Name: 可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぼう、可燃たばこ製品がヒト末梢血単核球のサイトカイン産生と標的細胞傷害能力に与える影響を評価する方法。フローサイトメトリーと共培養アッセイを用いて免疫細胞機能を解析し、たばこ暴露の免疫抑制効果を明らかにする。

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この作品は、医学のウェイクフォレスト大学医学部との共同研究契約の下で、RJレイノルズ·タバコ·カンパニー（RJRT）によって資金を供給されている。 GLプラサドはRJRTのフルタイムの従業員である。

注：この研究を行うための書面によるインフォームドコンセントがグッド臨床プラクティスごとに、IRBの承認の下で地元の臨床研究ユニットで得られた。血液の処理は、PBMCおよび他の細胞培養実験の単離は、微生物学的に無菌用品および試薬を用いて、無菌条件下で行われる。 1. WS-CMの準備<ol><li>以前に12を説明したように、WS-CMを生成します。 <ol><li> 35-60-2、溶液にパフボリューム、秒でパフの間隔、及びパフ時間：以下の喫煙レジメンを使用したフェノールレッドを含まない1640培地（RPMI）ロズウェルパーク記念研究所を通じて4 3R4F参照タバコから煙を渡すことで、WS-CMを準備secである。各調製物を20mlのサンプルを生成する。 </li></ol></li><li>日付、時刻完了し、タバコの名前と番号付きラベルチューブ（S）。喫煙が完了した直後にC -80℃で500μlのアリコートに保管してください。 </li><li>凍結されたWSのアリコートを分析以前12に記載のように、ニコチン、タバコ特異的ニトロソアミン、および多環式芳香族炭化水素のレベルを決定する-CM。 </li></ol> PBMCの2の分離<ol><li> （タバコ製品の非消費者である）健康なドナーからの新鮮な血液を収集ウェイクフォレストバプテスト保健IRB 15とは別の承認の下に下記のように新鮮な血液由来のPBMCを分離します。 <ol><li>血液バッグの到着前に、500mlの瓶、はさみ、分離バッファ、及びダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）（RT）、バイオセーフティーレベル2（BSL-2）細胞培養フード中で準備している。分離バッファは、光から保護されなければならない。 </li><li>逆さまに血液バッグを持って、ちょうどそれがチューブの少なくとも3センチ残してクランプされた場所の下にチューブをカット。 </li><li> 500ミリリットルボトルからキャップを外し、ボトルの口の上にチューブを保持する。血液バッグをピックアップし、血液がTにバッグから自由に流れることができるようにそれを反転袋が空になるまで、彼は、ボトル。血液が気泡を作成しないようにまっすぐとして対ボトルの内壁上に流れるようになります。 </li><li>血液の分離バッファの5：1の比率でボトル内に分離バッファを注ぐ。転倒、10回、しっかりとボトルをキャップとそっとそれを反転。室温で1時間、ライトをオフにインキュベートし、細胞培養フードで瓶のままにしておきます。 </li><li>光、麦わら色の層は血の上に構築します。 50ミリリットルコニカルチューブに25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この層を除去する。血液を寄付被写体によって、300mlの - 収集量は50から異なる場合があります。 </li><li> RTで10分間、200×gでチューブを遠心。 </li><li>暗い血色のペレットを残して、半透明の上清を吸引除去する。ペレットはルーズが、粘性になります。 </li><li>ピペットで15ミリリットルコニカルチューブに単離緩衝の3ミリリットル。 </li><li>再懸濁ペレットに、Sに集め麦わら色の液体のすべての50ミリリットルのためにDPBSの20ミリリットルを追加TEP 2.1.5。ボルテックスは完全に混合し、複数の管からの再懸濁した液体を統合する。この液体は、血液細胞を懸濁含ま。 </li><li>トランスファーピペットで、ステップ2.1.8において分離緩衝液3mlに転写懸濁血液細胞を5ml。 2つの別個の層を作成するために、ゆっくりと静かに細胞懸濁液が含まれている15ミリリットルコニカルチューブを傾けます。最小限の加速とブレーキなしの室温で40分間400×gでチューブを遠心。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブにしたPBMCを含む得られた濁った中間層（軟膜）を除去するために、転送ピペットを使用してください。その下に他の明確なレイヤを描画することは避けてください。各50ミリリットルコニカルチューブにせいぜい25ミリリットルを転送します。 </li><li>細胞を洗浄するために（50ミリリットルコニカルチューブの全体の残りの容量を埋めるために、またはそれ以上）の低温のランニングバッファーの25ミリリットルを追加します。 4℃で10分間400×gで細胞を遠心します。 </li><li>ランニング緩衝液10mlのペレットを再懸濁。これはPBMCを含まれています。細胞をカウントし、IMを使用凍結氷の上に置くmediatelyか。 </li></ol></li></ol> 3.凍結とのPBMCを解凍<ol><li>遠心分離機400×gで10分間のステップ2.1.13に回収したPBMCを。 </li><li>製造者の指示に従ってイソプロピルアルコールで冷凍コンテナを埋める。注意：イソプロピルアルコールは可燃性および急性毒性である。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有するRPMI 1640培地（4℃）でペレットを再懸濁する。これは凍結培地RPMI 1640である。約5×10 7細胞/ mlを有するサスペンションをもたらす凍結培地の量でペレットを再懸濁する。凍結のために利用可能な細胞の数が異なります。 </li><li>の2mlクリオチューブに細胞懸濁液の1mlアリコートを分配し、冷凍コンテナにクライオチューブを置き。 O / Nを格納し、クリオチューブを削除し、に格納する転送するために-80℃の冷凍庫にクライオチューブに冷凍コンテナを置きます-190℃〜-150℃の極低温冷凍機。 </li><li>低温貯蔵からのクライオチューブを外し、37℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら急速に解凍。 </li><li>直ちに10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含有する10ミリリットルRPMI 1640完全培地（4℃）にて15mlコニカルチューブにクライオチューブ中で解凍したPBMCを転送する。解凍したクライオチューブの内容物は、最大の細胞生存率15を得ることができる限り速やかに転送されるべきである。 </li><li> 10分間400×gでのPBMCを遠心。 </li><li> 5ミリリットルRPMI 1640完全培地でペレットを再懸濁し、細胞を数える。 </li><li>トリパンブルー排除法のような確立された方法により細胞生存率を測定する。 95％ - 一般に、この方法では、細胞生存率は約90である。 PBMCを今の実験で使用する準備が整いました。 </li></ol> 4.細胞死の決定注：ここに記載されている希釈はこのSTUのためのものでありDY。希釈は、それに応じて変更することができる。 <ol><li>以下に示すように、100μl/ウェルの全体積のRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。 </li><li>以下の濃度にWS-CMを希釈：0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、（WS-CM中のニコチン含有量に基づく）、等のニコチン単位の5μg/ mlの12。 </li><li> 100、200、500、750、1000,2000、および3000 / mlの以下の濃度にRPMI培地中でニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li>よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>本研究の目的のために、上記のようにプレートの二組を準備。プレートを覆い、24時間、37℃で3時間、5％CO 2のための一つのプレートに1つのプレートをインキュベートする。必要に応じて時間点を調整します。 </li&gt; <li>氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li> 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7-アミノD（7AAD）5μlのに続いてバッファを実行しているの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>クラスターチューブにバッファを実行している100μlのを追加します。クラスターチューブ、プレートの各ウェルからの細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性細胞の割合を決定します。 </li></ol> 5. EC 50の決定<ol><li> WS-CMとニコチンのEC 50値は、PBMCの7AAD陽性染色によって決定される。 </li><li> EC 50値は、濃として定義されentrationれる細胞の50％が24時間のアッセイにおいて、もはや生存可能ではなく、値は、等ニコチン単位/ mlのμgのように表現される。 </li><li>この研究の目的のために、EC 50値は、それぞれ、WS-CM及びニコチン1.56 / mlのと1650μgの/ mlであると決定された。 </li></ol> 6.分泌されたサイトカイン注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。 <ol><li> 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。 </li><li>以下の濃度にニコチンを希釈：100、200、500、750、1000,2000、及び3000μg/ mlの。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li>よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間および5％CO 2でインキュベート。 </li><li> 、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスし、最後の氷冷200μlのバッファーを実行し、洗浄工程をもう一度繰り返しで細胞を懸濁して室温で細胞を洗浄。 </li><li> RPMI完全培地200μlを追加し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>各ウェルに10μg/ mlのLPS培地200μlを追加します。 </li><li>プレートを覆い、4時間、24時間、48時間、または37℃で72時間、5％CO 2でインキュベート。必要に応じてインキュベーション時間を調整します。 </li><li> 3分間300×gでプレートを遠心します。 </li><li>ステップ7および8でアッセイを実行するために-80℃の冷凍庫でよく各店舗からの上清175μlをしてください。 </li></ol> 7.サイトメトリービーズアレイアッセイ &lt;OL&gt; <li> ステップ6.10とCBAアッセイでの使用から調製した細胞上清を解凍する。製造業者の指示に従ってサイトメトリービーズアレイ（CBA）アッセイを実行します。 </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> ステップ6.10から細胞上清を解凍し、IL-8 ELISAで使用しています。製造業者の指示に従ってELISAアッセイを実行します。 </li></ol> 9.細胞内染色およびフローサイトメトリー注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。 <ol><li> 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。 </li><li> 2、10、50、100、500、2000、及び4000 / mlの：同じプレートにおいて、以下の濃度にニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性があり、環境にハザルdous。 </li><li> /ウェル1×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。 </li><li>氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>プレートにRPMI完全培地200μlを追加し、洗浄ステップをもう一度繰り返します。 </li><li> RPMI完全培地を使用した2μL/ mlのGolgiPlugの使用濃度および10μg/ mlのLPSを準備し、各ウェルに200μlを添加する。 </li><li> 37℃で6時間、5％CO 2、プレートをインキュベートする。 </li><li>ステップ9.8の終了時に、バッファー（4℃）を実行し、300で回転で細胞を洗浄4℃で3分間XG。 </li><li>各ウェルにのCytofix100μlのを追加し、4℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で3分間300×gで1倍Permwash（4℃）でステップ9.9で説明したように、細胞を3回洗浄する。 </li><li>に以下の抗体の1の各5μlの各ウェルに45μLの1x Cytopermをの追加各ウェル：TNF-α-アレクサフルオロ488、IFN-γV500、MIP-1αPE。 30分間4℃でインキュベートする。 </li><li> 1X Permwash（4℃）、4℃で3分間300×gでバッファー（4℃）を実行していると1時間にステップ9.9で説明したように、細胞を2回洗浄します。 </li><li> 2％パラホルムアルデヒド（4℃）200μlで細胞を再懸濁。 