Name: 個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学ぶPCR法による個々のハエからの食中毒細菌性病原体検出手法。Cronobacter、Salmonella、Listeriaを迅速に検出し、環境サンプリングと食中毒発生調査に貢献する。

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原稿を批判的に査読してくださった米国食品医薬品局(FDA)、食品安全応用栄養センター（CFSAN)のBen D. Tall氏、Yi Chen氏、Thomas Hammak氏に感謝します。また、著者らは、研究室の支援を提供してくださったHannah Lee氏(研究インターンシッププログラム、Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition(JIFSAN)、メリーランド大学)と、ビデオで示されている概略図の図を準備してくださったDavid Weingaertner氏(FDA、CFSAN)にも感謝しています。

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特定の機器の使用は、米国食品医薬品局による承認ではありません。著者は、この記事で説明されている資料に関して、いかなる金融機関とも利益相反がないことを証明します。

野生の昆虫から食品由来の病原体を検出した以前の研究では、正確に食品や食品関連環境13,15内の単一のハエの存在の食品関連リスクを評価するために必要な情報が含まれない場合がありますプロトコルの多種多様を使用していた23,24。ここでは、この標準化されたプロトコルを使用して、それを検出し、 クロノバクター属種を単離することが可能であることを実証した。、S.エンテリカ、及びL.体表面と野生に巻き込まシングルハエの消化管からリステリア 。昆虫が標的食品媒介病原体の数が少ないと他の土着微生物25,26の高い番号を搬送することができるので、このプロトコルは、ターゲット食品媒介病原体の検出の感度を高めるために特定の培養培地中のサンプルの一次（時には二次）の濃縮を必要とする。 PCRベースの検出システムからの結果がDETEために（約30時間以内に得られた。クロノバクター属属の ction。とS.エンテリカ ）と、当初のサンプルを処理した後（） リステリア菌の検出のために48時間。したがって、このプロトコルは、信頼性、ならびに迅速および食品媒介病原体の存在のための単一のハエをスクリーニングするのに十分な感度である。 生菌のPCR陽性結果の確認および単離は、多くの研究室の標準操作手順の一部である。また、疫学のために、PCR陽性試料からの純粋な細菌培養物をさらに確認し、生化学的、免疫学的、または遺伝的方法を使用して、食品媒介病原体の血清型が要求される。 S.を検出する際に偽陽性は観察されなかったもののエンテリカとL.シングル野生捕獲ハエの体の部分からリステリアは 、このプロトコルを使用して、我々はクロノバクター属属のための偽陽性の50％の税率にまで見つけた。このことは、属CronobactためのPCRベースの検出システムERハエによって運ばれる非常に複雑な細菌叢の中に存在する他の腸内細菌と交差反応することができる。このように、PCR陽性検体から属クロノバクター属の純粋なコロニーの単離および精製は、評価した他の病原体よりも選択メッキを必要とする。 このプロトコルは、主にクロノバクター属種の存在について、個々の野生捕獲ハエをスクリーニングするために標準化されている。、S.エンテリカ、及びL.商業的PCRベースの検出システムを使用してリステリア 。しかし、このプロトコルはまた、容易にそのような腸管出血性大腸菌 O157などの他の食品媒介病原体の存在のために、単一のハエのスクリーン本体部分に適合させた：H7（いずれかの大腸菌 O157を使用して：H7 MP標準アッセイキット又はE.コリ O157：H7リアルタイムアッセイキット）と志賀毒素原性E.非公開大腸菌 （STEC）グループ（リアルタイムSTECスイートを使用）、取得感度&gt; 80％（編データ）。また、このプロトコルは、潜在的疾患（ゴキブリ、アリ）のベクターが知られている他の昆虫からの食品媒介病原体を検出するように構成することができるが、この分野におけるさらなる研究が必要である。 食中毒アウトブレイクの調査は非常に動的であり、特定の状況及び12,27を検討されてローカル環境によって異なる場合があり、多段階のプロセスを含む。それらは将来の病気を予防することによって直ちに公衆衛生の保護を提供するため、これらの研究は重要である。さらに、これらの調査は、食品媒介微生物が広がっていることによって、新しい機構を解明し、研究28のための新しい分野につながる重要な問題を提起することができます。捜査技術ならびに標準化された迅速、かつ高感度なプロトコルは、個々の昆虫からの食品媒介病原体を検出するために必要である。この標準化されたプロトコルは、ワット、無菌的にハエのような虫を収集する機会を開くHICHは環境サンプリングプログラムの一環として、食品媒介病原菌をベクトルできます。このことから得ることができる疫学的情報は昆虫による食品媒介病原体の伝達のメカニズムの正確な状況を作成するのに使うであろう（ すなわち、露光時間の長さ：、着陸ハエ対着陸排便、と吐き戻すことによってフライ）。 決して唯一の適切なシステムを意味することで、最終的に、ここで説明する商業PCRベースの検出システムで使用することは実用的であり、PCR増幅および属レベルのアンプリコンの可視化を簡素化にもかかわらず、それはない。濃縮されたサンプルからの溶解物は、あるいは公的に入手可能な種特異的プライマー対を使用して、食品媒介病原体の存在をスクリーニングするために使用することができる。しかし、検出感度は、それらの使用の前に実証されるべきである。

