Name: 急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶペアパッチクランプ記録による急性脳スライス中のニューロンマイクロ回路の電気生理学的・形態学的特徴評価法。シナプス結合ニューロンの構造と機能の相関解析に役立つ。

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私たちは、神経科学医学研究所、INM-2、ユーリッヒ研究センターの「神経微小回路の機能」グループのすべてのメンバーと、アーヘン工科大学の医学部、JARA、アーヘン工科大学精神医学・心理療法・心身医学科の「皮質微小回路の機能」グループの全員に感謝したいと思います。この研究は、DFGのBarrel Cortex Function(BaCoFun)研究グループの支援を受けて行われました。

著者は利益相反を宣言しません。

シナプス結合された興奮性および/または抑制性ニューロンからの対応のある記録は、神経マイクロ回路の研究のための非常に汎用的なアプローチである。だけでなく、このアプローチは、一つのニューロン型の間のシナプス接続を推定することを可能にするだけでなく、接続および前およびシナプス後ニューロンの形態の機能的特性を決定することができない。さらに、アゴニストおよび/またはアンタゴニストは容易にスライス標本中のニューロンに適用することができる。これは、1つは、シナプス伝達32またはシナプス放出16,17,38,39の、例えば、量子解析を使用して定義された単一のシナプス結合の詳細な特徴付けの特性に神経調節物質の効果を研究することができる。化学的および/または電気（ギャップジャンクショ​​ン）シナプス結合の発見は、このプロトコルの最も重要なステップです。そこで、接続比率に応じて、シナプス結合を見つけるための別のアプローチを記載されているとしているタイプ（化学/電気）。 軸索の合計軸索の長さのわずかな部分が回収されるように、スライス標本の主な欠点は、長距離軸索投...

2シナプス結合されたニューロン間の神経マイクロ回路は、脳内の大規模ネットワークの構築ブロックでシナプス情報処理の基本単位である。そのようなニューロンのマイクロ回路の特徴付けのための前提条件は、前およびシナプス後パートナーニューロンの両方の形態学的および機能的特性を知ることがシナプス結合（単数または複数）およびその構造的および機能的メカニズムのタイプである。しかし、シナプス結合の多くの研究で、超小型回路内のニューロンのうちの少なくとも一方は、十分に特徴付けされていない。これは多くの場合、シナプスの接続性の研究に使用される比較的非特異的刺激プロトコルに起因する。したがって、シナプス前ニューロンの構造的および機能的特性のいずれかのすべてまたは唯一のかなり小さい程度に識別されていない（ すなわち、マーカータンパク質の発現など ）。マーカーSによって細胞内染色との組み合わせでペアの録音ビオシチン、neurobiotinまたは蛍光染料などのuchが小さなニューロンのマイクロ回路を研究するために適しています。この技術は、一方が、同時に、形態学的に同定されたシナプス結合の多くの構造的および機能的パラメータを調査することを可能にする。 2つのニューロン間のいわゆる「単一の」単シナプス接続は、急性スライス標本を使用して両方の皮質及び皮質下の脳領域1-10に研究されてきた。最初に、鋭い微小電極は、これらの実験で使用した。以降、パッチクランプ記録は、より低い騒音レベルと改善された時間分解能でのシナプス信号の記録を得るために使用した。 重要な技術的進歩は、赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）光学11-14、かなりことができるトンとなるように脳切片におけるニューロンの視認性及び識別を改善顕微鏡技術を使用することであったO視認シナプス結合15-17からの記録を入手。一般的には、対になった記録は、急性スライス標本で行われている。ごく少数の出版物は、生体 18-20 でシナプス接続ニューロンからの録音を報告可能です。 対になった録音の最も重要な利点は、機能的特徴は、光および電子顕微鏡レベルの両方で、形態素解析と組み合わせることができるという事実である（ 例えば、参照、7,16,21）。組織化学的処理の後、シナプス接続ニューロンペアの樹状突起と軸索形態がトレースされます。続いて、これらのパラメータは、特定のシナプス結合の目的の分類のための基礎を提供することができる等の長さ、空間密度、配向、分岐パターンとして形態学的特徴を定量化することが可能である。さらに、神経connectiを研究するために使用されるほとんどの他の技術とは対照的にVITY、対になった録音は、また単一のシナプス結合のためのシナプスの連絡先の識別を可能とする。これは、光学および電子顕微鏡16,21-27の組み合わせを使用して、または樹状突起棘のカルシウムイメージング28,29を用いて直接行うことができる。それがシナプス後受容体チャネルを介してカルシウム流入を必要とするが、後者のアプローチのみではなく、興奮抑制結合を研究することができる。 アゴニスト/アンタゴニストのアプリケーションと組み合わせて- -対に定義されたニューロンのマイクロ回路におけるシナプス伝達の詳細な分析に加えて、記録はまた、シナプス可塑性ルール30,31または研究を可能にするようなアセチルコリン32およびアデノシンなどの神経伝達物質によるシナプス伝達の調節を33。