12×75mmのチューブに細胞を移し、フローサイトメーターでサンプルを分析する。注意：ホルムアルデヒドは急性毒性と健康被害、腐食性がある。 </li></ol> 10. K562キリングアッセイ NOTE：K562細胞を増殖されるべきであるRPMI完全培地で37℃、5％CO 2での培養では、それらは、アッセイの前に80％のコンフルエンスに達するまで。 <ol><li>バイアルにDMSOを18μLを追加することによって、スクシンイミジルエステル（CFSE）原液カルボ5 mMのを準備します。 </li><li>各ウェルに対して所望の等ニコチン単位またはニコチン濃度を達成するために、100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li> /ウェル1.5×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地にPBMCの100μlのを追加。 WS-CMまたはニコチンでの細胞の総容積は200μl/ウェルであろう。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。 </li><li>室温で8分間400×gでDPBSと遠心機の10ミリリットルを追加することによって、K562細胞を洗浄。 </li><li> DPBS 10mlの細胞を再懸濁し、K562細胞を数える。 </li><li> CFSE workiを準備1ミリリットルのDPBSにCFSEストック溶液1μlを追加することでNGソリューション。 </li><li> 2×10 7細胞- 1を含むK562細胞懸濁液1mlにCFSEワーキング溶液1mlを加える。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。 </li><li>すぐにFBSの200μlを添加する。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。 </li><li> RPMI完全培地の10ミリリットルを加え、室温で8分間400×gでチューブを遠心する。 </li><li> RPMI上清を除去し、ペレットを破るし、RPMI完全培地10mlで細胞を再懸濁し、CFSE標識K562細胞を数える。 </li><li> RTで3分間300×gでプレートを遠心分離することによりPBMCを洗浄する。液体をデカントすることによって、上清を吸引除去する。カバーを取り付け、プレートの底をボルテックス。 RPMI完全培地200μlを加え、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>各サンプルPBMCプレートのウェル、さらに私に：1：15（1.5×10 6のPBMC10万K562s）の比率でCFSE標識K562細胞を追加37℃で5時間、5％CO 2のためncubate。 </li><li> RTで3分間300×gで遠心分離することにより細胞ミックスを洗ってください。液体を廃棄することにより、上清を吸引除去する。カバーを置き、プレートの底をボルテックス。 </li><li>ランニング緩衝液200μlを加え、ステップ10.14 1より多くの時間に記載されて洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7AAD5μlのに続いて実行されているバッファの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>各ウェルにバッファを実行している100μlのを追加し、クラスターチューブにプレートの各ウェルから細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性とCFSE陽性細胞の割合を決定します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、利益相反はないことを宣言します。

我々は、他の以前のTPPによるPBMCの処理は、サイトカインおよび14を殺し、標的細胞として機能的措置の発現および分泌を含むいくつかの応答を抑制することを実証した。前作に記載された実験の方法はより長いインキュベーション時間を必要とし、大きさが14で控えめだった。基本のためにこの魅力的なex vivoでモデルの潜在的な応用を考えると応用研究、我々はこれらのマルチステップ生物学的ア ​​ッセイにおいてアッセイパラメータのいずれかが最適化することができるかどうかを調べた。ここでは、TPP処理エクスビボで PBMCモデルを用いてTLR媒介性免疫応答を測定するための簡便法を提示する。 実行可能なPBMCの単離これらのex vivoアッセイのための重要な要件です。潜在的なドナーにおける個々の変動と生理的な状況を考えると、それが応答するのPBMCを得ることが理想的です。本研究の目的のために、我々は隔離以前に発表された方法15を使用して、一般的に健康な成人被験者...