それらは食品又は食品接触面と器具1に病原体を広げることができるので、昆虫、食品関連疾患の伝達に重要な役割を果たしている。昆虫、ハエ、ゴキブリ、アリ食品媒介病原体の拡散を好む展示行動の中で。これらの動作は、減衰の問題との関連を含んで拒否し、糞、endophily（建物に入る）、およびsynanthropy（人間と同居）2。そのようなサルモネラなどの食中毒の病原体、 リステリア菌 、 カンピロバクター 、 大腸菌 O157：H7、および属クロノバクター属 （以前はエンテロバクター·サカザキ ）のメンバーは、昆虫3-5によって送信されることが報告されている。 Synanthropic汚物は、汚染された身体の表面から病原体を転送することによって機械的に普及食中毒菌を飛ぶ。しかし、ハエの消化管における食品媒介病原体の存在は、3回までとすることができる自分の体の表面（ボディ、頭、脚、翼）5で観察されるものよりも大きい。食品媒介病原体は、体表面6,7に比べて時間の大きい長さのためのハエの消化管にとどまることができるといくつかの例では、それらが増殖することができます、ハエの消化管4,8,9に定着。彼らはさらに排便と逆流10,11を通じて食品媒介病原体を広げることができるので、これはハエのベクトルポテンシャルを向上させます。 今日では、より迅速に食中毒の発生を検出することができる改良された監視システムがある。食品媒介アウトブレイク調査を行っている間、公衆衛生当局は感染源（S）または車両であってもよい食品（S）を探してください。研究者らは、食品が汚染されていた方法を見つけるために関係する施設（または施設）の環境アセスメントを実施することができると調査12の一部としてのサンプルを収集することがあります。 Desp科学文献、食品媒介病原体のキャリアとしての昆虫に関する特定の食中毒の発生が挑戦している原因となる病原体のベクトルとして昆虫をリンクするの膨大な量をITE。昆虫は無菌的に食品媒介アウトブレイク調査時の環境サンプリングプログラムの一環として収集されていないので、これは主にです。昆虫、環境サンプリング手順は、単一の昆虫が所定の位置にする必要があるから、食品媒介病原体を検出するために、標準化された迅速、高感度かつ信頼性のあるプロトコルの一部として、食品媒介病原体の拡散を有利挙動を示すこと、特にそれらを含めます。 昆虫からの食品媒介病原体の検出のための従来のメッキ技術は面倒であり、昆虫の生得的な共生微生物の急速な成長を克服するために別の培養培地中の標的細菌の競争力の成長に依存。 BAに昆虫を関連付けた研究のほとんどcterial病原体は、一緒に、いくつかの昆虫をプールではなくごと個別に病原体の存在を同定することにより方法の感度が増加している。したがって、これらの研究は、病原体が13-18発見された昆虫の体の部分を区別しませんでした。これは、疫学的な意味を有していてもよいし、異なる緩和戦略につながる可能性がある食品媒介病原体を体表面に、または個々の昆虫の消化管に位置しているかどうかを同定する能力が重要である。機械的なベクターとしては、逆流および食品に排便ものハエは感染の潜在的に高いレベルで病原体を伝達する確率を増加させるのに対し、短時間食品土地のみ、自分の体の表面から細菌の低レベルを移すことが飛ぶ。したがって、個々の昆虫あたり食品媒介病原体の有病率を推定し、その昆虫、細菌のpの身体部分を区別することが重要である<html> athogenが位置しています。 食品媒介病原体を検出するために培養非依存的方法の使用がますます実施されているにもかかわらず、それらは商業的に単一の昆虫からの食品媒介病原体を検出するために使用されていない。現在、業界や規制当局によって使用されている食品からの食品媒介病原体の迅速な検出のために市販されている検証済みの分子のプロトコルがあります。これらの方法は、食品サンプルの様々な病原体の検出のためのDNAベースのシステムを含む。分子のプロトコルは、従来のメッキ法よりも高速であるが、試料の濃縮は、依然として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に必要な細菌性病原体の10 2コロニー形成単位（CFU）に基づく方法19の感度レベルを得るために必要とされる。また、PCR陽性試料からの純粋な細菌コロニーの単離は、適切な方法を使用して病原体を確認するために必要とされる。 コンテンツ &quot;&gt;このプロトコルの目的は、体表面からの食中毒菌の検出および単ハエの消化管のための食品及び環境試料から病原体を検出し、さらにそれらを単離するために使用される市販のPCRベースのシステムを標準化することであるプロトコルのsamples.The感度からの病原体は、ここで説明した第1の実験的に各細菌性病原体の連続希釈を与えた実験室で飼育大人のイエバエ（ イエバエ ）で較正した。標準化されたプロトコルは、その後100野生捕獲を調査するために使用された自分の体の表面および/または消化管からの食品媒介病原体の存在のために飛ぶ。これは標準化されたプロトコルは、公衆衛生研究所の食品媒介を行う際に環境サンプリングプログラムの一部としてそれらを収集する可能性を考慮して、昆虫によってもたらされる健康上の脅威を検出することを可能にするアウトブレイク調査。

