急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、
2015年1月10日
急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。
次の実験の全体的な目標は、形態学的に同定されたニューロン間のシナプス接続が機能的および構造的にどのように特徴付けられるかを示すことです。これは、特定のシナプス結合を研究するために最適化された急性脳スライスを取得することによって達成されます。次に、パッチクランプを使用して、シナプス結合ニューロンをテストします。
このために、個々の将来のシナプス後ニューロンにパッチを当て、次に2番目のピペットを使用して周囲のニューロンを刺激し、シナプス結合の存在を確立します。応答が見られない場合は、刺激電極を動かします。接続が見つかると、シナプス前ニューロンはホールセールモードで再適合されます。
これらのニューロンからの電気生理学的記録と同時ビオチン充填に続いて、スライスを固定し、ビオチンを処理し、ニューロンのコンピュータ支援3D再構成を行います。最終的に、私たちの方法は、ニューロンの微小回路の相関した定量的な構造的および機能的分析を目指しています。シナプス結合ニューロンからのペア録音の主な利点は、ニューロンの微小回路におけるシナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの両方の相関構造的および機能的解析を実行できることです。
さらに最近では、ニューロンの光刺激などの導入された技術では、これまでのところ、これをそれほど詳細に達成することはできません。この方法により、形態学的に同定されたニューロンタイプの興奮と抑制の相互作用と、その活性がどのように調節されるかの研究が可能になります。ペットの録音の手順を実演するのはGuanです。
彼は私の研究室のポスドクです。標的領域のスライスを準備した後、この間にそれらをインキュベートさせ、長くて細いシャンクを持つべきパッチピペットを引きます。実験チャンバー内でプラチナハープで脳スライスを固定した後、録音ピペットに内部溶液を満たします。
ピペットをプリアンプに置き、カリウム塩がナトリウム塩に置き換えられた内部溶液で満たされた8〜10メガオーム抵抗の検索パッチピペットを使用して、推定シナプス後ニューロンを全細胞モードでパッチします。検索ピペットを優しく吸引して、緩い細胞内の潜在的なシナプス前ニューロンにパッチを当てます。アタッチされた構成。
ルーズシールの下の膜電位を、電流クランプモードで負の30〜負の60ミリボルトに保持します。次に、0.2〜2ナノアンペアの大電流パルスを印加して、電位シナプス前細胞に活動電位を引き出します。この活動電位を電圧応答の小さな小穂として観察します。
シナプス後反応の低下を防ぐために、刺激周波数を0.1ヘルツに設定します。シナプス後ニューロンが、試験された潜在的にシナプス前ニューロンパッチの刺激に応答しない場合、新たな潜在的シナプス前ニューロンが緩いシールモードになります。この方法で、シナプス前神経細胞の可能性のある最大30個をテストします。
30メガオーム以上の抵抗を持つシールが確立できる限り、同じ探索パッチ電極を使用し続けます。ルーズシールモードでの刺激により、シナプス後ニューロンの潜伏時間が5ミリ秒未満のEPSPまたはIPSPが発生する場合は、4〜8メガオームの抵抗を持つ通常の内部溶液を含むビオチンを充填した記録パッチ電極を使用して、シナプス前ニューロンから検索ピペットを取り外してください。シナプス前ニューロンにパッチを当て、全細胞電流クランプモードで記録します。
シナプス前ニューロンへの電流注入により活動電位を誘発し、シナプス後応答を記録します。データをコンピューターに保存して、後でオフラインで分析します。記録全体を通して、ビオチンはニューロンに拡散し、適切な染色を得ることができます。
ビオチンをニューロンのサイズにもよりますが、少なくとも15〜30分間拡散させます。接続率の高い神経微小回路では、探索電極は使用されません。むしろ、全細胞モードでシナプス前ニューロンに直接パッチを当てることから始めます。
次に、通常の内部溶液で満たされたパッチ電極を使用して、全細胞モードでも潜在的なシナプス後ニューロンをパッチし、両方の細胞を電流クランプ制御下に置く必要があります。シナプス前細胞に活動電位を引き出し、将来のシナプス後ニューロンのシナプス後電位を監視します。ニューロンがシナプス前刺激に対して応答を示さない場合は、新しい電極を使用して、全細胞モードで新しいニューロンに再度パッチを適用します。
接続が見つかったら、パッチピペットを変更せずに、前に示したように録音を続行します。テキストプロトコルに記載されているようにスライスを固定して取り付けた後、光学顕微鏡でビオチン標識ニューロンを調べます。軸索バトンと樹状突起棘がはっきりと見えることを確認してください。
市販のニューロントレースシステムを使用して、ニューロンまたはシナプス結合ニューロンペアを手動でトレースします。小さな軸索または樹状突起の側副血行路でも必ず含めてください。トレースを使用して3Dニューロン再構成を取得し、トレースプログラムの適切なセクションで3つの空間次元すべてでニューロン再構成の収縮を修正します。
埋込み材の収縮補正係数は、x方向とy方向で約1.1、z方向で約2.1です。とげのある星状星とニューロンへの高速スパイクで構成される相互結合した細胞ペア。皮質の4層目にはビオチンが充填されていました。
記録中、緑色の点は、シナプス前有棘ニューロンとシナプス後ニューロンとの間の推定興奮性シナプス接触を示しています。青い点は、推定される相互抑制性シナプス接触を示しています。シナプス接触の高倍率画像をここに示します。
緑の白丸は興奮性接触を示し、青色の白丸は抑制性接触を示します。この相互に接続された細胞ペアの神経明晰な再構築をここに示します。ニューロン間軸索は青で、その体細胞と樹状突起は赤で示されています。
とげのあるニューロンの軸索は緑色で示され、その体細胞とダイトは白色で示されています。挿入図は、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの体細胞樹状突起コンパートメントを示しています。推定されるシナプス接触とともに、急性脳切片から作成された低出力明視野写真顕微鏡写真でバレルの輪郭が特定されました。
ここでは、接続率が非常に低い代表的なシナプス接続を示しています。第6層パラメタル細胞のシナプス前活動電位は、第4層スターパラメタルニューロンのモノスシナプス興奮性シナプス後電位を誘発した。このトランス層流接続の 3 ミリ秒を超える遅延は、ローカルの層間接続で観察される約 1 ミリ秒の遅延よりもはるかに長くなります。
第6層のパラメタル細胞で誘発された10ヘルツの2つの活動電位は、ここに示す第4層のスターパラメタルニューロンのシナプス後電位を引き起こしました。短期的な円滑化に注意してください。スラッシング条件は、特定のシナプス接続に対して最適化する必要があり、録音中はセットアップが完全に安定している必要があり、その後、最適な録音理解が保証されることを覚えておくことが重要です。
このビデオを見れば、新皮質の神経細胞微小回路の構造的および機能的特性の全体像を把握するために、電気生理学的測定と形態学的再構成がどのように使用されているかを十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、形態学的に同定されたニューロン間のシナプス接続の特徴づけを実験室での電気生理学的および構造解析を通じて実証します。急性脳切片を使用することで、研究者は個々のニューロンをパッチクランプし、周囲のニューロンを刺激してシナプス接続を確立することができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 神経細胞の形態学
背景
- シナプス接続の理解は神経科学研究にとって重要です。
- パッチクランプ技術により、ニューロンの詳細な機能解析が可能になります。
- 同時的な形態解析により、ニューロンの構造に関する洞察が得られます。
