可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

この手順の全体的な目標は、P BMCによるサイトカイン分泌と標的細胞の死滅に対するタバコ製品の調製の影響を評価することです。これは、最初に培養されたP BMCを全煙状態、培地またはニコチンで処理し、次に処理したp BMCの細胞内染色を行ってサイトカイン産生を決定することによって達成されます。あるいは、CFSE標識K 5 62細胞は、全煙馴化培地処理PBMCエフェクター細胞と共培養され、K 5 62細胞の生存率は7つのAおよびd染色によって適格化されます。

最終的に、可燃性たばこ製品調製物がいずれかのアッセイからP BMCに及ぼす影響は、フローサイトメトリーによって測定されます。当社の技術や既存の方法(クロム放出アッセイやALIスポットなど)の主な利点は、当社の方法がハイスループットで非放射性であり、細胞の機能を測定できることです。ただし、この方法は、たばこ製品製剤の生物学的影響についての洞察を提供することができます。

また、PBMCエフェクター細胞のtolike受容体媒介性およびSTIC機能に影響を与える他の化合物の評価にも適用できます 染色手順を開始する前に。全煙状態、中程度、ニコチンを記載されている濃度で希釈します。RPMIでは、96ウェルプレート内のウェルあたり100マイクロリットルの総容量まで、中程度から総容量が得られます。

次に、100マイクロリットルのP BMCを、ウェルあたり6つのセルに1×10の濃度で完全な培地に懸濁し、ウェルあたり合計200マイクロリットルの量を加えます。次に、プレートを覆い、摂氏37度、CO25%でインキュベートします。3時間後、細胞を洗浄し、上清を吸引します。

次に、プレートを再度覆い、ボルテックスしてペレットを解離させます。細胞をさらに2回、1回は氷冷ランニングバッファーで、1回は2回目の洗浄後に完全な培地で洗浄します。ゴルジプラグとLPSを補給した完全な培地のウェルあたり200マイクロリットルで、摂氏37度と5%CO2で6時間処理します。

次に、細胞を氷冷ランニングバッファーで洗浄し、20分後に摂氏4度でウェルあたり100マイクロリットルの細胞固定液で処理し、氷冷パーマ洗浄で細胞を3回洗浄します。次に、各ウェルに45マイクロリットルのサイトパーマを加え、続いてリストされた各抗体の5マイクロリットルを追加します。摂氏4度で30分後、細胞を3回洗浄し、200マイクロリットルの氷冷、2%パラホルムアルデヒドで固定します。

次に、細胞を12 x 75 mmチューブに移し、フローサイトメーターでサンプルを分析します。ちょうど示したようにpbmcを扱ったタバコ製品のプレートを準備した後、10ミリリットルのDPBSで80%coの流暢さで収穫したK 5 62細胞の培養物を洗浄する。レザス。ペレットを5ミリリットルのDPBSに懸濁し、細胞をカウントします。

次に、調製したばかりのCFSE作業溶液1ミリリットルを、1ミリリットルの完全培地中の7番目のK 5 62細胞に1〜2回10回加え、ボルテックスにより細胞染色を分散させます。ちょうど2分後に細胞を室温でインキュベートし、200マイクロリットルのFBSを加えて細胞を再度ボルテックスし、さらに2分間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、10ミリリットルの完全培地で細胞を洗浄し、次にペレットをさらに10ミリリットルの完全培地に再懸濁して細胞をカウントします。

次に、タバコで処理したp BMCを遠心分離し、上清をデカントします。次に、カバーを元に戻し、ボルテックスして細胞を再懸濁し、ウェルあたり200マイクロリットルの完全な培地で洗浄します。殺傷アッセイを開始するには、CFSE標識K 5 62細胞をpbmcに1対15の比率で添加し、共培養物を摂氏37度および5%CO2でインキュベートします。

5時間後、細胞をスピンダウンし、上清を捨てます。ペレットをボルテックスして懸濁し、次にウェルあたり200マイクロリットルのランニングバッファーで細胞を洗浄し、次に95マイクロリットルのランニングバッファーを追加し、続いて7つのAとdの5マイクロリットルを追加して、ウェルあたり100マイクロリットルの総量にします。最後に、細胞を暗所で室温で15分間インキュベートします。

次に、各ウェルに100マイクロリットルのランニングバッファーを追加し、全ボリュームを適切な対応するファックスチューブに移して、7つのa、a、D、およびCFSE陽性セルの割合を決定します。フローサイトメトリー解析により、全煙調整培地で24時間後に細胞死の用量依存的な増加が観察され、ウマのニコチン単位1ミリリットルあたり4マイクログラムで細胞がほぼ80%死滅しました。しかし、p BMCをわずか3時間処理しても、24時間で全煙調整培地の馬ニコチン単位1ミリリットルあたり5マイクログラムでも重大な毒性は生じません。

3000マイクログラム/ミリリットルで治療する前には、3時間後にニコチンの同等の程度は注目されず、ニコチン治療は、全煙状態、培地およびニコチンによる2000ミリリットルあたり2000マイクログラムの濃度治療の前に測定可能な細胞死を引き起こさず、続いてLPSによるTLR4受容体の刺激は、分泌されたサイトカインの用量依存的な減少をもたらす。ただし、抑制の程度は個々のサイトカインによって異なります。さらに、細胞をLPSおよびゴルジプラグで簡易ベッド処理しただけで6時間しか経つと、全煙条件培地への曝露後に、ニコチン曝露と比較してウマのニコチン単位濃度が低い場合でも、細胞内サイトカイン陽性細胞の数の減少が観察されます。

実際、この殺傷アッセイの結果は、全煙条件培地の1ミリリットルあたり1.56マイクログラムへの曝露が、対照および低用量濃度と比較して、エフェクターPBMC集団の殺傷能力を有意に低下させることを示しています。一方、高濃度または低濃度でのニコチン治療は、これらの手順を試みている間、エフェクターPBMC集団の殺傷能力を妨げません。CFSEの標識、抗体希釈、標識時間、インキュベーション温度を正確に行うことが重要です。

このビデオを見れば、フローサイトメトリーで抗体標識技術を利用して、たばこ製品の調製物やその他の治療が末梢血単核細胞に及ぼす影響を判断する方法について十分に理解できるはずです。