<table><tbody><tr><td>亜硫酸ビスマス(BS)寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>R452402</td><td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>脳心点滴(BHI)ブロス</td><td>ベクトン、ディクソンアンド</td><td>カンパニー299070</td> <td>* 37°Cに予熱。</td></tr><tr><td>ブリリアンスリステリア寒天(BLA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CM1080B</td><td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>緩衝ペプトン水(BPW)</td><td>ベクトン、ディクソンアンドカンパニー</td><td>212367</td><td>* 37°Cに予熱;Cまたは42°C.複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1055B</td><td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>chromID 坂崎寒天</td>培地 <td>bioM&eacute;rieux</td><td>43741</td> <td>*情報の呼び出し:800.682.2666</td></tr><tr><td>R&F エンテロバクター サカザキ (クロノバクター) 発色性めっき ミディアム</td><td>R &Fラボラトリ</td>ーズ<td>各種</td><td>*情報募集:+1.630.969.530</td></tr><tr><td>R&F エンテロバクター サカザキイ エンリッチメントブロス&サプリメント</td><td>R&F Laboratories</td><td>Various</td><td>*情報の募集:+1.630.969.530</td></tr><tr><td>Hektoen腸溶性(HE)寒天</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>OXCM0419B</td><td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>24 リステリア菌濃縮ブロス(24LEB)</td><td>Oxoid</td><td>CM1107</td><td>*室温で調製したて。複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>リステリア菌選択的濃縮サプリメント</td><td>Oxoid</td><td>SR0243</td> <td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>ノボビオシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>OXSR0181E</td> <td>*複数のサプライヤー。2-8°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>バンコマイシン塩酸塩水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861987</td><td>2-8 °で保存。C</td></tr><tr><td>セフスロジンナトリウム塩水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C8145</td><td>2-8 °で保存。C</td></tr><tr><td>Rappaport-Vassiliadis(RV)ミディアム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CM0669B</td><td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>テトラチオネート(TT)ブロス</td><td>ベクトン、ディクソンアンド</td><td>カンパニー249120</td> <td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>トリプチカーゼ大豆寒天(TSA)</td><td>ベクトン、ディクソンアンド</td><td>カンパニー236930</td> <td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>キシロースリジンデオキシコール酸(XLD)寒天</td>ベ<td>クトン、ディクソンアンドカンパニー</td><td>221284</td> <td>*複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>API生化学的同定システム</td><td>bioM&eacute;rieux</td><td>Various</td><td>*情報の呼び出し:+1.800.682.2666</td></tr><tr><td>VITEK 2:製品の安全性</td><td>bioM&eacute;rieux</td><td>Various</td><td>*Call for information: +1.800.682.2667</td></tr><tr><td>BAX System Q7</td><td>DuPont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAX E. sakazakii 標準アッセイキット</td><td>DuPont</td><td>D11801836</td><td></td></tr><tr><td>BAX L. monocytogenes 24E assay kit</td><td>DuPont</td><td>D13608125</td><td></td></tr><tr><td>BAX Salmonella 2 Standard assay kit</td><td>DuPont</td><td>D14368501</td><td></td></tr><tr><td>Capping tool</td><td>DuPont</td><td></td><td></td>D11677028</tr><tr><td>デキャッピングツール</td><td>デュポン</td><td>D11134095</td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブラック/ホルダー</td><td>デュポン</td><td>D12701663</td><td></td></tr><tr><td>フェザー級鉗子、ワイドチップ</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>使用前に滅菌してください。複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>細い先端のストレートチップ鉗子</td><td>BioQuip</td><td>4731</td><td>使用前に滅菌してください。複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ、0.5 mm</td><td>Bio Spec Products、Inc.</td><td>11079105z</td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>ペトリ皿 - 60X15mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772B</td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>使い捨て接種ループ、10&micro;L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-606</td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>L字型細胞散布機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-665-230</td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、2 ml</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>各種</td><td>必要に応じて使用前に滅菌してください。しっかりとした蓋が望ましいです。複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>クラスターチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>05-500-13</td><td></td></tr><tr><td>クラスターチューブキャップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-500-23</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム(液体塩素系漂白剤)</td><td></td><td></td><td>※水で0.05%に希釈してください。複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>滅菌脱イオン水</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>エチルアルコール190プルーフ</td><td></td><td></td><td>*必要に応じて水で70%に希釈してください。複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>Genie細胞破壊器、120V - 1.5mlおよび2.0mlマイクロチューブ用Scientific</td><td>Industries, Inc.</td><td>SI-D238</td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>冷却ブロック</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>再循環ウォーターバス</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td>機<td>複数のサプライヤー。</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー。</td></tr></tbody></table>