- 急性脳切片はシナプス相互作用の研究に最適です。
研究目的
- 電気生理学的記録の技術的ステップを説明すること。
- ニューロンの機能的および構造的特性の相関を示すこと。
- 神経回路の理解を深めること。
使用した方法
- シナプス研究に最適な急性脳切片の準備。
- シナプス結合ニューロンを同定するためのパッチクランプ記録。
- ニューロンの形態解析のためのバイオサイティン充填。
- シナプス接続を確立するための周囲のニューロンの刺激。
主要な結果
- ニューロン間のシナプス接続の成功的な同定。
- 構造的および機能的特性の相関の実証。
- 神経回路のダイナミクスに関する洞察。
- 将来の研究のための信頼性の高いプロトコルの確立。
結論
- このプロトコルはシナプス接続を研究するための包括的なアプローチを提供します。
- 電気生理学的および形態学的技術の組み合わせの重要性を強調します。
- この発見は神経相互作用のより深い理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Paired patch-clamp recordings in acute brain slices enable direct, quantitative analysis of synaptic connectivity and functional microcircuit properties, supporting mechanistic de-risking in early neuroscience drug discovery. This approach provides high-resolution correlation between neuronal structure and function, informing target validation and predictive confidence for CNS portfolio decisions. Integrating electrophysiological and morphological data strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of synaptic connectivity and microcircuit function in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by correlating electrophysiological responses with neuronal morphology.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in CNS programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible electrophysiological and morphological outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on synaptic transmission and connectivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional and structural biomarkers for translational continuity in CNS research.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying microcircuit mechanisms underlying disease phenotypes.
- Informs preclinical model selection based on validated synaptic and circuit-level endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by providing quantitative, mechanistic insights into neuronal microcircuits, supporting lead identification and translational biomarker development in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of synaptic connectivity and pathway function in native tissue context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of synaptic responses for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of latency, amplitude, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns structural and functional endpoints for biomarker validation and model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse neuronal circuits across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological and morphological workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage in neuroscience R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS assets based on validated circuit mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires specialized electrophysiology expertise and training in patch-clamp techniques.
- Demands access to advanced microscopy and neuron tracing infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of recording and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or neuronal subtypes based on connectivity ratios.
- Connectivity estimates can be affected by tissue preparation artifacts such as dendritic or axonal truncation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:22
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a Low Connectivity
5:11
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a High Connectivity
6:16
Neuronal Reconstruction and Synaptic Contact Localization
7:17
Results: Morphology and Electrophysiology of Synaptic Connections in Cortical Neuronal Microcircuits
9:35
Conclusion