<table><tbody><tr><td>アンプ</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB トリプル</td><td>2 - 3 プリアンプ付き</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WI</td><td>2 カメラポート、4X 対物レンズ、40X 水浸対物レンズ付き</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>赤外線 CCD カメラ</td></tr><tr><td>ワークステーション</td><td>Luigs &Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>、電動x-yステージ、顕微鏡用電動フォーカス軸</td></tr>を装備 <tr><td>Micromanipulator</td><td>Luigs &Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z マニピュレーター 2 - 3 プリアンプ用</td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>Luigs &Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibration table</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida system</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>with Neurolucida and Neuroexplorer softwares</td></tr></tbody></table>

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

同時細胞内ビオシチン充填急性脳スライス標本における2つ（またはそれ以上）のシナプス結合したニューロン（対の録音）からのパッチクランプ記録の組み合わせは、それらの構造的および機能的特性の相関分析を可能にする。この方法では、その形態および電気生理学的応答パターンの両方によって前およびシナプス後ニューロンを同定し、特徴付けることが可能である。対になった記録は、これらのニューロン間の接続パターン並びに化学的および電気的シナプス伝達の両方の性質を研究することができます。ここでは、ニューロンの形態の最適な回復とともに信頼性の高いペアの録音を得るために必要な手順のステップバイステップの説明を与える。私たちは、化学シナプスまたはギャップ結合を介して接続されたニューロンのペアは、脳スライス標本で識別されている方法を説明します。私たちは、ニューロンがdendritの彼らの3D形態を得るために再構築されているかを概説しますICと軸索ドメインとどのようにシナプスの連絡先が特定され、ローカライズされています。これらは強く接続性の推定値に影響を与えるので、我々はまた、特に、脳スライスの準備中に、樹状および軸索切断をに関連するものを対に記録技術の注意事項と制限事項について説明します。しかし、対になった記録アプローチの汎用性のそれは、脳内で識別ニューロンのマイクロ回路でシナプス伝達のさまざまな側面を特徴付ける貴重なツールのままになります。

対になった記録は、形態学的に同定されたユニまたは双方向のシナプス結合の詳細な特徴付けのための選択の方法、ならびにギャップジャンクション（電気的）接続（ 図1）である。体性感覚バレル皮質の層4における対の記録の例を図1Aに示されている。一方向性の興奮性および抑制性シナプス接続の両方が（ 図1B、C）特徴づけることができる。さらに、対になった録音は、ペアの両方のニューロンが互いに前とシナプス後である、接続から、双方向のシナプス結合、 すなわちから録音することができます。これは、抑制性介在ニューロンと興奮性ニューロンからの記録を示し、図1Dに示されている。興奮性ニューロン（赤色トレース）に活動電位を誘発するとシナプス後抑制性介在ニューロン（黒のトレース）でEPSPをもたらす。しかし、活動電位は、エボとき介在ニューロンにヒツジシラミバエ、IPSP、興奮ニューロンに記録することができる。 図1Eは、ギャップ結合を介して、またはギャップジャンクシ...