個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

昆虫が食品媒介病原体の重要な媒介者であるという一致したコンセンサスがあります。しかし、特定の食中毒の発生を引き起こす病原体の媒介者として昆虫を関連付けることは困難でした。これは、食品媒介性アウトブレイク調査中の環境サンプリングプログラムの一環として昆虫が無菌的に収集されていないこと、および個々の昆虫から食品媒介細菌を検出するための標準化された方法がないためです。この問題を解決するための一歩を踏み出すために、食品および環境サンプルから食品媒介病原体を検出する市販のPCRベースのシステムのプロトコルを適応させて、個々のハエから食品媒介病原体を検出しました。この標準化されたプロトコルを使用して、100匹の野生捕獲バエにCronobacter spp.、Salmonella enterica、およびListeria monocytogenesの存在を調査し、これらの病原体を1匹のハエの体表と消化管からさらに分離することが可能であることを実証しました。採取された野生のハエの消化管の22%と体表の8%が、3つの食品媒介病原体のうち少なくとも1つに陽性でした。ハエのどちらの体部分にもクロノバクター属菌の有病率は、S.エンテリカ(7%)およびL.monocytogenes(4%)の有病率よりも統計的に高かった(19%)。このPCRベースのシステムを使用してS.entericaおよびL.monocytogenesを検出した場合、すべてのPCR陽性結果から純粋な細菌培養物が得られたため、偽陽性は観察されませんでした。しかし、純粋なクロノバクターコロニーは、PCR陽性サンプルの約50%からは得られず、この病原体のPCRベースの検出システムが、野生のハエが運ぶ非常に複雑な微生物叢の中に存在する他の腸内細菌科と交差反応することを示唆しています。ここで紹介する標準化されたプロトコルにより、研究所は無菌的に収集された昆虫から細菌性食品媒介病原体を検出できるため、公衆衛生当局は、食品媒介アウトブレイク調査を実施する際に食品がどのように汚染されたかを調べるための別の証拠を得ることができます。

