幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

この手順の目的は、マウス胚性幹細胞由来のニューロンネットワーク培養において、クロストリジウム神経毒がシナプス伝達に及ぼす影響を精密に測定することです。まず、胚性幹細胞をフィーダーフリーの浮遊培養に適応させ、適応後の細胞を多能性状態で維持します。次に、4つの分化誘導手法を応用し、浮遊適応させた幹細胞をニューロンまたはESNへと分化させます。

次に、ESNを一連の培地で処理し、シナプス活性を持つネットワーク化されたニューロンへの成熟を促進させます。最終ステップとして、ESNをクロストリジウム神経毒またはその他の神経毒で処理し、ホールセルパッチクランプ電気生理学を用いて単一シナプス活性への影響を測定します。最終的に、自発的な単一シナプス活性の産生における変化を、年齢およびロットを一致させた対照ニューロンで正規化した電気生理学的記録から定量化し、投与量、時間、または薬剤処理などの異なる条件下で比較します。

この手法の最大の利点は、ESNが、ボツリヌス症および破傷風の臨床症状の原因となる機能的病理を再現した初の細胞ベースのモデルであることです。ESNがスネアタンパク質の切断に基づくすべてのクロストリジウム神経毒素に対して非常に感受性が高く、また、創発的なネットワーク挙動において自発的なシナプス活性を示すことを発見した際、私たちは最初にこの手法を着想しました。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるMs.Megan Lymanが行います。まず、フィーダー細胞除去後の適応懸濁培養液を移送することから始めてください。

ESC凝集体を15 mLコニカルチューブに移し、凝集体がコンパクトなペレットとして沈殿するまで静置します。凝集体が沈殿したら、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去します。次に、5 mLのPBSを加えて細胞を洗浄し、100 ×gで2.5分間遠心分離します。

PBSを慎重に吸引して除去した後、500 µLのトリプシンを加え、チューブを数回反転させて細胞ペレットを穏やかに分散させます。次に、チューブを37 °Cのウォーターバスに入れ、3分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、チューブを組織培養用フードに戻し、500 µLのESC培地を加えてトリプシンを希釈します。

次に、P 1000ピペットを用いてCEL懸濁液を5〜10回トリチュレーションし、単一細胞懸濁液にします。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、残りの細胞懸濁液を200 ×gで3分間遠心分離します。上清を吸引した後、ESC培地を用いて細胞を最終濃度1 × 10⁷ cells/mLに再懸濁します。

次に、懸濁液150 µLを10 cm細菌用ディッシュ内の10 mLのESC培地に転移し、37 °C、5% CO2でインキュベートします。ESCは通常、このプロトコルを用いて継代されます。定期的な細胞継代の間、48時間ごとにESCからニューロンへの分化が始まります。

前述と同様にESCを解離させますが、神経分化用にさらに1枚プレートを追加してください。細胞懸濁液350 microlitersを、25 millilitersの分化Mediumを含む10 centimeter低接着ディッシュに移します。ディッシュを、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideに設定した組織培養インキュベーター内の、30 to 45 RPMに設定したオービタルシェーカーに設置し、48時間インキュベートします。

48時間後、25 mL ピペットを使用して、分化中の細胞凝集塊を50 mL コニカルチューブに移します。直後に、25 mL の新鮮な分化培地をペトリ皿に加えます。

凝集塊を2〜5分間静置し、深さ1〜2 mmの目に見えるペレットを形成させます。浮遊している単一細胞や小さな凝集塊は無視して、培地を慎重に吸引し、P 1000ピペットを用いて細胞ペレットをペトリ皿に戻します。その後、皿をインキュベーター内のロータリーシェーカーに戻します。

さらに48時間後、培地交換の手順を繰り返します。今回は、6 µMのオールトランスレチノイン酸を添加した分化培地を30 mL使用します。細胞をインキュベートすると、形成されたペレットの厚さは2〜4 mmになります。

前述と同様に、レチノイン酸を添加した培地交換の手順を最後にもう一度繰り返します。翌日の時点では、ペレットの深さは4〜8 mmになります。播種日の午後に、プロトコルの記述部分に従って播種面を準備するか、あるいは、あらかじめコーティングしたMPCトリプシン培地と0.1%大豆トリプシン阻害剤を各5 mL、37 °Cで準備しておきます。

次に、25 mLピペットを用いて、分化中の凝集塊を培養プレートから50 mLコニカルチューブに移します。凝集塊を3〜5分間静置させた後、ペレットを乱さないように注意して培地を吸引除去します。続いて、5〜10 mLのPBSでペレットを洗浄し、凝集塊が沈殿するまで待ちます。

PBSを吸引し、洗浄を繰り返します。2回目のPBS洗浄後、ペレットにMPC化培地を5 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。

インキュベーション中にチューブを2〜3回軽く弾きます。次に、0.1% 大豆トリプシンインヒビターを5 mL細胞に添加し、転倒混和して迅速に混ぜ合わせます。その後、10 mLピペットを用いて細胞を10〜15回緩やかにトリチュレーションし、比較的均一な細胞懸濁液が得られるまで調整します。

50 mLコニカルチューブの上に置いた40または70 µmのセルストレーナーを用いて、細胞懸濁液をゆっくりとろ過します。懸濁液をすべてろ過した後、1 mLのN2培地をフィルターに加えて、ストレーナーに残っている細胞を洗い出します。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、200 ×gで6分間遠心分離します。ペレットを崩さないように培地を吸引後、2 mLのN2培地でトリチュレーション（撹拌混和）し、さらにN2培地を加えて全量を10 mLにします。