心血管疾患（CVD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および癌1,2を含む慢性喫煙の健康への悪影響に対する知識ポイントの大幅なボディ。慢性の喫煙は、技術が病態生理学的効果の分子基盤を解明することにおいて有用であり、炎症および免疫抑制を引き起こすことが知られており、これらの変化は、喫煙3における微生物感染および癌の危険性の増大に寄与することが報告されている。 インビトロおよびエキソビボタバコの煙4-9（ 表1）と、様々なタバコ製品10,11の新たな規制を案内するための重要なツールとして認識されている。 例えば、我々は、全煙馴化培地（WS-CM）および総粒子状物質（TPM）などの可燃タバコ製品製剤（のTPP）をはるかに細胞毒性および有害にあることを実証している不燃性のTPPまたはニコチン12,13よりDNA。公表された研究と一致して、最近、可燃のTPPまたはニコチン12,13ことが報告された。発表された研究と一致して、我々は最近、可燃のTPPが著しい免疫抑制を引き起こしたことを報告した。これは、受容体（TLR）-ligands Toll様の抑制によって証明された、サイトカイン分泌を刺激し、細胞（K562） のex vivoモデル14でのPBMCによる殺傷を狙っ。タバコの煙によって誘発される疾患プロセスにおける炎症の重要性を考えると、タバコの煙の免疫調節効果を評価するためのアッセイ条件のさらなる最適化は、このレポートに記載されている。 ex vivoでのアッセイは、典型的に、細胞内および分泌されるサイトカインなどアッセイ14を殺すK562細胞における細胞傷害性T細胞およびNK細胞の細胞溶解機能を測定した。アッセイは、WS-CM及びニコチン及びPBMCのその後の刺激とのプレインキュベーションを含んだ3日間にわたってTLRアゴニストとの;最終的な読み出しは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、および/またはフローサイトメトリーを行っている。我々は、TLR-4受容体に結合し、細胞内サイトカインおよびサイトカインの分泌の産生をもたらすのPBMCを刺激し、細菌性リポ多糖（LPS）を利用する。単離PBMCを、細胞死アッセイ、およびIL-8の定量化のためのTPP、我々はまた、本発明の方法の免疫調節効果を評価するための様々なアッセイ手順の最適化に加えて。これらの方法は、他の研究課題に対処するために適用され、さらなる調節文脈でタバコ製品を評価するために洗練されてもよい。 表1 のin vitroの報告書を発表し、ex vivoでの方法はたばこ製品製剤のvarilus病態生理学的効果を研究するために使用される CS、タバコの煙媒体。 CSC、タバコの煙凝縮。 CSE、タバコの煙抽出物; ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ; GADPH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。定量PCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 RT、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 TS、タバコの煙。 <table><tbody><tr><td> 著者（研究の年） </td><td> ラーンら （2004） </td><td> ムーディら （2004） </td><td> Oltmanns ら （2005） </td><td> Vayssier（1998） </td><td> Witherden ら （2004） </td><td> ビレルら （2008） </td></tr><tr><td> 細胞を使用 </td><td>ヒト気管支内皮細胞（BEAS-2B）、ヒト好中球</td><td>人間の肺胞上皮細胞（A549） </td><td>ヒト気道平滑筋細胞（HASMC） </td><td>ヒトpremonocytic U937細胞、ヒト単球</td><td>肺胞II型上皮細胞（ATII） </td><td>ヒト単球細胞株（THP-1）、ヒト肺マクロファージ</td></tr><tr><td> TPP使用 </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> メソッドの使用 </td><td> ELISA、定量PCR、マイグレーション、電気泳動移動度シフト</td><td>免疫組織化学、電気泳動、Arrayscanキット、RT-PCR、ELISA </td><td> ELISA、RT-PCR、定量PCR、電気泳動</td><td>ゲル移動度シフト</td><td>光学顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、ELISA </td><td>定量PCR、ELISA、E-toxateキット（Sigma）を、p65のプレートアッセイ（のTransAM）、電気泳動、種々の免疫アッセイキット</td></tr><tr><td> メジャー </td><td> IL-8、GM-CF、AP-1、NF-κB、移行</td><td>ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、NF-κB、IL-8、pIがκB-α、GADPH </td><td> HO-1、GADPH、RANTES、IL-8、エオタキシン</td><td>ヒートショック/ストレスタンパク質（HSP / Hsp70が）、HF転写因子、NF-κB、TNF-α </td><td>界面活性剤タンパク質（SP-A、SP-C）、IL-8、MCP-1、GRO-α、TNF-α、IL-1β、IFN-γ </td><td> IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP1-α、GRO-α、MAPK / JNK / ERKリン酸化、cJUN：DNA結合、グルタチオン、P65：DNA結合</td></tr><tr><td> 最終結果 </td><td> CSEは、AP-1活性化の抑制を介してサイトカイン産生をダウンレギュレートする。 </td><td> H 2 O 2とCSC示差的炎症性サイトカインの放出を調節する、ヒストンデアセチラーゼ活性を低下させる、ヒストンタンパク質のアセチル化を高める。 </td><td>タバコの煙は、TNF-α、20％CSE少ないタバコの煙によるIL-8放出、エオタキシンおよびRANTESの阻害によって強化、HASMCからのIL-8の放出を引き起こすことがあります。 </td><td> TSは、Hsp70の過剰発現およびNFkBの結合活性およびTNF-α放出の阻害に関連したHFの転写因子を活性化した。 </td><td>減少ATII細胞由来ケモカインレベルが肺胞を損なうLAR修理、タバコの煙によって誘発される肺胞の損傷および肺気腫に貢献する。 </td><td>データは、喫煙者は呼吸器感染症が増加している理由のための機構的説明を提供する。生得的反応の抑制は、IL-8の増加を伴う。 </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm チューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカル チューブ</td><td>コーニング</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 ml マイクロチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F リファレンス シガレット</td><td>ケンタッキー大学、農学部</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカル チューブ</td><td>コーニング</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>500 ml ボトル</td><td>Corning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル平底板</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル丸底板</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フード</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 シリーズ A2</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>クラスターチューブ</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>飲み込むと有害、発がん性</td></tr><tr><td>物質 Cytofix/Cytoperm (パーマウォッシュ)</td> <td>BD Biosciences</td><td></td><td>555028 可燃性</td></tr><tr><td>DMSO (ジメチルスルホキシド)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>ソフトウェアはCBAデータを分析</td></tr>します <tr><td>フィルターユニット</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8色、Ex 405およびEm 785で。</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 色、Ex 495 および Em 785。</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>凍結容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>DMSO、刺激性</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>発がん性、刺激性、腐食性</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Human Inflammatory Cytokine Kit</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;V-500</td>抗体 <td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>皮膚感作剤</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R and