単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射
2014年12月27日
ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。
こんにちは、私の名前はヘレン・クスターで、ハロルド博士の心臓血管研究グループで働いており、MacBookのオートビカ大学の教授です。私たちは、付随的な血管成長におけるビヒクルに使用するための海洋単球の単離特性評価に興味を持っています。骨髄由来単球の培養、最初のマウス麻酔と頸部脱臼、2番目の抽出と大腿骨のすすぎには、次の主要なステップが必要です。
骨髄の3回目の濾過。第4に、第5に培地で洗浄ステップを行い、超低接着プレート上で細胞を培養します。6回目のフローサイトメトリー。
骨髄から単球を採取するために、マウスはISOフッ素を用いて麻酔をかけ、頸部脱臼により安楽死させます。マウスを固定し、ステロイドメスで両下肢を分離します。大腿骨と脛骨の両方を採取し、96%イーサンエタノールで最低90秒間洗浄しました。
この後、汚染を避けるために、すべてのステップは厳密に無菌でなければなりません。筋肉や腱が骨から取り除かれます。大腿骨と脛骨を温かいPBSで数回すすぎます。
骨髄を採取するために、各骨の近位端と遠位端を細いハサミで切断します。骨をすすぐためには、ステロイド28Gの針が1本、1ミリリットルの注射器が1本、1ミリリットルの注射器が1本、骨ごとに10〜15ミリリットルの媒体が必要です。その後、骨髄は細い鉗子で骨を保持しながら、70マイクロメートルのSを介してろ過されます。
骨が錯覚するまで、骨を1つずつすすぎます。細胞のストレスを最小限に抑えるために、シリンジのスタンプに慎重に圧力をかけます。シートをPBSですすいでください。
その後、細胞を室温で250Gで10分間遠心分離します。そして、レウスはミディアムで懸濁されていますか?この手順の後、手順をもう一度繰り返します。
天然の骨髄由来の骨髄由来単球には、M 199と1%ペニシリン、ストレプトマイシン、10%胎児咳嗽血清を使用します。さらに、初日に1ミリリットルあたり20ナノグラムのINE MCSFを追加します。1ミリリットルあたり8ナノグラムの干渉ガンマを培養の最終日に培地に加えます。
MHC 2のアップレギュレーションが望ましい場合、細胞は厚いウェルを備えた超低接着プレートに播種され、底部への永久的な接着を防ぎます。10〜6セル/ミリリットルの濃度を1ウェルあたり最大6ミリリットルで使用します。栽培期間は37度、二酸化炭素5%の温度で5日間です。
細胞は、細胞の60〜80%が単球である間、5日後に毎日チェックされます。私の名前はマーティン・バックナーで、ここオート・ファンギ大学の心臓病学・アノロジー・年代学部門の医学博士です。また、静脈注射を行うときは、単球を適切に適用できないため、行う前にたくさん練習することが重要です。
実験によると、単球は全身に適用した場合に芸術の無形成を改善するのに最も効果的であることが示されています。全身薬物投与の一般的な方法は、テールWA注射です。私たちの場合、250万個の単球を注入し、再懸濁して塩化ナトリウムを注入します。
マウスの動脈の尾部には腹側と背側の4つの血管があり、外側には2つの衰退があります。ですから、WAインジェクションでは、テールを約90度回す必要があります。手順を簡単にするために、マウスを加熱パッドを使用して約10分間温める必要があります。
動物は温暖化によって観察されるべきです。これは、過熱の兆候を認識するために重要です。さらに、この感染剤と、1ミリリットルのインスリン注射器にセットされた30遺伝子の針が必要です。
動物をレストレインに慎重に固定すると、尾の方法に注入するのがはるかに簡単になります。溶液をシリンジにロードする前に、マウスが呼吸するための十分なスペースを確保していることを確認してください。.ボルテックス、すべての単球を注入できることを確認するための単球溶液。
感染を避けるために注射部位を消毒し、強打と人差し指の間に尻尾を取ります。最も遠位の点では、針は平らな角度で挿入されます。静脈内に入れれば、単球溶液を注入するのが非常に簡単です。
水ぶくれがある場合は、間違った注射の兆候です。すぐにやめて、もっと試してみてください。近位では、常にゆっくりと、グラムあたり5マイクロリットル以下で注射するようにしてください。
注射が成功した場合は、約1分間穏やかな圧力を加えることで、注射部位の出血を止めます。手順の最後に、リトラクターを開き、マウスをケージに入れて単球を特徴付けます。この効果は、CD 11 B、F four 80、CD 115、GL oneなどの抗原を組み合わせて使用します。
これらの抗原の発現は、単球を解析するための発生段階と相関しています。0日目、3日目、5日目、7日目に事実を調べたところ、単球の純度は5日目に最大90%増加しました。その純度を達成するためには、テリンマクロファージを強く枯渇させることが重要です。
非テリン細胞は、EDTAフリーの洗浄バッファーを使用することで枯渇します。テリン細胞を枯渇させるために、ウォッシュ、バッファー、ジェントルpペッティングを含むEDTAを使用しています。この図は、それらの一末端培養の主な細胞タイプを示しています。
示されているさまざまな細胞タイプは、1つのリンパ球、2つの単球、3つの顆粒球であり、5日目以降に単球の純度が増加します。そして文化。なお、培養細胞集団中の移動細胞組成には、1つの単球と2つのマクロファージが含まれる。
図2は、分化時のCD115発現のタイムライン。全細胞の95%以上が分化後5日後にCD115陽性であり、細胞の大部分が単球またはマクロファージであることを示しています。分類は細胞のサイズと粒度に基づいて行うことができますが、特定の細胞マーカーの方が信頼性が高いです。
図3、単球マクロファージ成熟度の発現の増加。マーカーF four 80、5日目は、単球表現型と一致する中間のF four 80発現を持つ集団の出現に注意してください。7日目は、マクロファージの成熟と一致するF 4 80発現の右シフトに注目してください。
単球の単離は、多くのin vitroおよびin vivo研究にとって非常に重要です。これらの細胞は、例えば、虚血に関連する末梢動脈疾患や冠状動脈性心臓病などの疾患に関連して、興味深い標的です。FEMAからの骨髄と生検マウスの脛骨は、温かい中細胞懸濁液で骨を洗い流すことによって採取され、MCSFが補充され、接着が引き起こす単球の特性の分化を避けるために超低付着面で培養されます 特性と単球の分化は、異なる時間にチェックされ、CD 11 b、CD 115、FO 80などのマーカーで事実が細胞の表現型に使用されます。
全身的な薬物送達が望ましい場合、静脈内注射はそのための簡単で効果的な方法です。骨髄から大量のMI単球を簡単かつ費用対効果の高い方法で単離する方法について説明しました。この新しい方法により、マウスあたり約1,100万個の単球を生成することができます。
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概要
この記事では、骨髄の多様性から大量のマウス単球を生成するためのプロトコルを提示し、動物の実験を減らし、コストを抑えることを目指しています。この方法は、心血管研究における応用を目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 心血管研究
- 細胞生物学
背景
- マウス単球の分離と特徴づけは研究にとって重要です。
- 現在の方法は、高いコストと動物使用に関する倫理的懸念を伴うことがよくあります。
