーの特徴的な表現に依存しなければならない。 MPS-系の細胞を同定するために使用される最も重要なマーカーは、M-CSF受容体として機能し、特に単球前駆細胞、単球およびマクロファージ上に発現されるCD115である。したがって、独特のMPS-サブセットを識別するために使用されないかもしれないが、確実に、単球/マクロファージ分化に打ち込ま細胞の絶対量を推定することができる。異なる中のCD115発現をタイムラインについては、図2を参照してくださいentiation。 成熟マーカーF4 / 80は、若年性単球、成熟した単球、およびマクロファージを区別する...

ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

こんにちは。私はヘレン・クスターです。マクブーにあるオート・ヴィカ大学のハロルド博士の心血管研究グループで研究を行っています。私たちは、側副血行路の成長を促進する担体として利用するため、海産単球の分離と特性解析に関心を持っています。骨髄由来単球の培養には、主に以下の手順が必要です。まずマウスの麻酔と頚椎脱臼を行い、次に大腿骨の摘出と洗浄を行います。骨髄の3回目のろ過。4回目から培地による洗浄工程。5回目、超低接着プレートでの細胞培養。6回目、フローサイトメトリー。骨髄から単球を抽出するため、マウスをイソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により安楽死させます。マウスを固定し、滅菌メスを用いて両後肢を分離します。大腿骨と脛骨の両方を採取し、96% ethanolで少なくとも90秒間洗浄します。その後、コンタミネーションを防ぐため、すべての工程を厳格に無菌状態で実施する必要があります。骨から筋肉や腱を除去します。大腿骨と脛骨を温めたPBSで数回洗浄します。骨髄を採取するため、各骨の近位端と遠位端を精密鋏で切断します。骨を洗浄するため、28 Gのステリール針1本、1 mLシリンジ1本、および骨1本あたり10～15 mLの培地を用意します。その後、精密ピンセットで骨を保持しながら、骨髄を70 µmのフィルターでろ過します。骨が透明な状態になるまで、1本ずつ洗浄します。細胞へのストレスを最小限に抑えるため、シリンジのプランジャーを慎重に押し下げてください。その後、サイトをPBSで洗浄します。その後、細胞を室温で 250 G、10 分間遠心分離します。そして、培地で再懸濁させます。この工程の後、同じ手順をもう一度繰り返します。天然の骨髄由来の骨髄単球には、1% penicillinおよびstreptomycin、ならびに10% fetal calf serumを添加したM 199を使用します。さらに、培養初日に20 ng/mLのM-CSFを添加します。培養最終日には、培地に8 ng/mLのinterferon gammaを添加します。MHC class IIのアップレギュレーションを目的とする場合は、底面への恒久的な接着を防ぐため、深穴の超低接着プレートに細胞を播種します。細胞濃度は1×10⁶ cells/mLとし、1ウェルあたり最大6 mLまで使用します。培養期間は5日間で、温度37°C、5% CO2の条件下で行います。細胞は毎日確認し、5日後に細胞の60〜80%が単球になったことを確かめます。私はオート・ファンガイ大学の循環器科、心臓血管外科、および時間生物学部門で医学を学ぶ学生のマーティン・バフナーです。静脈内注射を行う際は、適切に単球を投与できるよう、事前に十分な練習を積むことが重要です。実験により、単球は全身投与した際に心原性心欠損の改善に最も効果的であることが示されています。全身的な薬物投与の一般的な方法は、尾静脈注射です。本手法では、塩化ナトリウムで再懸濁した250万個の単球を注射します。マウスの尾には、腹側と背側に4本の動脈、および外側に2本の静脈があります。そのため、WA投与を行う際は、尾を約90度回転させる必要があります。手技を容易にするため、マウスをヒートパッドで約10分間温めておいてください。動物は保温しながら観察する必要があります。これは、オーバーヒートの兆候を認識するために重要です。さらに、この感染剤と、1 mLインスリン用注射器に取り付けた30Gの針セットが必要です。動物を保定器に注意深く固定します。これにより、尾静脈への注射が非常に容易になります。シリンジに溶液を充填する前に、マウスが十分な呼吸スペースを確保していることを確認してください。すべての単球を確実に注入できるよう、単球溶液をボルテックスで攪拌します。感染を防ぐため注入部位を消毒し、親指と人差し指で尾を保持します。最も末端の点に、針を浅い角度で刺入します。静脈内に配置されていれば、単球溶液を非常に容易に注入することができます。水疱が生じた場合は、注入方法が不適切であるサインです。直ちに中止し、再度試みてください。近位部への注入は、常にゆっくりと行い、1gあたり5µLを超えないようにしてください。注射が成功した場合は、注射部位を約1分間軽く圧迫して止血します。処置の終了後、リトラクターを開き、モノサイトを特性評価するためにマウスをケージに戻します。ここでは、CD 11 B、F four 80、CD 115、およびGL oneという抗原の組み合わせを用いて評価を行います。これらの抗原の発現は、単球を分析するための分化段階と相関しています。0日、3日、5日、および7日に確認したところ、単球の純度は5日目まで上昇し、最大90%に達しました。この純度を達成するには、強く接着するマクロファージを除去することが重要です。EDTAフリーの洗浄バッファーを用いて、非テリン細胞を除去します。テリン細胞を除去するために、EDTA含有洗浄バッファーと緩やかなピペッティングを使用します。この図は、テリン培養における主要な細胞型を示しています。示されている異なる細胞型は、1：リンパ球、2：単球、3：顆粒球であり、培養5日目以降に単球の純度が増加しています。培養中の細胞組成の変化に注意してください。細胞集団には、1：単球および2：マクロファージが含まれます。図2、分化過程におけるCD 115発現のタイムライン。分化開始から5日後には全細胞の95%以上がCD 115陽性となっており、大多数の細胞が単球またはマクロファージであることを示している。細胞のサイズや顆粒性に基づいて分類することも可能だが、特異的な細胞マーカーを用いる方がより信頼性が高い。図3、単球・マクロファージ成熟に伴う発現の増加。マーカー F4/80、5日目：単球の表現型と一致する、中程度の F4/80 発現を持つ集団の出現に注目してください。7日目：マクロファージの成熟と一致する、F4/80 発現の右方シフトに注目してください。単球の分離は、多くのin vitroおよびin vivo研究において不可欠です。これらの細胞は、例えば虚血に関連する末梢動脈疾患や冠動脈疾患などの疾患において、興味深い標的となります。バイオプシーマウスの大腿骨および脛骨から骨髄を採取し、温めた培地で骨をフラッシングして回収します。細胞懸濁液にMCSFを添加し、単球の接着誘発分化を避けるため、超低接着表面で培養します。単球の特性と分化は、CD 11 b、CD 115、F4/80などのマーカーを用いて、異なる時期および条件下で確認し、細胞のフェノタイプを判定します。全身的な薬物投与を目的とする場合、静脈内注射は簡便かつ効果的な手法です。本稿では、骨髄から大量のMI単球を簡便かつ費用効率良く単離する方法について解説します。この新しい手法を用いることで、マウス1匹あたり約11 millionの単球を得ることが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶマウス骨髄由来単球の単離と静脈注射法。M-CSFとインターフェロンγを用いた培養で高純度単球を大量調製し、心血管研究や側副血管形成研究への応用が可能です。

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

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