C.の- （10 8 CFU / mlの10 2）このプロトコルは、最初に実験的に連続希釈を含む液体フライ食品（2％の粉末ミルク）で24時間飼育した実験室で飼育イエバエのセットに校正したサカザキ、S.エンテリカ、L.リステリア 、またはC.ジェジュニ （N = 21、各細菌性病原体のために）。 PCRベースのシステムは、身体の表面および実験供給する単一の消化管からの細菌の最低レベル（10 2 CFU / ml）を検出することになるまで濃縮媒体、ならびにインキュベーションの時間および温度は、それぞれの食品媒介病原体のために調整した飛ぶ。プロトコルセクションに記載の濃縮培地および条件を用いて、PCRベースのシステムはCを検出サカザキ、S.エンテリカ 、及びL.細菌の接種材料&gt; 10 3 CFU / mlである（ 図1A）が供給されるハエの100パーセントの体表面からリステリア 。ハエは、10を与えたとき2 CFU / mlで、Cの検出の割合サカザキ、S.エンテリカ 、及びL.彼らの体表面からのリステリアは、それぞれ100％、66％、33％、（ 図1A）であった。 PCRベースのシステムは、また、割合≥33％（ 図1B）でのすべての細菌の濃度を与えたハエの消化管からこれら3食品媒介病原体を検出した。しかし、Cの検出実験室で飼育ハエが実験最高細菌接種（10 8 CFU / ml）を含む液体食品を与えたときジェジュニにのみ達成された。したがって、C.ジェジュニは 、このPCRベースの検出システムを使用して、個々のハエsynanthropic汚物から試験することができる食品媒介病原体の群から除外した。 この標準化されたプロトコルでは、我々はクロノバクター属属の有病率を決定することができました。、S.エンテリカ、及びL.体表面および/ ​​または目のリステリア個別に無菌的ワシントン首都圏に位置して10都市のレストランの収集のエリアから摘発された100野生のハエのE消化管、DC 5収集された汚物のハエはM.を含む少なくとも6種の代表だったイエバエ （47％）、 ルシリアヒツジキンバエ（33％）、L.セリカータ（14％）、Cochliomyiaのmacellaria（2％）、ニクバエhaemorrhoidalis（2％）、及びOphyraのleucostoma（1％）。 Oneフライのみファミリーレベルに同定された（ハナバエ科; 1％）。表面消毒プロトコルは、細菌の増殖は、各個々のハエの最後の消毒すすぎ水のためのTSAプレート上で観察されなかったので、フライの身体部分との間の交差汚染を回避することに有効であった。このように、区別は、各ハエの体の部分に存在する食品媒介細菌の間で行うことができた。 偽陽性は、体表面のサンプルおよび消化管からは検出されなかった個々のハエS.の検出のためにこの市販のPCRベースのシステムを使用してエンテリカとL.リステリア 、寒天プレート上の生存可能な病原体の確認は、PCR陽性の結果と一致した。しかし、 クロノバクター属種の純粋培養物を単離することは不可能であった。全てのPCR陽性検体から。 PCRベースによるこの病原体のため、検出 （; 9/18 50％）及び消化管（48％; 33分の16）は、単一の野生捕獲ハエのシステムは、体表面からの偽陽性を示した。特定のメディア上にプレートしたランダムに選択されたPCR陰性サンプルは、食品媒介病原体が存在しないことを確認した。 クロノバクター属種を検出するために、この市販のPCRベースのシステムを使用する場合したがって、偽陰性サンプルのいずれからも検出されなかった。、S.エンテリカ 、またはL.リステリア 。 唯一の病原体が単離され、確認されたそれらのPCR陽性検体は陽性とみなしたと統計分析のために含まれています。野生捕獲汚物ハエの消化管における食品媒介病原体の全体的な存在は（DF = 1、P = 0.0087、χ2 = 6.8772）、体表面上よりも有意に高かった。消化管の22％、回収野生ハエの体表面の8％の三食品媒介病原体（ 図2）の少なくとも1つについて陽性であった。全体的に、 クロノバクター属種の有病率。 S.の有病率よりも、体表面または収集されたハエの消化管のいずれかで（フィッシャーの正確確率検定p = 0.0165 19％）、統計的に高かったエンテリカ （7％）とリステリア菌 （4％）。各細菌性病原体（ 図3のためのハエの体の部分の間の一対比較を行うときしかし、統計的な差異は観察されなかった。 クロノバクター属のためのフィッシャーの正確検定p = 0.1464、P = 0.1184およびp = 0.6212属、S.エンテリカ 、及びL.モノサイトゲネス 、それぞれ）。ハエのいずれも、評価され、3つすべての病原体について陽性であったなかった。しかし、ハエ（2 L.のヒツジキンバエと1 のL.セリカータ ）を搭載してサルモネラ属菌の3。とL.表面上または消化管におけるリステリア 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52372/52372fig1.jpg" /> （A）は、本体表面と（B）の異なる細菌接種材料を含有する液体飼料を与えた個々の実験室飼育イエバエの消化管からクロノバクター属のサカザキ 、 サルモネラ菌、リステリア菌、およびカンピロバクター·ジェジュニの図1.検出レベル （N =各細菌性病原体のための21、N =各細菌濃度あたり3）。 <img alt="図2"SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52372 / 52372fig2.jpg&quot; /&gt; ボディ表面および個々のハエの消化管の図2.パーセンテージは、ターゲット食品媒介病原体のいずれかのための肯定的な発見した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52372/52372fig3.jpg" /> クロノバクター属属の図3.有病率。、 サルモネラ菌、体表面からのリステリア菌とsynanthropic野生捕獲ハエの消化管。報告されたp値は、体表面と各細菌病原体のために消化管間の対比較からのものである（フィッシャーの正確確率検定、p値 &lt;0.05は、統計的有意性を示す）。著作権©アメリカ微生物学会、応用のジャーナルと環境微生物学78（22）：7891から902、2012、DOI：10.1128 / AEM.02195-12。