D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>可燃性液体、刺激性</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&alpha;PE抗体</td><td>BDファーミンゲン</td><td>554730</td><td>急性毒性、経口</td></tr><tr><td>モネンシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr>ニコ<tr><td>チン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>急性毒性、環境ハザード</td></tr>パラ<tr><td>フィルム</td><td>ベミス</td><td>M」</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>可燃性、皮膚刺激性</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>ランニングバッファー</td><td>MACS ランニングバッファー、Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA キット</td><td>BD Biosciences 551809</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&アルファ;Alexa Fluor 488 抗体</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

他の病態生理学的変化の中で、タバコの煙への慢性暴露は、微生物感染症および腫瘍発生に喫煙者の感受性の増加に関連している炎症および免疫抑制を引き起こす。 エクスビボのヒト末梢血単核細胞における受容体媒介性免疫応答の抑制（PBMC）を煙成分で処理されたメカニズムを研究し、タバコ製品への曝露の可能性のある長期的影響を評価するための魅力的なアプローチである。ここでは、細菌性リポ多糖、Toll様受容体4リガンドによって刺激したPBMCを使用してex vivoでのアッセイを実行するための方法を最適化した。全体煙馴化培地（WS-CM）、可燃タバコ製品製剤（TPP）、及びニコチンの効果はサイトカイン分泌に調査し、ex vivoでのアッセイでのPBMCによる細胞死滅を標的とした。者らは、分泌されたサイトカインIFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、及びIL-8および細胞内サイトカインIFN-47 ;, TNF-α、および​​MIP-1αは、WS-CM-暴露PBMCにおいて抑制された。 K562標的細胞殺傷アッセイによって決定されるエフェクターPBMCの細胞溶解機能は、また、WS-CMへの曝露によって減少した。ニコチンはこれらのアッセイにおける最小有効だった。要約すると、我々は、生体外アッセイにおけるTPPの影響を評価するために改良されたアッセイのセットを提示し、これらの方法は、容易に関心のある他の製品をテストするために適合させることができる。

結果は、平均（4ドナーサンプル）の平均値±標準誤差として示した。処理および未処理の対照サンプルとの間のスチューデントのt検定は、対応するコントロールとのすべての治療のためにExcelソフトウェアならびにt検定比較を用い​​て行った。統計的有意性は次式で示された：*、P &lt;0.05; **、P &lt;0.005。 ***、P &lt;0.0005。 WS-CMおよびニコチンへの曝露の効果を測定するために、PBMCを3時間または24時間、WS-CMおよびニコチンの異なる濃度で処理した。細胞死は、二本鎖核酸にインターカレート7AADとして、堅牢で信頼性の高い7AAD染色法で測定し、16瀕死または死細胞の細胞膜に浸透することができる。細胞死の用量依存的増加は、等ニコチンユニット（ 図1A）の4 / mlの近くで検出され、80％の細胞死と、24時間後にWS-CMで観察された。細胞死の同程度であったのみ3000 / mlのニコチン（ 図1B）で指摘した。我々は、サイトカイン誘導および標的細胞を死...

最適化されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)ex vivoアッセイを用いて、可燃性タバコ製品の調製物が受容体を介した細胞内分泌サイトカインとエフェクターPBMCの細胞溶解能力を著しく抑制することを示しました。これらの迅速アッセイは、製品の評価やタバコ曝露の潜在的な長期的影響の理解に役立つ可能性があります。

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

本手順の全体的な目的は、タバコ製品の調製がPBMCによるサイトカイン分泌および標的細胞の殺傷に及ぼす影響を評価することです。まず、培養したPBMCを全煙凝縮液、培地、またはニコチンで処理し、次いで処理したPBMCの細胞内染色を行い、サイトカイン産生量を決定することでこれを達成します。あるいは、CFSE標識したK 5 62細胞を、全煙凝縮培地で処理したPBMCエフェクター細胞と共培養し、7-AAD染色によってK 5 62細胞の生存率を定量します。最終的に、いずれのアッセイにおいても、可燃性タバコ製品調製物がP BMCに及ぼす影響をフローサイトメトリーで測定します。本手法の、クロム放出試験やALIスポットなどの既存手法に対する主な利点は、ハイスループットであること、非放射性であること、そして細胞機能性を測定できることです。本手法により、タバコ製品調製物の生物学的影響についての知見を得ることが可能です。本手法は、PBMCエフェクター細胞のTLR介在性およびSTIC機能に影響を与える他の化合物の評価にも適用可能です。染色手順を開始する前に、全煙曝露条件、培地、およびニコチンを記載の濃度で希釈します。RPMI完全培地を用いて、96ウェルプレートの1ウェルあたり合計100 µLの容量になるように調製してください。次に、完全培地で懸濁したP BMCsを、1ウェルあたり1×10⁶ cellsの濃度で100 µL加え、1ウェルあたりの合計容量を200 µLとします。