急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

次の実験の全体的な目標は、形態学的に同定されたニューロン間のシナプス接続が機能的および構造的にどのように特徴付けられるかを示すことです。これは、特定のシナプス結合を研究するために最適化された急性脳スライスを取得することによって達成されます。次に、パッチクランプを使用して、シナプス結合ニューロンをテストします。このために、個々の将来のシナプス後ニューロンにパッチを当て、次に2番目のピペットを使用して周囲のニューロンを刺激し、シナプス結合の存在を確立します。応答が見られない場合は、刺激電極を動かします。接続が見つかると、シナプス前ニューロンはホールセールモードで再適合されます。これらのニューロンからの電気生理学的記録と同時ビオチン充填に続いて、スライスを固定し、ビオチンを処理し、ニューロンのコンピュータ支援3D再構成を行います。最終的に、私たちの方法は、ニューロンの微小回路の相関した定量的な構造的および機能的分析を目指しています。シナプス結合ニューロンからのペア録音の主な利点は、ニューロンの微小回路におけるシナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの両方の相関構造的および機能的解析を実行できることです。さらに最近では、ニューロンの光刺激などの導入された技術では、これまでのところ、これをそれほど詳細に達成することはできません。この方法により、形態学的に同定されたニューロンタイプの興奮と抑制の相互作用と、その活性がどのように調節されるかの研究が可能になります。ペットの録音の手順を実演するのはGuanです。彼は私の研究室のポスドクです。標的領域のスライスを準備した後、この間にそれらをインキュベートさせ、長くて細いシャンクを持つべきパッチピペットを引きます。実験チャンバー内でプラチナハープで脳スライスを固定した後、録音ピペットに内部溶液を満たします。ピペットをプリアンプに置き、カリウム塩がナトリウム塩に置き換えられた内部溶液で満たされた8〜10メガオーム抵抗の検索パッチピペットを使用して、推定シナプス後ニューロンを全細胞モードでパッチします。検索ピペットを優しく吸引して、緩い細胞内の潜在的なシナプス前ニューロンにパッチを当てます。アタッチされた構成。ルーズシールの下の膜電位を、電流クランプモードで負の30〜負の60ミリボルトに保持します。次に、0.2〜2ナノアンペアの大電流パルスを印加して、電位シナプス前細胞に活動電位を引き出します。この活動電位を電圧応答の小さな小穂として観察します。シナプス後反応の低下を防ぐために、刺激周波数を0.1ヘルツに設定します。シナプス後ニューロンが、試験された潜在的にシナプス前ニューロンパッチの刺激に応答しない場合、新たな潜在的シナプス前ニューロンが緩いシールモードになります。この方法で、シナプス前神経細胞の可能性のある最大30個をテストします。30メガオーム以上の抵抗を持つシールが確立できる限り、同じ探索パッチ電極を使用し続けます。ルーズシールモードでの刺激により、シナプス後ニューロンの潜伏時間が5ミリ秒未満のEPSPまたはIPSPが発生する場合は、4〜8メガオームの抵抗を持つ通常の内部溶液を含むビオチンを充填した記録パッチ電極を使用して、シナプス前ニューロンから検索ピペットを取り外してください。シナプス前ニューロンにパッチを当て、全細胞電流クランプモードで記録します。シナプス前ニューロンへの電流注入により活動電位を誘発し、シナプス後応答を記録します。データをコンピューターに保存して、後でオフラインで分析します。記録全体を通して、ビオチンはニューロンに拡散し、適切な染色を得ることができます。ビオチンをニューロンのサイズにもよりますが、少なくとも15〜30分間拡散させます。接続率の高い神経微小回路では、探索電極は使用されません。むしろ、全細胞モードでシナプス前ニューロンに直接パッチを当てることから始めます。次に、通常の内部溶液で満たされたパッチ電極を使用して、全細胞モードでも潜在的なシナプス後ニューロンをパッチし、両方の細胞を電流クランプ制御下に置く必要があります。シナプス前細胞に活動電位を引き出し、将来のシナプス後ニューロンのシナプス後電位を監視します。ニューロンがシナプス前刺激に対して応答を示さない場合は、新しい電極を使用して、全細胞モードで新しいニューロンに再度パッチを適用します。接続が見つかったら、パッチピペットを変更せずに、前に示したように録音を続行します。テキストプロトコルに記載されているようにスライスを固定して取り付けた後、光学顕微鏡でビオチン標識ニューロンを調べます。軸索バトンと樹状突起棘がはっきりと見えることを確認してください。市販のニューロントレースシステムを使用して、ニューロンまたはシナプス結合ニューロンペアを手動でトレースします。小さな軸索または樹状突起の側副血行路でも必ず含めてください。トレースを使用して3Dニューロン再構成を取得し、トレースプログラムの適切なセクションで3つの空間次元すべてでニューロン再構成の収縮を修正します。埋込み材の収縮補正係数は、x方向とy方向で約1.1、z方向で約2.1です。とげのある星状星とニューロンへの高速スパイクで構成される相互結合した細胞ペア。皮質の4層目にはビオチンが充填されていました。記録中、緑色の点は、シナプス前有棘ニューロンとシナプス後ニューロンとの間の推定興奮性シナプス接触を示しています。青い点は、推定される相互抑制性シナプス接触を示しています。シナプス接触の高倍率画像をここに示します。緑の白丸は興奮性接触を示し、青色の白丸は抑制性接触を示します。この相互に接続された細胞ペアの神経明晰な再構築をここに示します。ニューロン間軸索は青で、その体細胞と樹状突起は赤で示されています。とげのあるニューロンの軸索は緑色で示され、その体細胞とダイトは白色で示されています。挿入図は、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの体細胞樹状突起コンパートメントを示しています。推定されるシナプス接触とともに、急性脳切片から作成された低出力明視野写真顕微鏡写真でバレルの輪郭が特定されました。ここでは、接続率が非常に低い代表的なシナプス接続を示しています。第6層パラメタル細胞のシナプス前活動電位は、第4層スターパラメタルニューロンのモノスシナプス興奮性シナプス後電位を誘発した。このトランス層流接続の 3 ミリ秒を超える遅延は、ローカルの層間接続で観察される約 1 ミリ秒の遅延よりもはるかに長くなります。第6層のパラメタル細胞で誘発された10ヘルツの2つの活動電位は、ここに示す第4層のスターパラメタルニューロンのシナプス後電位を引き起こしました。短期的な円滑化に注意してください。スラッシング条件は、特定のシナプス接続に対して最適化する必要があり、録音中はセットアップが完全に安定している必要があり、その後、最適な録音理解が保証されることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、新皮質の神経細胞微小回路の構造的および機能的特性の全体像を把握するために、電気生理学的測定と形態学的再構成がどのように使用されているかを十分に理解できるはずです。

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