PCRベースのプロトコルは、個々の野生捕獲されたハエの体表と消化管からCronobacter spp.、Salmonella enterica、およびListeria monocytogenesを検出するために適応されました。このプロトコルの目標は、食品媒介性アウトブレイク調査中に環境サンプリングプログラムの一部として収集された個々の昆虫から細菌性病原体を検出し、分離することです。

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

本手順の全体的な目的は、市販のPCRベースの検出システムを用いて、個々のハエの体表および消化管における細菌性食中毒病原体の存在をスクリーニングすることである。まず、レストランのゴミ収集エリアから野生のハエを採集することでこれを達成する。個々のハエを栄養ブイヨンに浸し、体表から微生物叢を回収する。次に、根管を抽出し、栄養ブイヨンを含む別のチューブに入れて破砕し、組織内から細菌を遊離させます。次のステップでは、細菌を増殖させるために、サンプルを病原体特異的な濃縮ブイヨンに移します。これにより、細菌の濃度をアッセイの検出限界以上に高めます。その後、濃縮したサンプルを溶解し、標的病原体をPCR法で検出するためのPCR用既製タブレットが入ったPCRチューブに添加します。最終ステップは、増菌ブイヨンを選択・鑑別培地に塗抹し、PCR陽性サンプルから純粋な細菌コロニーを分離することです。最終的に、PCRベースの検出と純粋コロニーの分離を組み合わせることで、野生採取した個々のショウジョウバエの消化管および体表面におけるkob backer、salmonella、およびlisteria monocytogenesの保有率を評価します。本手法の従来の塗抹法などの既存手法に対する主な利点は、迅速かつ信頼性が高く、単一のハエの体表面および消化管における細菌性病原体の有無をスクリーニングするのに十分な感度を備えている点にあります。この手法は、昆虫による伝播メカニズムや病原体の汚染源など、食中毒発生の調査における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の応用範囲は、食品や環境サンプルからの食中毒病原体の診断にとどまらず、ハエなどの個々の昆虫からそれらの細菌性病原体を検出することまで広がっています。まず、無菌的に採取したハエを-20 °Cのフリーザーに5〜7分間入れ、不動化させます。次に、1匹のハエを、1 mLの予め加温した緩衝ペプトン水（BPW）を含む滅菌済みの2 mLチューブに入れます。滅菌済みピンセットを用いて、チューブの内容物を2分間緩やかに転倒混和し、ハエの全身が培地に接触するようにします。これにより、ハエの表面に存在する微生物相がBPWに転移します。次に、滅菌済みピンセットを用いて、ハエを新しい2 mLチューブに移します。ハエを70% ethanolに浸し、1分間静かに混ぜて消毒した後、ethanolを除去します。ハエを滅菌蒸留水で洗浄し、洗浄後、調製したばかりの0.05% bleach溶液をチューブに加えます。1分間そっと混ぜた後、漂白剤を除去します。滅菌蒸留水でハエを3回すすぎ、滅菌を確認します。最後のすすぎに使用した水を滅菌済みの2 mLチューブに移し、テキストプロトコルに記載されている手順に従って、細菌汚染の有無を検査します。次に、余分な水分を取り除くため、ハエをオートクレーブ済みのペーパータオルの上に置きます。乾燥後、ハエを滅菌済みの60 mm使い捨てペトリ皿に移し、解剖顕微鏡の下に置きます。滅菌済みの細先ピンセットを使用して、肛門と全消化管をハエから慎重に引き出します。次に、無菌的に操作を行います。根管組織を、あらかじめ加温したBPW 1 mLと0.5 mmのジルコニア・シリカビーズを含む別の2 mLチューブに移します。セルディスラプターを用いて、根管組織を含むチューブを5〜10分間混合し、組織内から細菌を遊離させます。ハエの残りを、-20°Cで長期保存するための95%エタノールを含む清潔な2mLチューブに入れる。一次細菌濃縮のため、体表または消化管由来の微生物を含むBPWを3本の2mLチューブに分注する。適切な予熱培地を用い、サルモネラおよびkob backerの二次濃縮に必要な各病原体の指定温度および時間でチューブを培養する。濃縮培養液100µLを、400µLの予熱ブレインハートインフュージョンブロスを含む滅菌クラスターチューブに移す。チューブをヒーティングブロックに入れ、37 °Cで3時間インキュベートします。細胞溶解の準備として、キット付属のプロテアーゼ150 µLを12 mLの溶解バッファーボトルに加えて混合します。