続いて、プレートに蓋をし、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。3時間後、細胞を洗浄し、上清を吸引除去します。その後、プレートに再び蓋をして、ボルテックスでペレットを解離させます。細胞をさらに2回洗浄します。1回目は氷冷したランニングバッファーで、2回目の洗浄後は完全培地で行います。その後、Golgi plugおよびLPSを添加した完全培地を1ウェルあたり200 µL加え、37 °C、5% CO2の条件下で6時間処理します。次に、細胞を氷冷したランニングバッファーで洗浄し、各ウェルに100 µLのcyto fixを加えて4°Cで20分間処理した後、氷冷したperm washで細胞を3回洗浄します。その後、各ウェルに45 µLのcyto permを加え、続いて記載された各抗体を5 µLずつ添加します。4°Cで30分間静置した後、細胞を3回洗浄し、氷冷した2%パラホルムアルデヒド200 µLで固定します。その後、細胞を12 × 75 mmチューブに移し、フローサイトメーターでサンプルを分析します。前述のようにタバコ製品処理済みPBMCのプレートを準備した後、80%コンフルエントで回収したK 5 62細胞の培養物を10 mLのDPBSで洗浄します。ペレットを5 mLのDPBSに再懸濁し、細胞数をカウントします。次に、1 mLの完全培地に含まれる1〜2 × 10⁷個のK 5 62細胞に、調製直後のCFSE作動溶液を1 mL加え、ボルテックスミキサーで撹拌して細胞を染色します。室温でインキュベートし、正確に2分後、200 µLのFBSを加えて再度ボルテックスミキサーで撹拌し、さらに2分間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、10 mLの完全培地で細胞を洗浄し、次いでペレットを別の10 mLの完全培地に再懸濁して細胞数を計測します。次に、タバコ処理したp BMCsを遠心分離し、上清をデカントして除きます。その後、蓋を閉め、ボルテックスで細胞を再懸濁し、1ウェルあたり200 µLの完全培地で洗浄します。殺傷アッセイを開始するために、CFSEラベル化したK 5 62細胞を1:15の比率でpbmcに加え、共培養物を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。5時間後、細胞を遠心分離して上清を除去します。ボルテックスでペレットを懸濁させ、1ウェルあたり200 µLのランニングバッファーで細胞を洗浄します。次に、ランニングバッファー95 µLと7-AAD 5 µLを加え、1ウェルあたりの総量を100 µLにします。最後に、細胞を室温の暗所で15分間インキュベートします。次に、各ウェルに100 µLのランニングバッファーを加え、全量を対応するファックスチューブに移し、7-AADおよびCFSE陽性細胞の割合を決定します。フローサイトメトリー分析により、全煙調整培地を用いた24時間の処理において、細胞死の用量依存的な増加が観察され、馬匹ニコチン単位で4 µg/mLのときに細胞の約80%が死滅しました。しかし、pBMCを3時間のみ処理した場合は、全煙調整培地の馬匹ニコチン単位が5 µg/mLであっても、24時間後において有意な毒性は認められませんでした。3000 µg/mLのニコチンで3時間処理するまで、同程度の細胞死は認められず、また2000 µg/mLの濃度で処理するまで、ニコチン処理による測定可能な細胞死は誘導されません。全煙条件培地およびニコチンによる処理に続き、LPSでTLR4受容体を刺激すると、分泌サイトカインの用量依存的な減少が認められます。ただし、抑制の程度は個々のサイトカインによって異なります。さらに、細胞をLPSとGolgi plugで6時間のみ共処理した場合、ニコチン曝露と比較して、より低い等価ニコチンユニット濃度の全煙条件培地に曝露した後でも、細胞内サイトカイン陽性細胞数の減少が観察されます。実際に、この殺傷アッセイの結果は、1.56 µg/mLの全煙曝露条件培地への曝露が、コントロールおよびより低濃度の用量と比較して、エフェクターPBMC集団の殺傷能を有意に低下させることを示しています。一方で、高濃度または低濃度のいずれのニコチン処理においても、エフェクターPBMC集団の殺傷能に干渉は見られませんでした。これらの手順を行う際は、CFSEラベル化、抗体希釈、ラベル化時間、およびインキュベーション温度を正確に管理することが重要です。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーにおける抗体標識技術を利用して、タバコ製品調製物やその他の処理が末梢血単核細胞に及ぼす影響を判定する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

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細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

このビデオでは、可燃性タバコ製品製剤である全煙調整培地が、エフェクター末梢血単核細胞によるK562細胞の死滅に及ぼす影響を研究しています。...

タバコ製品調製物に曝露された末梢血単核細胞によるK562細胞の死滅

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可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

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