200 x gで5分間遠心分離する。培地を吸引し、ペレットの洗浄工程をもう一度繰り返す。10 mLのN2培地でペレットを再懸濁する。

細胞のアリコートを分取してヘモサイトメーターで計数し、その後、遠心分離を繰り返します。細胞をN2 mediumに懸濁し、最終濃度を1×10⁷ cells/mLとして、150,000～200,000 cells/cm²の密度で播種します。これはDIV-1に調製し、37°Cの組織培養インキュベーター内に配置します。

書面によるプロトコルの指示に従ってESNを維持します。まず、ボツリヌス神経毒素セロタイプAをESN培養液で最終希望濃度の100倍に希釈し、37 °Cまで温めます。次に、適切な量の毒素をDIV 21以降のESN培養物に追加します。

培養皿を膨らませ、任意の時間にインキュベーターに戻します。ESN培養液をポイント吸引し、細胞外記録緩衝液（ERB）で2回洗浄します。次に、活動電位を遮断するための5マイクロモーラーのテトロドトキシンと、GABAa受容体活性を拮抗させるための10マイクロモーラーのビコリンを添加したERBを4ミリリットル加えます。

次に、ディッシュを電気生理学的測定装置に移します。シナプス伝達の抑制測定またはmistアッセイにおいて、灌流および温度制御は不要です。マイクロピペットプラーを用いて抵抗値5〜10 MΩのホウケイ酸ガラスピペットを作成し、ピペット内に細胞内記録バッファーを後充填します。

次に、ピペットをシリコン試薬にそっと浸します。記録用ピペットを電極ホルダーに固定し、電極ホルダーに接続されたチューブに空気を充填したシリンジを取り付けます。シリンジで一定の正圧をかけながら、記録用ピペットをERBの中へ下ろします。

記録用ピペットを記録対象となるニューロンの体細胞（SOR）上にそっと接地させます。シリンジのシールを解いて、正圧を確認してください。シリンジを再接続し、緩やかに吸引して持続的な陰圧をかけることで、ギガオームシールを形成します。

ギガシールが形成されたら、保持電圧を−70 millivoltsまで下げます。その後、シリンジを用いて陰圧の短いパルスを慎重に加え、ホールセル構成にします。30秒間キャパシタンスのスパイクをモニターし、パッチが安定していることを確認してください。

HEAソフトウェアでキャパシタンススパイクをキャンセルし、カレントクランプモードに切り替えて、液間電位の補正を行わずに静止膜電位をモニターおよび記録します。静止膜電位は-67 mVから-82 mVの間になる可能性があります。ゲインを2 mV/pAに調整します。

ボルテージクランプモードに切り替え、-70 mVで3〜5分間連続記録を行い、小型興奮性ポストシナプス電流を検出します。Mini分析におけるAMPA受容体EPCのデフォルト設定を使用して、記録された3〜5分間のデータを解析し、mEPSCを検出して、検出されたイベントの情報を収集・保存します。各曝露条件について、8〜12個のコントロールサンプルおよび8〜12個のボツリヌス神経毒処理サンプルからmEPSCの頻度を収集します。

年齢およびロットを一致させたコントロール群に対して頻度を解析し、適切な統計検定を用いて、div 7からdiv 49までのシナプス活性の抑制率の統計的有意性を決定します。ESNsは神経親和性コンパートメントを発現し、シナプスパンクチャーを形成します。Taxo樹状突起インターフェース。ESNsをボツリヌスニューロトキシンセロタイプA、TG、および破傷風毒素に曝露させると、シナプス活性の抑制が起こります。

これらのESNからの代表的なトレースは、ボツリヌス神経毒素セロタイプA、破傷風神経毒素、またはビヒクルのバス浴添加から20時間後に収集されました。各神経毒素は、コントロールと比較してシナプス活性を95%以上減少させました。以下の4つの画像は、ボツリヌス神経毒素セロタイプA処理されたESNにおいて、単一シナプス活性を測定する際のmEPSCの感度を示しています。

最初の画像は、ボツリヌス神経毒素セロタイプAを浴槽に添加して20時間後の、シナプス活動の測定における代表的なトレースを示しています。ボルテージクランプのトレースセグメントでは、ボツリヌス神経毒素セロタイプAへの曝露後、M-E-P-S-C頻度の減少が認められました。この画像はM-E-P-S-C頻度の定量化を示しており、M-E-P-S-C頻度が用量依存的に減少することを裏付けています。半数抑制濃度は、4パラメータ可変スロープを用いた非線形回帰の最小二乗法により決定されました。なお、SNSにおける検出限界は少なくとも0.005 picaMolarです。

この棒グラフは、ウェスタンブロット法によって測定したSNAP 25切断のサイトメトリー定量値を示しています。中毒の指標としてのSNAREタンパク質切断の感度が低いことに留意してください。mistと比較して、単一のアスタリスクはP値が0.05未満であることを示します。

3つのアスタリスクは、P値が0.001未満であることを示します。これらの知見は、幹細胞由来ニューロンのネットワーク化された集団が、クロストリジウム神経毒素中毒の生理学的に適切な細胞ベースモデルとなることを実証しています。SNSの使用は、マウス致死量試験に適した代替手段として機能することで、動物の苦痛と死亡を大幅に軽減し、さらに速度、特異性、感度の向上というメリットをもたらすことが期待されます。

この手法により、神経毒理学分野の研究者が、ニューロンネットワーク活性に基づいた中スループットのスクリーニング技術を採用することが可能となり、クロストリジウム神経毒の治療薬スクリーニングおよび毒素検出が促進されます。