この溶解試薬を、ラベル付けした各クラスターチューブに200 µLずつ移します。次に、陰性対照用にロングピペットチップを用いて、二次濃縮サンプル20 µLを対応するクラスターチューブに移します。陽性対照として、滅菌培地を20 µL加えます。既知のsalmonellaまたはkob backer株の一夜培養した細菌培養液を20 µL加えます。すべてのサンプルを添加した後、キャッピングツールを用いてクラスターチューブのキャップをしっかりと閉めます。次に、クラスターチューブのラックを自動加熱ブロックにセットして細胞を溶解させ、標的病原体専用のプログラムを実行してPCRベースの検出を開始します。まず、PCRチューブラックを冷却ブロックで冷やします。次に、標的となる食中毒病原体用のPCRレディタブレットが入った対応するPCRチューブをホルダーにセットします。デキャッピングツールを使用してPCRチューブのキャップを慎重に取り外し、廃棄します。各チューブにタブレットが入っていることを確認してください。その後、50 µLのライセートを適切なPCRチューブに移します。キャッピングツールを使用して、PCRチューブに新しい光学キャップをしっかりと取り付けます。反応系の組み立て後、PCRチューブをPCRサイクラー検出システムにセットします。その後、メーカーのプロトコルに従ってプログラムを実行し、結果を確認します。純粋な細菌コロニーを分離するために、PCR陽性であった検体の一次増菌チューブを選択します。サルモネラの検出では、増菌培養液 100 µL を 10 mL の Rappaport vasilis 培地および 1 mL の tetra anate broth に添加します。チューブを 42.5 °C で 22〜24 時間培養した後、3 mm ループ一杯の各培地を、bismuth sulfite agar、XLD agar、hector agar、および enteric agar に画線培養します。次に、プレートを35 °Cのインキュベーターにセットします。22〜24時間培養した後、各培地のストリーク上に典型的なサルモネラコロニーがないかプレートを確認し、選択培地上の陽性コロニーをストリークして、単一コロニーを分離します。培養後。KOBバッカーストリークについて、API 20 Eテストのような市販の生化学的試験を用いて、推定されるサルモネラの同定を確認するために単一の純粋コロニーを使用します。RNF enterobacter Sakaki eyeクロモジェニックプレート培地などのクロモジェニック培地2枚に、一次増菌管からループいっぱいの量（loop full）を接種します。プレートを35 °Cで22～24時間培養し、listeria monocytogenesストリークについて、青色、黒色、または青灰色のコロニーがないか確認します。濃縮チューブから、Brilliance Listeriaアガーの2枚のプレートにループ一杯分を接種します。プレートを35 °Cで22〜26時間培養し、青緑色のコロニーがあるか確認してください。この標準化プロトコルは、都市部のレストラン10軒のゴミ捨て場付近で捕獲した野生のハエ100匹を用いて検証されました。ここでは、標的病原体が陽性と判定されたハエの割合を示しています。評価した3種類の食中毒病原体のうち、少なくとも1種類について、消化管（elementary canals）の22%および体表の8%が陽性でした。ハエの消化管内における食中毒菌の全体的な存在量は、体表面よりも有意に高い結果となりました。ハエの体表面および消化管におけるkob backer種の陽性率は、salmonella、tarica、およびlisteria monocytogenesの陽性率よりも統計的に高い値を示しました。しかし、各細菌病原体の発生後の体表面と消化管の間でペア比較を行ったところ、統計的な有意差は認められませんでした。本手法は、食中毒アウトブレイク調査に従事する他の専門家が、個々のハエについて細菌性病原体の有無をスクリーニングし、食中毒微生物が拡散するメカニズムに関するさらなる情報を収集することを可能にしました。本手順を実施する際は、PCR陽性結果の確認が多くの研究室における標準作業手順書（SOP）の一部であること、および規制上の目的から、本手順の後に確認のための培養分離を行うことが推奨される点に留意することが重要です。また、ハエが保有する食中毒細菌病原体の菌株など、追加的な疑問を解決するために、yp、DNAフィンガープリント法、または全ゲノム解析などの他の手法を用いることができます。

