プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する ^-チャネルとトランスポーター

この手順の全体的な目標は、再構成された塩化物チャネルまたはトランスポーターの輸送活性を定量的に決定することです。これは、最初に純粋な精製トランスポーターを低密度でリポソームに再構成することによって達成され、各リポソームが活性複合体のゼロまたは1つのコピーを含むようにした後、外部塩化物イオンを除去して外側に向けられたイオン勾配があり、リポソームを記録チャンバーに添加し、塩化物濃度が塩化物感受性電極を使用して監視されます。次に、リポソームからの塩化物flxは、膜電位を刺激するカリウムイオノフォアであるVal Mycinを添加することによって開始されます。

信号が定常状態に達すると、リポソームを溶解するための界面活性剤を添加して実験を終了します。最終的には、精製されたチャネルまたはトランスポーターで再構成されたプロテアリポソームからの塩化物排出速度を測定することにより、活性タンパク質複合体の単一輸送速度および化学量論を定量的に決定することができる。この手法が、蛍光ベースのフラックス測定などの他の既存のアプローチよりも優れている主な利点は、この手法を使用すると、再構成されたトランスポーターの主要なパラメーター(ユニタリー回転率や複合体の形状など)を定量的に決定できることです。

この方法は、これらの主要なパラメータの定量的測定を提供するだけでなく、突然変異小分子の影響を迅速かつ正確に決定し、再構成された転写タンパク質のサブユニットをモニターするために使用できます。記録セットアップは、塩化物電極、アナログまたはデジタル電気出力を備えたpHメーター、デジタイザ、および適切な取得ソフトウェアを備えたコンピューターの2つのチャンバーで構成されています。塩化物電極をpHメーターに接続し、次にpHメーターの出力をコンピューターに接続されているデジタイザーに接続します。

参照電極を一方のチャンバーに、再コーディングワイヤーをもう一方のチャンバーに配置します。次に、攪拌子を記録チャンバーに攪拌器で攪拌板の上に置きます。攪拌子が電極に触れないようにしてください。

実験の前夜に寒天ブリッジを使用してチャンバーを接続し、15ミリリットルの外部緩衝液に1グラムのcidex G 50ビーズを膨らませ、使用前に室温で少なくとも3時間穏やかに振とうします。各実験には、リポソームが室温で解凍されている間に、約3ミリリットルの膨潤したビーズが必要です。膨潤したG50ビーズの約3ミリリットルを各カラムに注ぎます。

重力で乾かします。室温で流します。これには通常1〜2分かかります。

次に、0.4ミクロンのテフロンカットオフを使用して、プロテアリポソームをミニ押出機で11回押し出して、ウラル小胞を調製します。次に、臨床用遠心分離機で 1400 G のプラスチック製丸底チューブ遠心分離機にカラムを 20 〜 30 秒間入れ、余分な溶液を除去します。この後、流れを保護しながら、カラムを13 x 100 mmのガラス管に置き、100マイクロリットルの押し出しベシクルをカラムに加えます。

臨床用遠心分離機 G.In 500マイクロリットルでカラムを1分間回転させ、記録チャンバーに加えられる流れを約200マイクロリットル集めます。排出測定を行うには、基準チャンバーに100ミリリットルの塩化カリウムを2ミリリットル、記録チャンバーに1.8ミリリットルの外部バッファーを置きます。アクイジションプログラムを開始します。

ベースラインを平衡化させます。これには数分かかる場合があります。信号が安定したベースラインに達したら、録音を開始します。

15マイクロリットルの黄褐モル塩化カリウム溶液を追加して、システムを校正します。次に、リポソームを追加します。プロテアリポソームからの外部塩化物の不完全な除去により、小さなジャンプが見られる場合があります。

ベースラインが安定するまで待ちます。次に、FLX を開始するために CIN を追加します。FLXが頭打ちになるまで、その時間経過を続けます。

この時点で、外部バッファーに調製した40マイクロリットルの1.5モルベータOctaグルコサイドを追加して、すべてのリポソームを溶解します。その後、10〜15秒待ちます。記録を終了し、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析に進みます。

内部塩化物を多く含むリポソームを低塩化物に浸漬し、300倍の塩化物勾配を生成すると、正味のイオンフラックスは観察されません。これは、タンパク質を含まないリポソームはイオンに対する固有の透過性が低いためです。プロトン共役塩化物トランスポーターC-L-C-E-Cで再構成されたプロトリポソームから巨視的なFLXは観察されません。

ベスコから出る少量の塩化物がリポソームに正味の正電荷を蓄積するため、CINの添加によりカリウムイオンが膜を横切って移動し、電位を緩和して塩化物flxを開始します。反応を終了し、小胞に含まれる塩化物イオンの総量を測定して、再構成された単一のタンパク質の特性を決定します。排出時間経過の生データをまずミリボルトから塩化物濃度に変換し、次に時間経過を正規化して適合させます。

流出の時定数は41秒であり、C-L-C-E-C oneの活性コピーがゼロのリポソームの割合は点31であると決定され、これらの値からリポソームの約3分の1が活性タンパク質をゼロ含んでいることを示し、C-L-C-E-C oneの少なくとも1つのコピーを含む小胞の塩化物含有量を測定し、 C-L-C-E-Cの単一輸送速度を、毎秒約2, 500塩化物イオンに等しいと決定することが可能です。このビデオを見た後、トランスポーターのターンオーバーの必要性を判断する方法をよく理解しているはずです。これらの実験は、慎重に行えば10分から15分で行うことができます。

リポソームの品質を慎重に評価することは、漏れが離職率の推定に悪影響を与えるため、慎重に評価することが重要です。