- この研究は、より効率的なプロトコルを提供することを目指しています。
- 単球は血管の成長と修復に重要な役割を果たします。
研究の目的
- 単球を分離するためのコスト効果の高い方法を開発する。
- 研究における動物の犠牲を最小限に抑える。
- 側副血管の成長の研究における単球の使用を促進する。
使用した方法
- マウスの麻酔と頚部切断。
- 大腿骨の抜取とすすぎ。
- 骨髄のフィルタリング。
- 培地による洗浄と超低接着プレートでの培養。
主な結果
- このプロトコルは単球の大量生成に成功しました。
- MACSのような高価な方法への依存を減らしました。
- 応用のための実現可能性を示しました。
- 心血管生物学の研究を強化する可能性があります。
結論
- この新しい方法は単球の分離に効果的です。
- 倫理的懸念に対応し、コストを削減します。
- 血管生物学のさらなる研究への道を開きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation of murine bone marrow-derived monocytes enables mechanistic studies in vascular biology and immunology, supporting target validation in inflammation and ischemia models. The method provides a scalable, cost-effective source of primary immune cells for preclinical de-risking of therapeutic hypotheses. Intravenous delivery facilitates systemic evaluation of monocyte function in disease models relevant to cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of monocyte-mediated pathways in vascular growth and repair.
- Operational Value: Provides a reproducible source of primary monocytes for hypothesis testing in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields phenotypically defined monocytes (CD11b+, CD115+, F4/80+) for functional assay development.
- Operational Value: Supports standardized cell preparation for consistent compound screening in immune modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of monocyte therapeutics in murine models of peripheral arterial disease and coronary heart disease.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of monocyte differentiation via flow cytometry markers across culture timepoints.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery workflows by supplying validated monocytes for target engagement studies, with downstream utility in lead identification and preclinical validation of immunomodulatory candidates.
- Discovery Biology: Enables functional testing of monocyte roles in angiogenesis and inflammation pathways.
- Screening: Delivers standardized, suspension-cultured monocytes suitable for high-content phenotypic screening.
- Analytics: Generates quantitative flow cytometry data (CD11b, CD115, F4/80) to assess purity and maturation state.
- Translational Research: Connects in vitro monocyte characteristics to in vivo behavior following intravenous delivery in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, low-cost platform for generating monocytes across multiple projects in immunology and cardiovascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in monocyte-dependent disease models through defined cellular inputs.
- Operational Value: Eliminates need for expensive separation technologies via simple adherence-based enrichment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing physiologically relevant cells for target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of monocyte-targeted therapeutics through reproducible model systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow harvest and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to flow cytometry for phenotypic validation and sorting.
- Necessitates standardization of M-CSF supplementation and culture duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or disease models.
- Limited by monocyte yield variability and the need to remove adherent macrophages for higher purity.