detection-of-foodborne-bacterial-pathogens-from-individual-filth-flies

Research

JoVE Journal

Environment

環境

出典:Dodge、R.、et al.ショウジョウバエマイクロバイオームに適用した96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニット計数J. Vis. 経験。(2023年)このビデオは、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエにおける腸内関連細菌のコロニー形成単位の定量化

出典: Siva-Jothy, J. A. ほか ショ ウジョウバエメラノガスターにおける口腔細菌感染と脱皮。 J. Vis. Exp.(2018年)このビデオは、病原性細菌による ショウジョウバエ...

病原性細菌による ショウジョウバエ の口腔感染

出典:Pava-Ripollら。個々の汚れたハエから食中毒の細菌病原体を検出。J. Vis.

濃縮されたハエサンプルからの食中毒病原体のPCR検出

このビデオは、病原菌を直接体腔内に導入することでショウジョウバエに感染させる技術を示しています。この方法は、上皮バリアやその他の受動的な防御メカニズムをバイパスし、全身感染の誘発を可能にします。感染すると、結果として生じる免疫応答は、ハエの死亡率を監視し、下流のアッセイを行うことによって評価されます。...

ハエに全身性細菌感染を導入するための敗血症性ピンプリック技術

このビデオの記事では、我々は大人のフルーツキイロショウジョウバエを飛んでの嗅覚に依存する食品の検索行動に空腹や満腹の効果を測定するための自動化されたアッセイを説明します。...

での採餌行動のためのシングル·フライアッセイショウジョウバエ

本研究の全体的な目標は、小売デリ設定で食中毒病原体リステリア菌の潜在的なクロス汚染メカニズムを実証することであった。この方法は、病原体汚染を追跡するために、異なる様々な環境に適用することができる。...

蛍光粉を使用した小売環境における微生物汚染を追跡する - 小売デリカ環境の例

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA...

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

このプロトコルでは、経口感染細菌性病原体とミバエショウジョウバエ melanogaster を公開し、次の腸感染症伝染性の細菌の小屋の数を測定するための方法について説明します。さらに口腔細菌感染飛ぶ生存に免疫の突然変異体の効果について述べる.

口腔の細菌感染とキイロショウジョウバエの開口

この方法は、96ウェルプレートフォーマットを使用してコロニー形成単位(CFU)をプレート化し、ハエホモジネートサンプル全体の ショウジョウバエ...

ショウジョウバエ微生物叢に適用された96ウェルプレートフォーマットでの高速コロニー形成ユニットカウント

野外での未熟なテフリチドショウジョウバエの検出を増やすことは、これらの破壊的な害虫の個体数を排除するためのタイムリーな努力を引き起こす可能性があります。晩齢幼虫の検出は、宿主果実を袋に入れてマッシュアップし、果肉を一連のふるいに通す方が、手作業で切断して目視検査を行うよりも速く正確です。...

果肉をふるいにかけて畑で未熟なテフリチドショウジョウバエを検出する

学ぶPCR法による個々のハエからの食中毒細菌性病原体検出手法。Cronobacter、Salmonella、Listeriaを迅速に検出し、環境サンプリングと食中毒発生調査に貢献する。

個々のフィルスのハエから食中毒細菌性病原体の検出

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